Method Article

طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا كهربائيا قابلا للتكرار في المختبر للتلاعب الجيني بسلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs) وهو فعال من حيث التكلفة وفعال وقابل للحياة. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة مباشرة للدراسة الجزيئية لمسارات إشارات القنفذ الأولية المعتمدة على السيليوم في خلايا GCP الأولية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيليوم الأولي هو عضية إشارات حرجة موجودة في كل خلية تقريبا تنقل محفزات إشارات القنفذ (Hh) من سطح الخلية. في سلائف الخلايا الحبيبية (GCP) ، يعمل السيليوم الأولي كمركز إشارات محوري ينظم تكاثر خلايا السلائف عن طريق تعديل مسار إشارات Hh. يتم تسهيل التحقيق في آلية إشارات Hh الأولية المعتمدة على السيليوم من خلال التلاعب الجيني في المختبر لمكونات المسار لتصور توطينها الديناميكي إلى السيليوم الأولي. ومع ذلك ، فإن نقل الجينات المحورة في الثقافات الأولية ل GCPs باستخدام طرق electroporation المعروفة حاليا مكلف بشكل عام وغالبا ما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وكفاءة النقل غير المرغوب فيها. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا وفعالا من حيث التكلفة وبسيطا يوضح كفاءة نقل عالية تبلغ ~ 80-90٪ وجدوى الخلية المثلى. هذه طريقة تعديل وراثي بسيطة وقابلة للتكرار وفعالة تنطبق على دراسة مسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم GCPs المخيخية على نطاق واسع لدراسة آلية مسار إشارات Hh في أنواع الخلايا السلفية العصبية بسبب وفرتها العالية وحساسيتها العالية لمسار إشارات Hh في الجسم الحي1,2,3,4. في GCPs ، يعمل السيليوم الأولي كمركز محوري لنقل إشارة Hh5 الذي ينظم تكاثر خلايا السلائف6,7,8. غالبا ما يكون التصور المختبري لمكونات إشارات Hh على السيليوم الأساسي أمرا صعبا بسبب انخفاض مستوياتها القاعدية الذاتية. وبالتالي ، فإن تعديل الجينا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات والبروتوكول الذي وافقت عليه وزارة الصحة في هونغ كونغ. تم الحصول على تراخيص التجارب على الحيوانات بعد قانون الحيوانات (مراقبة التجارب) (الفصل 340) من وزارة الصحة ، حكومة هونغ كونغ. تم تنفيذ العمل الحيواني وفقا لأخلاقيات سلامة الحيوان المعتمدة من قبل مكتب أبحاث HKBU ولجنة سلامة المختبرات. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد ما قبل التجربة

  1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحواجز
    1. وسط خال من المصل (SFM)
      1. لإعداد 50 مل من SFM ، أضف 500 ميكرولتر من 100x ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام Opti-MEM (انظر جدول المواد) ككاشف عالمي ، يمكن لمنهجية electroporation المقترحة هذه تحقيق كفاءة عالية باستمرار في الكهربية بنسبة ~ 80-90٪ (الشكل 1). تم تحديد كفاءة التفريغ الكهربائي لناقل Smo-EGFP في DIV 2 بعد الإلكتروبورات عن طريق القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية الخضراء في جميع خلايا GCP التي تعبر عن البروتين المربع المقترن -6 (Pax6). وبدت كفاءة التحليل الكهربائي للمجموعات المعالجة ب DMSO وSAG قابلة للمقارنة (الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما يرتبط نقل الجينات المحورة في ثقافة GCP الأولية عن طريق طريقة electroporation بانخفاض صلاحية الخلايا وضعف كفاءة النقل9,10. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتكرار أظهر كفاءة عالية وقابلية للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض أيضا طريقة مباشرة لدراسة مسار إشارات Hh الأساسي المعتمد على السيليوم في خلايا GCP الأولية.

غالبا ما تتطلب طرق التفريغ الكهربائي الشائعة الأخرى كواشف كهربائية مكلفة خاصة بنوع الخلية.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنا.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق HKBU التأسيسي ومنحة بدء التشغيل من المستوى 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009) ، ومجلس المنح البحثية - صندوق البحوث التعاونية (CRF-C2103-20GF) إلى C.H.H. Hor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>GCP Culture
B27 supplementLife Technologies LTDمصفاة خلوية 17504044
، 70 & micro ؛ مكورنينج352350
DNase I من البنكرياس البقريروش11284932001
إيرل s محلول الملح المتوازنGibco ، Life Technologies14155063
FBS ، مؤهلThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM< / sup>-I ، 100xGibco ، Life Technologies35050061بديل L-glutamine
L-cysteineSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277مصفوفة الغشاء القاعدي
NeurobasalGibco ، Life Technologies21103049
Papain ، تعليقشركة Worthington BiochemicalCorporation LS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1ناهض
ناعم < قوي > تلطيخ < / قوي>
مصل الأبقار الألبومينسيجما ألدريتشA7906
بارافورمالدهيدسيجما ألدريتشP6148
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100<
قوي>مزيج الأجسام المضادة الأولية< / قوي>
مضاد ل GFP-الماعز ABروكلاند600-101-215عامل التخفيف: 1: 1000
مضاد للفأر Arl13b أحادي النسيلة abNeuroMab75-287عامل التخفيف: 1: 1000
مضاد ل Pax6 أرنب متعدد النسيلة abCovancePRB-278Pعامل التخفيف: 1: 1000
<قوي > مزيج الأجسام المضادة الثانوية < / قوي>
Alexa Fluor 488 حمار مضاد للماعز IgGInvitrogenA-11055عامل التخفيف: 1: 1000
Alexa Fluor 555 الحمار المضاد للفأر IgGInvitrogenA-31570عامل التخفيف: 1: 1000
Alexa Fluor 647 الحمار المضاد للأرانب IgGInvitrogenA-31573عامل التخفيف: 1: 1000
DAPIThermo Scientific62247عامل التخفيف: 1: 1000
<قوي>التثقيب الكهربائي< / قوي>
CU 500 غرفة كوفيتNepageneCU500
كوفيت التثقيب الكهربائي EPA (فجوة 2 مم)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070وسط مصل مخفض للتعداء
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II في المختبر وفي الجسم الحيNepageneNEPA21الكهربائي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

Related Articles