يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تمايز قوي ل iPSCs البشرية إلى مجموعة نقية من الخلايا الشحمية لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية

4.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63311

⸱

فبراير 9, 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

في هذه المقالة

ملخص

يسمح البروتوكول بتوليد مجموعة من الخلايا الشحمية النقية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يستخدم حمض الريتينويك للتمييز بين الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا جذعية وسيطة (MSCs) تستخدم لإنتاج الخلايا الشحمية. بعد ذلك ، يتم استخدام نهج الفرز على أساس تلطيخ النيل الأحمر للحصول على الخلايا الشحمية النقية.

الملخص

سمحت التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بتوليد أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن طرق التمايز الحالية لها كفاءة منخفضة ولا تنتج مجموعة متجانسة من الخلايا الشحمية. هنا ، نتحايل على هذه المشكلة باستخدام طريقة قائمة على الريتينويك بالكامل لإنتاج الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ذات العائد العالي. من خلال تنظيم المسارات التي تحكم تكاثر الخلايا وبقائها والالتصاق ، تسمح استراتيجية التمايز الخاصة بنا بالتوليد الفعال للأجسام الجنينية (EBs) التي تتمايز إلى مجموعة نقية من MSCs متعددة القدرات. يوفر العدد الكبير من MSCs الناتجة عن هذه الطريقة مصدرا مثاليا لتوليد الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، لا يزال عدم تجانس العينة الناتج عن تمايز الخلايا الشحمية يمثل تحديا. لذلك ، استخدمنا طريقة تعتمد على أحمر النيل لتنقية الخلايا الشحمية الناضجة الحاملة للدهون باستخدام FACS. سمحت لنا استراتيجية الفرز هذه بإنشاء طريقة موثوقة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية باستخدام مجموعة من الخلايا الشحمية مع تقليل عدم تجانس العينة وتحسين وظائف الخلية.

المقدمة

تعمل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمورد انتقالي فعال لإنتاج خلايا من أصل الأديم المتوسط مثل الخلايا الشحمية والخلايا العظمية والخلايا الغضروفية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لنمذجة الاضطرابات الوراثية الخاصة بكل منها. ومع ذلك ، اعتمدت الأساليب السابقة على الحصول على هذه MSCs من الأنسجة البالغة 1 ، مما فرض التحدي المتمثل في الحصول عليها بأعداد كبيرة من المتبرعين ، والحد من إبقائها قابلة للحياة وظيفيا في ظروف الزراعة المختبرية دون المستوى الأمثل 1,2. أنتجت هذه العقبات طلبا كبيرا على وجود بروتوكول لتوليد MSCs في المختبر. يمكن استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) كمصدر قيم ل MSCs ، حيث تظهر خصائص MSC3،4،5. يمكن استخدام MSCs المشتقة من iPSCs كخيار علاجي في العديد من الأمراض. أيضا ، فإن قدرة MSCs المشتقة من iPSCs على توليد الخلايا الشحمية ، تجعلها نموذجا بشريا قيما في المختبر لدراسة تكوين الدهون البشرية والسمنة والاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية.

يمكن تصنيف بروتوكولات التمايز الحالية للخلايا الشحمية إلى مجموعتين ، إحداهما تتضمن تمايز الخلايا الشحمية باستخدام الكوكتيلات الكيميائية أو البروتينية التي تعطي عائدا ناتجا بنسبة 30٪ -60٪ 6،7،8،9 ، بينما تتضمن الأخرى التلاعب الجيني لتحريض قوي لعوامل النسخ الرئيسية التي تحكم تطور الخلايا الشحمية لإعطاء عائد 80٪ -90٪ 10 ، 11. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني لا يلخص العملية الطبيعية لتمايز الخلايا الشحمية ، وغالبا ما يخفي النماذج الدقيقة التي تصل أثناء تكوين الدهون ، مما يجعلها غير فعالة لأغراض نمذجة المرض12،13. لذلك ، نقدم طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من الخلايا الشحمية غير الناضجة عن طريق وضع علامات على الخلايا الشحمية الحاملة للدهون باستخدام أحمر النيل.

