توضح هذه المقالة نموذجا حيوانيا جديدا تم تطويره لدراسة تشريح وأنسجة القرنية وعمليات الشفاء. يستخدم هذا النموذج الحيواني الجديد الجربوع المنغولي ، الذي يحتوي على قرنية مع العديد من أوجه التشابه مع القرنية البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الجربوع المنغولية كنموذج حيواني لالتئام الجروح
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم إجراء دراسات التئام جروح القرنية لفترة طويلة وساعدت على تقليل المعاناة وتطوير العلاجات التي تساهم في تحسين صحة عيون المرضى. تاريخيا ، تمت دراسة شفاء القرنية في القوارض مثل الفئران والجرذان ، ولكن هذه النماذج قد لا تحاكي تماما الاضطرابات البشرية. ومع ذلك ، فإن المعلومات عن القوارض الأخرى مثل الجربوع المنغولية (Meriones unguiculatus) شحيحة في أبحاث القرنية.
هنا ، نصف تقنية لتطوير نموذج حيواني جديد لدراسة شفاء القرنية بعد استئصال القرنية الانكساري الضوئي. نظرا للأدبيات المحدودة المتاحة عن قرنية M. unguiculatus ، فإننا نصف أيضا التحليل النسيجي للقرنية الطبيعية. يمكن أيضا استخدام تقنيات البحث هذه في دراسة أمراض العيون بسبب التشابه بين قرنيات الجربوع المنغولية والبشر من حيث علم الوراثة والتشريح وعلم وظائف الأعضاء.
المقدمة
بعض أهم جوانب التئام جروح القرنية ، والتي تعد من الاهتمامات الرئيسية لجراحة الجزء الأمامي ، هي سلامة البنية الظهارية ، والحفاظ على شفافية سدى القرنية ، وأخيرا ، النتيجة من حيث الخصائص الانكسارية للقرنية1.
القرنية هي النسيج الخارجي الصافي في مقدمة مقلة العين ، وبالتالي فهي عرضة للصدمات والالتهابات والحروق. ضعف التئام هذه الجروح يمكن أن يضر بالصحة البصرية2.
في الوقت الحاضر ، تتوفر العديد من النماذج الحيوانية لدراسة شفاء القرنية ، وبعضها أفضل من البعض الآخر ، اعتمادا على الأنواع ونوع الآلية المراد دراستها1. هناك عدد قليل من السجلات من التحقيقات السابقة على شبكية العين من الجربوع2. ومع ذلك ، حتى الآن ، لا توجد أدبيات منشورة حول عمليات التندب في قرنية هذه القوارض.
هنا ، نقدم Meriones unguiculatus (الجربوع المنغولي) كنموذج حيواني لالتئام الجروح في القرنية. يتم وصف إجراءات استنباط شفاء القرنية بعد استئصال القرنية الانكساري الضوئي ، مما يسمح لنا بدراسة الأنواع المختلفة من عمليات تندب القرنية ، وفهم التئام الجروح من حيث المراحل الديناميكية للأنسجة الحية ، وأخيرا ، التخطيط للعلاجات المستقبلية المناسبة3. استئصال القرنية بالعلاج الضوئي هو تقنية قابلة للتكرار بدرجة كبيرة مع إمكانية التحكم بدقة في المعلمات مثل عمق وقطر إصابة القرنية4. علاوة على ذلك ، لا تتطلب هذه التقنية إجراءات باستخدام الأدوات الجراحية أو المحاليل الكيميائية (مثل المحلول الملحي ، والفورمالين ، والكحول ، وما إلى ذلك) التي قد تضيف متغيرات خاصة بالأدوات أو بالمشغل الذي يقوم بإجراءالعملية 5.
