تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

Zain  Zaki Zakaria; Shahram Eisa-Beygi; Fatiha M. Benslimane; Ramani Ramchandran; Huseyin C. Yalcin

doi:10.3791/63324

مقالة منهجية

تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

DOI:

10.3791/63324

⸱

أغسطس 9, 2022

Zain Zaki Zakaria¹^,² , Shahram Eisa-Beygi³ , Fatiha M. Benslimane¹ , Ramani Ramchandran⁴ , Huseyin C. Yalcin¹

¹Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, ²Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, ³Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, ⁴Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي تصميم وإعداد وحقن مورفولينو معرقل الترجمة ضد جين قلبي تمثيلي. تم التعبير عن مشتقات القلب والقمة العصبية 2 (hand2) في صفار أجنة الزرد المخصبة حديثا لإسقاط وظيفة الجينات. كما يظهر إنقاذا عابرا لهذه "المورفانات" عن طريق الحقن المشترك ل mRNA الذي يشفر هذا المنتج الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام نظام ضربة قاضية قائم على المورفولينو قليل القلة لتحديد وظيفة المنتجات الجينية المختلفة من خلال الفقدان أو تقليل التعبير. تتمتع Morpholinos (MOs) بميزة الاستقرار البيولوجي على oligos DNA لأنها ليست عرضة للتدهور الأنزيمي. لتحقيق الفعالية المثلى ، يتم حقن MOs في 1-4 أجنة في مرحلة الخلية. الفعالية الزمنية للضربة القاضية متغيرة ، ولكن يعتقد أن MOs تفقد آثارها بسبب التخفيف في النهاية. يجب التحكم عن كثب في تخفيف المورفولينو وكمية الحقن لتقليل حدوث التأثيرات غير المستهدفة مع الحفاظ على الفعالية المستهدفة. يجب إجراء أدوات تكميلية إضافية ، مثل CRISPR / Cas9 ضد الجين المستهدف ذي الأهمية لتوليد خطوط متحولة وتأكيد النمط الظاهري المتغير بهذه الخطوط. ستوضح هذه المقالة كيفية تصميم وإعداد وحقن مورفولينو ممنع الترجمة ضد اليد 2 في صفار أجنة سمكة الزرد في مرحلة 1-4 خلايا لإسقاط وظيفة hand2 وإنقاذ هذه "الأشكال" عن طريق الحقن المشترك ل mRNA الذي يشفر الحمض النووي (cDNA) المقابل. بعد ذلك ، يتم تقييم فعالية الحقن المجهري للمورفولينو من خلال التحقق أولا من وجود المورفولينو في صفار البيض (يتم حقنه بالفينول الأحمر) ثم عن طريق تحليل النمط الظاهري. علاوة على ذلك ، ستتم مناقشة التحليل الوظيفي للقلب لاختبار فعالية الضربة القاضية. أخيرا ، سيتم شرح تقييم تأثير الانسداد الناجم عن المورفولينو لترجمة الجينات عبر النشاف الغربي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر استخدام أسماك الزرد كنموذج لدراسة تطور القلب والأوعية الدموية والأمراض مجموعة متنوعة من المزايا ، بما في ذلك الحفاظ العالي على وظيفة الجينات ، والشفافية البصرية ، والتطور السريع للقلب والأوعية الدموية ، والتكلفة الأرخص عند مقارنتها بالنماذج التقليدية في الجسم الحي ¹. مورفولينو قليل النوكليوتيدات (MOs) هي أدوات الضربة القاضية الجينية الأكثر استخداما لنموذج الزرد. كثيرا ما تستخدم MOs لتحديد النمط الظاهري أو للتحقيق في وظيفة الجينات. طور الدكتور جيمس سمرتون في البداية نظام توصيل المورفولينو لتثبيط ترجمة الرنا المرسال في الجسم الحي كمحاولة لتطوير علاجات لعيوب النمو البشري²^،³. تم استخدام MOs للكائنات الحية النموذجية في المختبر وفي الجسم الحي لإسقاط الجينات والتحقيق في عواقب هذا الضربة القاضية على النمط الظاهري. يتم ذلك من خلال ملاحظة التغيرات في تطور أعضاء معينة ، على سبيل المثال ، القلب. أدى الضربة القاضية للجينات الخاصة بالقلب في أجنة أسماك الزرد WT إلى فشل ضربات القلب المناسبة ، مما يدل على الوظيفة التي لا غنى عنها لهذه الجينات لنمو^{القلب 4}^،⁵. تم إنقاذ هذه الأنماط الظاهرية عن طريق الحقن المشترك ل mRNAs للجينات المحددة. أظهرت دراسة شملت تروبونين القلب T (Tnnt2) أن التعبير عن tnnt2 mRNA كامل الطول يمكن أن ينقذ الأنماط الظاهرية السارمية الناجمة عن ضربة قاضية^{مورفولينو 6}. كشفت دراسة أخرى أنه يمكن استعادة سلامة النطاقات A والأقراص Z عن طريق الإفراط في التعبير عن تقويم العظام التنظيمي لسلسلة الميوسين الخفيفة (cmlc2) mRNA في cmcl2 مورفانتس⁷.