نقدم هنا بروتوكولا يتضمن الحضانة العابرة للأجسام الجنينية المشتقة من iPSCs (EBs) مع حمض الريتينويك المتحولة بالكامل لإنتاج عدد كبير من MSCs سريعة التكاثر ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتوليد الخلايا الشحمية14. نقدم أيضا طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من مجموعة التمايز غير المتجانسة عن طريق وضع علامات على قطرات الدهون الخاصة بها باستخدام صبغة محبة للدهون. أحمر النيل. وهذا من شأنه أن يسمح بتوليد مجموعة نقية من الخلايا الشحمية الناضجة مع وظائف محسنة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية بدقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث المؤسسي المناسبة وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية التابع لمؤسسة حمد الطبية (رقم 16260/16) ومعهد قطر لبحوث الطب الحيوي (رقم 2016-003). تم تحسين هذا العمل أيضا ل hESCs مثل H1 و H9. تم الحصول على عينات الدم من الأفراد الأصحاء بموافقة مستنيرة كاملة. يتم إنشاء iPSCs من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) للأفراد الأصحاء.

1. زراعة وصيانة iPSCs

  1. قم بإعداد الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إعادة تشكيل مصفوفة الطلاء بالضربة القاضية-DMEM بنسبة 1:80 وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإعداد وسائط استزراع iPSCs عن طريق إضافة 50 مل من وسائط مكملات الخلايا الجذعية 10x إلى 500 مل من الوسائط القاعدية للخلايا الجذعية ، جنبا إلى جنب مع 5 مل من 100x البنسلين والستربتومايسين (P / S) وتخزينها في 4 درجات مئوية على المدى القصير أو عند -20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل.
  3. قم بتبطين الألواح بمصفوفة طلاء -1 مل للوحة 6 آبار ، و 500 ميكرولتر للوحة 12 بئرا ، و 250 ميكرولتر للوحة 24 بئرا - واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  4. قم بإزالة حصة من وسائط الاستزراع iPSCs وقم بتسخينها مسبقا في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  5. قم بإذابة قارورة من iPSCs (ESCs أو iPSCs) في حمام مائي 37 درجة مئوية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 2-3 مل من وسائط الاستزراع.
  6. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 120 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT-23 درجة مئوية).
  7. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من وسائط الاستزراع الطازجة المكملة بمثبط 10 ميكرومتر ROCK (Y-27632). قم بطلاء الخلايا في بئر واحدة من صفيحة 6 آبار مطلية بالمصفوفة وضع اللوحة عند 37 درجة مئوية.
  8. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائط ثقافية جديدة.
  9. قم بتغيير الوسائط كل يوم حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪.
  10. عند الوصول إلى نقطة التقاء ، تمر الخلايا باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
    2. أضف كاشف تفكك iPSCs (انظر جدول المواد) -500 ميكرولتر لبئر صفيحة 6 آبار ، 250 ميكرولتر لبئر صفيحة 24 بئر - واحتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة كاشف التفكك واحتضان الخلايا الجافة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. اجمع الخلايا باستخدام وسائط الاستزراع - 1 مل لبئر صفيحة 6 آبار و 250 ميكرولتر لبئر صفيحة 24 بئرا - في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 120 × جم لمدة 4 دقائق.
    5. إعادة تعليق الخلايا في وسط الاستزراع -2 مل لبئر صفيحة 6 آبار و 500 ميكرولتر لبئر من 24 بئرا مكملة بمثبط ROCK 10 ميكرومتر ووضعها على ألواح مغلفة بمصفوفة جديدة عند التقاء 40٪.