تم استخدام ثلاثة جربوع ذكور تبلغ من العمر 6 أشهر من نفس الأحجام والأوزان (حوالي 90 جم) للتجربة المقدمة في هذه المقالة. تم تنفيذ الإجراءات فقط في العين اليمنى. لم يخضع جربوع واحد (يشار إليه باسم الجربوع 1 أو السيطرة) لاستئصال القرنية بالعلاج الضوئي وتم استئصاله لتقييم جميع هياكل العين الطبيعية. يتضمن استئصال القرنية بالعلاج الضوئي التوصيل الخاضع للرقابة للأشعة فوق البنفسجية الناتجة عن ليزر إكسيمر إلى القرنية وتم تطويره من أجل إجراء الجراحة الانكسارية6. وقد تم استخدامه في القوارض الأخرى ، مثل الفئران7. تم إخضاع الجربوع الآخرين لاستئصال القرنية بالعلاج الضوئي. تم استئصال أحدهما في 24 ساعة (يشار إليه باسم الجربوع 2) والآخر في 96 ساعة بعد الجراحة (يشار إليه باسم الجربوع 3).
لإجراء هذه التجربة ، تم تصوير جربوع تم اختياره عشوائيا لكل حالة ليتم دراستها ، ولكن تم إجراء هذه التجربة سابقا مع 16 جربوع في المجموع لكل حالة. لأسباب التحرير ، تقرر استخدام جربوع تم اختياره عشوائيا لكل شرط (ثلاثة جربوع في المجموع) كمثال.
الهدف الرئيسي من هذا البحث هو استكشاف أفضل نموذج حيواني متاح. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه ليس كل الأنواع لها خصائص عين مشابهة لتلك الموجودة في العين البشرية8. توضح هذه المقالة المنهجية المستخدمة لدراسة قرنية Meriones unguiculatus والإجراء الذي يتم إجراؤه لتوليد إصابة القرنية ، مما يسمح لنا بدراسة عملية الشفاء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع إجراءات البحث من قبل "اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام المختبر" التابعة للجامعة الكاثوليكية في قرطبة واتبعت دليل المجلس الوطني للبحوث لرعاية واستخدام المختبر. ووافقت على هذه الإجراءات أيضا سلطات "كلية علوم الصحة" التابعة للجامعة الكاثوليكية في قرطبة و "معهد الرؤية سيرو".
1. التعامل مع الجربيل والتخدير
ملاحظة: كانت جميع الحيوانات من ذكور الجربوع المنغولية الخالية من مسببات الأمراض (SFP) وتم الاحتفاظ بها في مرافق مركز البحث والتطوير في علم المناعة والأمراض المعدية (CIDIE) (قرطبة ، الأرجنتين). تم الحصول عليها من جامعة دي لا بلاتا (بوينس آيرس ، الأرجنتين).
- إيواء الجربوع اجتماعيا في أقفاص بولي سلفون مغطاة بفراش كوز الذرة. توفير الطعام ومياه الصنبور المصفاة في زجاجات المياه الإعلانية libitum. تأكد من أن نطاق درجة حرارة الغرفة من 18 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية ويتم استخدام دورة 12:12 ساعة من الضوء والظلام.
- قم بوزن كل جربوع على حدة ، وحدد كل واحد لتجنب الالتباس. اصنع علامة بعلامة حبر لا تمحى على قاعدة ذيل الجربوع. استخدم الملقط لعقد أذن الجربوع ووضع علامة باستخدام علامة لا تمحى على أذن القوارض. في حالة توفر مختبر و biotherium كبير ، قم بتعيين قفص فريد لكل قوارض مع التعريف المقابل.
- تطهير غطاء التدفق الصفحي بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪. ضع جميع الأدوات الجراحية والأدوات التي تستخدم لمرة واحدة بما في ذلك الإبر والمحاقن والرفوف في منطقة العمل داخل الغطاء. ضع رغوة جراحية يمكن التخلص منها في غطاء المحرك أيضا.
- استخدم حاوية بلاستيكية صغيرة مفتوحة للحفاظ على القوارض على ميزان الدقة لتسهيل القياس.