تستخدم MOs بشكل شائع لإسقاط التعبير الجيني عن طريق استهداف تضفير ما قبل الرنا المرسال أو عن طريق منع الترجمة. تربط لصق MOs وتمنع ما قبل الرنا المرسال عن طريق تثبيط لصق الجسيم. يحدث الحجب الانتقالي عندما يرتبط MO بالمنطقة غير المترجمة 5'-من mRNA التكميلي لإعاقة تجميع الريبوسوم. MOs هي الطريقة الأكثر استخداما للجينات الخاصة بالطرق لضربة قاضية للتعبير الجيني لنماذج in vivo ؛ كما أنها أكثر عوامل حجب الرنا المرسال كفاءة المستخدمة في مزارع الخلايا. يتكون المورفولينو نفسه عادة من سلسلة قصيرة (حوالي 25) من قواعد الوحدات الفرعية المورفولينو. تشتمل كل وحدة فرعية MO على قاعدة حمض نووي وحلقة مورفولين وفوسفوروديات غير أيونية. تتطلب آليات العمل المختلفة لنوعي MOs اختبارات مختلفة للتحقق من فعالية الضربة القاضية. بالنسبة لعمليات حظر الترجمة ، فإن تحليل اللطخة الغربية هو اختبار الفعالية الأكثر موثوقية ، حيث لا ينبغي إنتاج البروتين المعني بسبب انسداد موقع بدء ترجمة ATG. MOs لا تحلل بشكل مباشر من mRNA المستهدف. بدلا من ذلك ، ترتبط بمناطق معينة وتمنع التعبير حتى تتحلل بشكل طبيعي. ومع ذلك ، فإن MOs التي تمنع لصق تقوم بتعديل ما قبل الرنا المرسال عن طريق إحداث تعديل لصق ، والذي يمكن فحصه عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) والرحلان الكهربائي للهلام.

يجب توحيد ثلاثة أجزاء حاسمة من عملية فحص MOs: (ط) يجب ضبط منحنى جرعة MO للتعرف على النمط الظاهري. يظهر منحنى الجرعة أيضا الجرعة المميتة 50 (LD50: الجرعة التي يموت عندها 50٪ من الأجنة المحقونة) لكل MO تم اختباره لتحسين القدرة على تحسين "إشارة" النمط الظاهري مقابل "الضوضاء" خارج ^الهدف3. '2' ينبغي توثيق تسميات النمط الظاهري التي تم تكييفها توثيقا جيدا؛ يعد الوصف الظاهري الدقيق والمفهوم بسهولة أمرا بالغ الأهمية لتقديم تفسيرات شاملة تستند إلى الأدبيات الحالية وخبرة المحققين لتسهيل تبادل المعلومات بين أولئك الذين لم يفحصوا الأجنة مباشرة. (ثالثا) إن وجود لغة محددة جيدا يجعل من السهل جمع البيانات مركزيا من قاعدة بيانات^{مورفولينو 8}.