2. تمايز iPSC إلى MSCs

  1. قم بإعداد وسائط تمايز MSC عن طريق إضافة 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ P / S إلى DMEM منخفض الجلوكوز + بيروفات وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. عند الوصول إلى التقاء 80٪ ، استخدم iPSCs لتشكيل الجسم الجنيني (EB) باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. اغسل الخلايا باستخدام DPBS واحتضانها بوسط التفكك / EDTA-500 ميكرولتر لبئر من صفيحة 6 آبار ، 250 ميكرولتر لبئر صفيحة 24 بئر.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، نضح كاشف التفكك والحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة إضافية. لبدء تمايز MSC ، ~ 10-12 × 106 خلايا مطلوبة.
    3. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام وسائط الثقافة. تأكد من أن تكون لطيفا جدا أثناء التجميع لمنع الخلايا من التفرد والسماح بتكوين EB. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 120 × ز لمدة 4 دقائق.
    4. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسائط تمايز MSC التي تحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
    5. امزج ووزع 0.5 مل / بئر في لوحة تثبيت منخفضة للغاية من 24 بئرا.
      ملاحظة: قد يشجع استخدام لوحة التثبيت المنخفضة للغاية على تجميع الخلايا في EBs بدلا من ارتباطها على السطح.
    6. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد 24 ساعة ، حث EBs التي تم الحصول عليها مع علاج حمض الريتينويك العالي (RA) باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. أضف 10 ميكرومتر RA إلى 3 مل من وسائط التمايز MSC. اجمع EBs في أنبوب سعة 15 مل واتركها تستقر لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بإزالة المادة الطافية من EBs وأضف وسائط تمايز MSC مكملة ب 10 ميكرومتر RA.
    3. أعد التعليق برفق وقم بتوزيع 0.5 مل / بئر في نفس لوحة التثبيت منخفضة للغاية ذات 24 بئرا.
    4. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. لا تزعج EBs لمدة 48 ساعة القادمة.
    5. بعد 48 ساعة ، اجمع EBs في أنبوب سعة 15 مل واتركها تستقر لمدة 15 دقيقة.
    6. قم بإزالة المادة الطافية من EBs وأضف وسائط تمايز MSC مكملة ب 0.1 ميكرومتر RA.
    7. أعد التعليق برفق وقم بتوزيع 0.5 مل / بئر في نفس لوحة التثبيت منخفضة للغاية ذات 24 بئرا.
    8. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. لا تزعج EBs لمدة 48 ساعة القادمة.
  4. قم بإزالة RA المضافة إلى الخلايا باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. بعد 48 ساعة من آخر علاج التهاب المفاصل الروماتويدي ، اجمع EBs واسمح لهم بالاستقرار لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة وسائط منخفضة الجلوكوز DMEM بدون السيتوكينات.
    3. أعد التعليق برفق ووزع 0.5 مل / بئر في لوحة تثبيت منخفضة للغاية تبلغ 24 بئرا. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  5. قم بتمييز EBs المشتقة من iPSCs باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. بعد 48 ساعة من الخطوة السابقة (الخطوة 2.4) ، اجمع EBs في أنبوب سعة 15 مل واتركها تستقر لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 2 مل من وسائط تمايز MSC الجديدة.
    3. نقل إلى بئرين من صفيحة 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي.
    4. قم بتغيير الوسائط كل يومين لمدة 5 أيام إضافية.
    5. بعد 5 أيام ، قم بإزالة الوسائط المستهلكة واستبدلها بوسائط تمايز MSC جديدة تحتوي على 2.5 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF).
  6. قم بتمرير EBs المطلية عندما تصل إلى التقاء 80٪ -90٪ ، باتباع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. اغسل الخلايا باستخدام DPBS ، وأضف trypsin-EDTA-500 μL لبئر من 6 آبار - واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    2. اجمع الخلايا باستخدام وسائط تمايز MSC في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بتدويرها عند 750 × جم لمدة 4 دقائق.
    3. أعد التعليق في وسائط التمايز MSC ب 2.5 نانوغرام / مل من bFGF وقم بطلاء الخلايا على ألواح مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 1: 3.
    4. كرر المقطع عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪. ومن المتوقع أن يكسب 3-6 ملايين خلية من خلال 2-3 ممرات.