- استخدم ثلاثة جربوع منغولية ذكور عمرها 6 أشهر بأحجام وأوزان متشابهة (~ 80 جم) لهذه التجربة. واحدا تلو الآخر ، ضع كل قفص مع القوارض داخل غطاء التدفق الرقائقي. افتح الأقفاص ، وحدد كل من الجربوع ، وقم بوزنها على الميزان.
ملاحظة: الجربوع غير ضارة ولكنها حساسة. ارتداء قفازات يمكن التخلص منها عند التعامل مع الجربوع. - أمسك الجربوع باليد غير المهيمنة لتثبيته بقوة من الذيل. استخدم اليد المهيمنة ، مع الإبهام والسبابة خلف الأذنين ، لحمل الحيوان مع توجيه المنطقة البطنية لأعلى. استخدم الإصبع الصغير لعقد الذيل.
- املأ حقنة بإبرة 30 جم مع 1 مل من الكيتامين والزيلازين. يتم تطبيق التخدير داخل الصفاق في القوارض (50-100 ملغ/كغ من الكيتامين و2 ملغ/كغ من الزيلازين)9 باستخدام اليد السائدة. ستكون مدة التأثير حوالي 20-50 دقيقة (قد تحدث اختلافات).
- للتأكد من تخدير الجربوع بالكامل ، تحقق من قرصة إصبع القدم ، وقرصة الذيل ، وانعكاس القرنية ، وما إلى ذلك ، قبل إجراء شقوق في القرنية.
ملاحظة: نفذ جميع الإجراءات في العين اليمنى فقط.
2. التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) للقرنية
- ضع ستائر جراحية معقمة لحماية المعدات من الإفرازات أو شعر الحيوانات.
- تأكد من أن أحد المشغلين يحمل الحيوان بينما يلتقط مشغل آخر الصور. يجب على المشغل أن يضع يديه على الجهاز أثناء إمساك الجربوع بحيث تكون عين الجربوع مستقرة ولا تزال قابلة للدراسة. أرح اليد التي تمسك الجربوع على مسند الذقن ..
- ابدأ تشغيل البرنامج الذي يتحكم في OCT ، واضغط على التقاط صورة ثم حفظ الصورة المطلوبة. أداء شرائح متعددة السهمية والإكليلية من القرنية. تخيل العين تحت OCT ، وقم بعمل شرائح متعددة لعرض الجزء الأمامي من قرنية القوارض.
ملاحظة: إذا لم تكن الصورة التي تم الحصول عليها حادة وتحركت العين قليلا، كرر الإجراء عدة مرات للحصول على صور كافية. - باستخدام برنامج OCT ، قم بإجراء قياسات باكيمتري للمناطق المركزية والمحيطية. في الشاشة الرئيسية للبرنامج ، اضغط على التقاط صورة ، ثم اضغط على زر حفظ الصورة المطلوبة .
- قم بإجراء القياسات على العين الطبيعية أو الضابطة ومباشرة بعد استئصال القرنية بالعلاج الضوئي على عيون القوارض الأخرى.
3. استئصال القرنية بالليزر العلاج الضوئي بالليزر (PTK)
- ضع ستائر جراحية معقمة على جهاز ليزر excimer لحماية الجهاز من الإفرازات أو شعر الحيوان.
- غرس قطرة من بروباراكائين هيدروكلوريد الموضعي (0.5٪) في العين المراد علاجها قبل 5 دقائق من العملية الجراحية.
- استخدم اليد غير المهيمنة لعقد الجربوع بإحكام. باستخدام اليد المهيمنة ، افتح جفون الحيوان بحيث يمكن التقاط الصور بشكل صحيح. لتتمكن من التركيز والحصول على صورة حادة ، تأكد من أن يدي الشخص الذي يحمل الجربوع تستقر على رأس الجهاز. ضع اليدين اللتين تمسكان بالحيوان حيث يضع المريض رقبته.