3. تحليل التدفق الخلوي ل MSCs المشتقة من iPSCs

ملاحظة: عند الخضوع ل 2-3 مقاطع ، يجب الوصول إلى الخلايا لكفاءة تمايز MSC. سيتم اعتبار التمايز ناجحا إذا كانت الخلايا تعبر عن علامات التمايز MSC-CD44 و CD73 و CD90 و CD105 بكفاءة تزيد عن 90٪ ، ولا تعبر عن مستويات عالية من علامات المكونة للدم-CD14 و CD19 و CD34 و CD45. يمكن الوصول إلى كفاءة هذه العلامات باتباع الخطوات أدناه.

  1. قم بتمرير الخلايا باستخدام الخطوات الموضحة أعلاه (الخطوة 2.6) واحصل على 1 × 105 خلايا في بئر واحدة من صفيحة 96 بئرا ذات قاع V.
  2. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 375 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أعد تعليق 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر من DPBS البارد مع 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق (Ab) (انظر جدول المواد) واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 30-40 دقيقة لمنع التعرض للضوء.
  4. إعادة تعليق 1 × 105 خلايا أخرى في 100 ميكرولتر من DPBS البارد مع التحكم في النمط المتماثل المعني ل Ab المترافق بتركيز 1: 100 ) واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 30-40 دقيقة لمنع التعرض للضوء.
  5. بعد الحضانة ، قم بطرد مركزي اللوحة عند 375 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق هز اللوحة فوق الحوض.
  6. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من DPBS البارد.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 375 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  8. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من DPBS البارد وجمعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة مظلمة وباردة سعة 1.5 مل واحتفظ بها على الجليد حتى يتم تحليلها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS).
  9. لتحليل FACS ، قم بتوزيع الخلايا باستخدام التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل التشتت الأمامي (FSC-A) لاستبعاد الحطام. علاوة على ذلك ، قم بتوزيع الخلايا المسورة باستخدام الارتفاع المتناثر الأمامي (FSC-H) مقابل المنطقة المبعثرة الأمامية (FSC-A) لتمييز المفرد من الثنائيات من مجموعة الخلايا الحية.
    ملاحظة: تم إغلاق الخلايا بالنسبة إلى تحول التحكم في النمط المتماثل لكل علامة ، وتم استخدام ما لا يقل عن 10000 حدث مسور من كل عينة ملطخة للتحليل.

4. تمايز MSCs إلى خلايا دهنية

  1. تحضير الوسائط القاعدية لتمايز الخلايا الشحمية عن طريق إضافة 10٪ استبدال مصل بالضربة القاضية (KOSR) ، 1٪ جلوتامين ، 1٪ P / S ، 4.5 نانوغرام / ميكرولتر من الجلوكوز إلى الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) - ألفا وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. اسمح ل MSCs بالوصول إلى التقاء أعلى من 90٪. استمر في زراعتها لمدة 48 ساعة أخرى للسماح لها بالخضوع لفترة من توقف النمو.
  3. تحضير وسائط تمايز الخلايا الشحمية الكاملة عن طريق إضافة 100 ميكروغرام / مل من 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (IBMX) ، 1 ميكرومتر من ديكساميثازون ، 0.2 وحدة / مل من الأنسولين ، 100 ميكرومتر من الإندوميتاسين ، و 10 ميكرومتر من روزيجليتازون إلى الوسائط القاعدية.
  4. قم بإزالة وسائط التمايز MSC واغسل الخلايا باستخدام DPBS.
  5. أضف وسائط تمايز الخلايا الشحمية الكاملة - 2 مل لبئر صفيحة 6 آبار و 1 مل لبئر صفيحة 12 بئرا - واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير وسائط التمايز الكاملة كل يوم لمدة 14 يوما.

5. تقييم كفاءة التمايز للخلايا الشحمية

  1. في اليوم 14 من التمايز ، تحقق من كفاءة التمايز عن طريق تلطيخ الخلايا لعلامات نضج الخلايا الشحمية ، FABP4 ، والأديبونكتين.
  2. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا باستخدام DPBS.
  3. ثبت الخلايا باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) - 200 ميكرولتر في بئر من صفيحة 24 بئرا - واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. تخلص من PFA واغسله باستخدام محلول ملحي مخزن بنسبة 0.5٪ توين (TBST) وضعه على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر العملية مرتين.
  5. قم بنفاذ الخلايا الثابتة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.5٪ Triton X-100 (PBST) وضعه على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة.
  6. تخلص من PBST وأضف المخزن المؤقت المانع (5٪ -6٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBST) -500 ميكرولتر لبئر من صفيحة 6 آبار و 250 ميكرولتر لبئر من صفيحة 12 بئرا - واحتضانها في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 40-60 دقيقة.
  7. تمييع الأجسام المضادة الأولية ضد FABP4 ، أديبونيكتين في 2٪ -3٪ BSA ، بتركيز 1: 500 (انظر جدول المواد). أضف هذه الأجسام المضادة معا فقط إذا تم تربيتها في مختلفة وضع الطبق على الخفق عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  8. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام TBST (15 دقيقة لكل منها) وضعها على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  9. تحضير الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor في PBST (1: 500). احتضان الخلايا في مجموعات الأجسام المضادة الثانوية (حسب الأنواع التي يتم فيها رفع الجسم المضاد الأساسي) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
  10. تخلص من الأجسام المضادة الثانوية ، واغسلها باستخدام TBST ثلاث مرات ، وضع الطبق على شاكر.
  11. لتلطيخ النوى ، أضف 1 ميكروغرام / مل من Hoechst 33342-200 μL لبئر من 24 بئرا مخففة في PBS واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  12. تخلص من محلول Hoechst وأضف PBS-500 μL لبئر من 24 بئرا إلى الخلايا. حافظ على الألواح مغطاة من الضوء حتى يتم تصورها باستخدام مجهر مضان مقلوب.