- إجراء الاجتثاث PTK على العين اليمنى. استخدم المعلمات التالية: الاجتثاث بين 60 ميكرومتر و 62 ميكرومتر ، ومنطقة بصرية 3 مم ، ومدة 4 ثوان ، وما مجموعه 1867 نبضة.
ملاحظة: يتم تنفيذ PTK فقط على الجربوع 2 والجربيل 3. في هذه الخطوة ، يقوم المشغل الثاني بإعداد وتنشيط الليزر لاستئصال أنسجة القرنية. - مباشرة بعد الإجراء ، التقط صورا وقم بإجراء تحليل OCT لتسجيل وتوثيق التغيرات السطحية في العيون المعالجة.
- بمجرد اكتمال الإجراء ، ضع القوارض مرة أخرى في القفص ، وراقب العلامات الحيوية (معدل ضربات القلب: 360 نبضة في الدقيقة ؛ درجة حرارة المستقيم: 37-38.5 درجة مئوية ؛ معدل التنفس: 90 نفسا في الدقيقة) ، ودع الحيوان يتعافى من التخدير.
4. إيقاظ الجربوع بعد القرنية PTK
- يتم تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ إلى 0.05 ملغ/كغ) وأتيباميزول (0.1-1 ملغ/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
- ضع كل جربوع في قفص المنزل الخاص به ، وراقب العلامات الحيوية للاستيقاظ الطبيعي (درجة حرارة الجسم الطبيعية هي 37-39 درجة مئوية).
- ضع مرهم الاريثروميسين للحفاظ على السطح نظيفا ومنع العدوى. نفذ هذا الإجراء مرتين في اليوم.
- تطبيق البوبرينورفين (كل 6-12 ساعة) تحت الجلد (0.01-0.05 مل) لتسكين الألم ومرهم العين في يومين متتاليين بعد PTK.
5. طريقة القتل الرحيم
- أداء القتل الرحيم في قفص المنزل كلما أمكن ذلك.
- إدخال غاز ثاني أكسيد الكربون المضغوط (CO2) في قفص المنزل. معدل تعبئة 30٪ -70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة مع إضافة CO2 إلى الهواء الموجود في القفص المنزلي كاف لتحقيق خليط يلبي الهدف (بالنسبة لغرفة حجم 10 لتر ، استخدم معدل تدفق 3-7 لتر / دقيقة). استخدام خلع عنق الرحم (كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم) لضمان وفاة القوارض.
- في 24 ساعة و 96 ساعة بعد الجراحة ل gerbil 2 و gerbil 3 ، على التوالي ، قم بإزالة الحيوان من قفص المنزل لإجراء استئصال مقلة العين (كل من مقلة العين الطبيعية وتلك التي تخضع لعملية جراحية) لمراقبة شفاء القرنية.
- ضع الحيوان على طاولة العمليات ، وتحقق من عدم وجود نبضات قلب لمدة 1 دقيقة تقريبا.
6. جراحة العيون
- قم بإزالة الجفون العلوية والسفلية للوصول إلى مقلة العين. استخدم ملقط ومقص جراحي لإزالة الجفون. حجم منطقة العمل صغير جدا وحساس لدرجة أن إزالة الجفون تسمح باستئصال مقلة العين دون إتلافها.
- لاستئصال مقلة العين ، قم بعمل شق في الكانثوس الخارجي ، وقم بتوجيه المقص في اتجاه خلفي. كرر هذا الإجراء من canthus الداخلية عن طريق فصل مقلة العين عن المدار.
- قسم العصب البصري في الجزء الخلفي من مقلة العين. يجب توضيح أن الضفيرة المدارية الخلفية عادة ما تولد نزيفا طفيفا عند تنفيذ هذه التقنية ، مما يجعل العمل صعبا.
- أدخل مقلة العين في أنبوب طرد مركزي دقيق بمحلول ملحي معقم لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة لغسل أي دم متبقي.
- ضع مقلة العين في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 10٪ فورمالديهايد للتحليل التشريحي المرضي اللاحق كما هو موضح أدناه. التقط صورا وصورا فوتوغرافية متعددة.