6. فرز الخلايا الشحمية باستخدام النيل الأحمر

  1. قم بإعداد محلول العمل الأحمر النيلي بإضافة 1 مجم / مل من محلول مخزون النيل الأحمر في DMSO وتخزينه عند -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإذابة مخزون النيل الأحمر وإعادة تكوينه في DPBS لتحقيق تركيز محلول عمل 300 نانومتر.
  2. في أو بعد اليوم 14 من تمايز الخلايا الشحمية ، تخلص من الوسائط من الخلايا واغسلها باستخدام DPBS.
  3. يضاف محلول العمل الأحمر النيلي -1 مل في بئر من 6 آبار - ويحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. يرفع محلول النيل الأحمر ويضاف التربسين-EDTA -500 ميكرولتر في بئر من 6 آبار - ويحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  5. اجمع الخلايا باستخدام DMEM التي تحتوي على 5٪ FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 4 دقائق.
  6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في DPBS-1 مل لخلايا 1 × 106 . أجهزة الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 4 دقائق.
  7. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في DPBS-1 مل لخلايا 1 × 106 . استخدم فارز FACS لعزل الخلايا الموجبة لأحمر النيل باستخدام قناة FL1.
  8. إعادة زراعة الخلايا التي تم فرزها في وسائط تمايز الخلايا الشحمية أو جمع الخلايا التي تم فرزها لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين.
  9. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا التي تم فرزها وإجراء تحليل كمي نسبي لعلامات تمايز الخلايا الشحمية ، بما في ذلك FABP4 و PPARG و C / EBPA. تظهر الخلايا الموجبة لأحمر النيل تنظيما كبيرا في التعبير الجيني بمقدار طيتين على الأقل مقارنة بالخلايا غير المصنفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تخطيط ومورفولوجيا الخلايا أثناء تمايز اللحمة المتوسطة: يتضمن تمايز iPSCs إلى MSCs مراحل مختلفة من التطور تمتد عبر تكوين EB وتمايز MSC وتوسيع MSC (الشكل 1). خلال هذه المراحل من التطور ، تكتسب الخلايا مورفولوجيا مختلفة بسبب المواد الكيميائية المحفزة المختلفة التي تتعرض لها. عند بدء التمايز ، تكون الخلايا مطلية بالتعليق ومن المتوقع أن تكون مستديرة ، مع حدود خلية محددة ، بينما تكون صغيرة إلى متوسطة الحجم في القطر (الشكل 2). إن اختيار الخلايا المزروعة المعلقة خلال ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يحمل هذا البروتوكول أهمية قصوى نظرا لقدرته على توفير MSCs بإنتاجية وكفاءة عالية. أصبح هذا الإنتاج الضخم ل MSCs ممكنا من خلال الحضانة العابرة ل EBs المشتقة من iPSCs مع 10 ميكرومتر من RA14,15. عززت المعالجة العابرة ب 10 ميكرومتر من التهاب المفاصل الروماتويدي عائد MSC بمقدار 11.2 إلى 1542 ضعفا14,15 ، مع تطبيق هذا البروتوكول على كل من iPSCs و hPSCs. في هذه الجرعة ومدة العلاج ، يحسن التهاب المفاصل الروماتويدي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (رقم المنحة NPRP10-1221-160041). حصلت مريم أغادي على منحة دراسية من GSRA من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (QNRF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AdiponectinAbcamab22554علامة نضوج الخلايا الشحمية
المضادة ل CD105BD Pharmingen560839علامة التمايز MSC
المضادة ل CD14BD Pharmingen561712علامة التمايز MSC
المضادة ل CD19BD Pharmingen555415علامة التمايز MSC
المضادة ل CD34BD Pharmingen555824علامة التمايز MSC
المضادة ل CD44abcamab93758علامة التمايز MSC
المضادة ل CD45BD Pharmingen
560975		علامة التمايز MSC
المضادة ل CD73BD Pharmingen550256علامة التمايز MSC
المضادة ل CD90BD Pharmingen555596علامة التمايز MSC
bFGFR & D233-FPMSC ملحق وسائط
الثقافة C / EBPAAbcamab40761علامة نضج الخلايا الشحمية
ديكساميثازونتوريكس1126ملحق وسائط تمايز الخلايا الشحمية
FABP4Abcamab93945علامة نضج الخلايا الشحمية
مصل البقر الجنينيThermoFisher10082147ملحق وسائط ثقافة MSC
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC مكمل وسائط ثقافة
IBMXSigma AldrichI5879تكملة وسائط تمايز الخلايا الشحمية
IndomethacinSigma AldrichI7378تكملة وسائط تمايز
الخلايا الشحمية الأنسولينSigma Aldrich91077Cملحق وسائط تمايز الخلايا الشحمية
بالضربة القاضية DMEMThermoFisher12660012الوسائط القاعدية لتحضير matrigel
منخفض الجلوكوز DMEMThermoFisher11885084MSC وسائط زراعة
MatrigelCorning354230مصفوفة طلاء
MEM-alphaThermoFisher12561056وسائط تمايز الخلايا الشحمية
NileredSigma Aldrich19123الفرز للخلايا الشحمية
PenicillinThermoFisher15140122MSC / Adipocyte الملحق
الوسائط محلول ملحي مخزن بالفوسفاتThermoFisher14190144الغسيل العازلة
Pierce & trade ؛ 20X TBS BufferThermo Fisher28358عازلة الغسيل
PPARGتقنية إشاراتالخلية 2443علامة نضج الخلايا الشحمية
ReLeSRالخلايا الجذعية تقنيات5872كاشف التفكك
حمض الريتينويكسيجما ألدريتشR2625ملحق وسائط التمايز MSC
مثبط الصخورTocris1254/10hPSC ملحق وسائط
الثقافة RoziglitazoneSigma AldrichR2408ملحق وسائط تمايز الخلايا الشحمية
StemFlexThermoFisherA334901hPSC وسائل الإعلام
الثقافية TritonThermo Fisher28314كاشف النفاذية
TrypsinThermoFisher25200072كاشف التفكك
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash Buffer
علامة

المراجع

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846(2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785(2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تمايز قوي ل iPSCs البشرية إلى مجموعة نقية من الخلايا الشحمية لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.