7. تحليل التشريح المرضي
- تضمين العين كلها في 10 ٪ الفورمالين المخزنة لمدة 6-24 ساعة.
- قطع الأنسجة باستخدام ميكروتوم. تأكد من أن الأنسجة المقطوعة بسمك 3 مم.
- نقع الأنسجة في الكحول 96 ٪ لمدة 30-90 دقيقة ، وكرر هذا الإجراء مرتين.
- ضع المنديل في كحول الأيزوبروبيل لمدة 30-90 دقيقة ، وكرر هذا الإجراء مرتين.
- ضع الأنسجة في بديل الزيلين أو الزيلين لمدة 1-3 ساعات.
- تضمين الأنسجة في الكيروسين السائل لمدة 1 ساعة كحد أدنى.
- استخدم كتلة لوضع الأنسجة وتضمينها في البارافين السائل. اتركه يتجمد (ضعه في مكان بارد) ، واقطعه.
- تحضير microtome للتقسيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- بعد ذلك ، استخدم البقع مثل الهيماتوكسيلين ويوزين.
- الحصول على الصور مع إضافة الكاميرا إلى المجهر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه الدراسة ، تم تحليل بنية القرنية بأكملها بدقة باستخدام التقنيات النسيجية والدراسات التكميلية للجزء الأمامي ، مثل التصوير المقطعي للتماسك البصري. يظهر تحليل الصورة باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري لهياكل الجزء الأمامي ظهارة وسدى طبيعية (الشكل 1) ، مع سمك القرنية المركزي والمحيطي من 160 ميكرومتر و 106 ميكرومتر ± 2 ميكرومتر ، على التوالي. أظهرت منشورات أخرى أيضا أن قرنية القوارض الأخرى تصبح أرق نحو المحيط10.
بعد PTK ، لوحظ تنضير ظ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فسيولوجيا التئام جروح القرنية هي توازن بين تجديد الأنسجة والحفاظ على التوازن. قد يؤدي التئام الجروح المفرط إلى التليف والتندب ، مما قد يؤدي في النهاية إلى فقدان وظائف الأعضاء. مع التطور السريع للإجراءات الجراحية للقرنية ، لا يمكن المبالغة في تقدير أهمية فهم التئام جروح القرنية والأحداث الفسيولوجية والمرضية المعنية11.
تدعي العديد من الأبحاث أن الجربوع لها العديد من الخصائص الحسية التي تجعلها نوعا مواتيا لدراسات الرؤية ، بما في ذلك السلوك النهاريبشكل أس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر المهندس رودريغو دي لا فوينتي على مساعدته القيمة ودعمه الفني. كما نشكر ماريا يوجينيا كوربيلا على السرد وبريسيلا هزرون على إصدار الشخصيات. سمح لنا هوغو لوجان باستخدام المرافق في مركز البحث والتطوير في علم المناعة والأمراض المعدية (CIDIE).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| التخدير | Tododrogas | ||
| Eppendorf أنابيب | Tododrogas | ||
| Excimer Laser | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| Fallps | Ofcor | 3339 | |
| قفازات الفورمالديهايد | Tododrogas | ||
| Tododrogas | |||
| الكيتامين | سيجما ألدريتش | ||
| التصوير المقطعي البصري التماسك | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| ستائر معقمة | سوبورت المستشفيات شاش | ||
| معقم | سوبورت المستشفيات محاقن | ||
| وإبر | Tododrogas | ||
| زيلازين | سيجما ألدريتش |
المراجع
- Kuo, I. C. Corneal wound healing. Current Opinion in Ophthalmology. 15 (4), 311-315 (2004).
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J. Corneal epithelial wound healing. Indian Journal of Ophthalmology. 51 (1), 5-15 (2003).
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Experimental Biology and Medicine. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S. Phototherapeutic keratectomy. Indian Journal of Ophthalmology. 60 (1), 5-14 (2012).
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071(2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903(2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