في دراسات MO ضربة قاضية لجينات القلب ، يجب مراقبة نشاط قلب وديناميكيات تدفق الدم من أجل تحديد تأثير تجارب ضربة قاضية MO على وظيفة نظام القلب والأوعية الدموية. تتطلب هذه التحليلات تصورا في الوقت الفعلي لنظام القلب والأوعية الدموية بدقة عالية. جلد الزرد شفاف في الأسبوع الأول من التطور ، مما يتيح تصور القلب والدورة الدموية عبر الفحص المجهري. لتقييم وظيفة القلب ، فإن المعلمات الفسيولوجية الأكثر حسابا هي معدل ضربات القلب ونتاج القلب بالإضافة إلى التقصير الجزئي وتغيير المنطقة الكسرية والكسر القذفي. يمكن قياس سرعات تدفق الدم عن طريق تتبع كرات الدم الحمراء المتحركة ، وتستخدم هذه القياسات لتحديد مستويات إجهاد القص ، وهو عامل ميكانيكي بيولوجي حاسم على الخلايا البطانية. يتطلب هذا التقييم تسجيل أفلام بفاصل زمني لضربات القلب وتدفق الدم عبر مجهر مقلوب أو مجهر مجسم مزود بكاميرا عالية السرعة.

توضح هذه الورقة كيفية تصميم وإعداد وحقن مورفولينو مانع الترجمة ضد جين ذي أهمية في صفار أجنة الزرد المخصبة حديثا لإسقاط وظيفة الجينات. سيظهر أيضا إنقاذ هذه "المورفانات" عن طريق الحقن المشترك ل mRNA الذي يشفر هذا الجين. سنقوم بعد ذلك بتحليل فعالية الحقن المجهري للمورفولينو من خلال التوصيفات المظهرية بالإضافة إلى التحليلات الهيكلية والوظيفية للقلب. سيتم إثبات هذا النهج على جين قلبي تمت دراسته على نطاق واسع ، hand2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمعايير المقبولة للرعاية الإنسانية للحيوان بموجب تنظيم IACUC في جامعة قطر. تم الاحتفاظ بالحيوانات في منشأة أسماك الزرد التابعة لمركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة قطر (QU-BRC). كانت جميع المستخدمة في هذه الدراسات التجريبية أقل من 3 أيام بعد الإخصاب (dpf).

ملاحظة: لكل مجموعة تجريبية ، ينصح باستخدام ما لا يقل عن 30 جنينا للدقة الإحصائية. المجموعات التجريبية هي كما يلي:

المجموعة الضابطة: تشمل هذه المجموعة الأجنة المزروعة في ماء البيض دون أي حقن. ستشكل النتائج هنا خط الأساس للتحكم.

مجموعة المراقبة السلبية: تشمل هذه المجموعة الأجنة المستزرعة في ماء البيض المحقون ب MOs المخفوقة.

المجموعة المحقونة: تشمل هذه المجموعة الأجنة المحقونة باليد 2 MO وحدها و hand2 MO مع hand2 mRNA لإنقاذ النمط الظاهري. ستؤكد النتائج هنا أن الأنماط الظاهرية المرصودة ظهرت بسبب MOs المحقونة. ستمكن مقارنة المجموعات التجريبية من تقييم تأثير تثبيط وإنقاذ اليد 2 على وظائف القلب بدقة.

1. تصاميم مورفولينو لليد 2.

ملاحظة: يمكن تكييف تسلسلات MO من الأدبيات⁹^،¹⁰^،¹¹. بدلا من ذلك ، يمكن تصميم هذه oligos عبر الإنترنت بواسطة أدوات الجينات. تقدم Gene-tools خدمة تصميم مجانية وسريعة عبر الإنترنت ، والتي يمكن الوصول إليها من خلال موقع الويب^{الخاص بهم 12}. يمكن تصميم MO المخصص بسهولة من خلال توفير معلومات حول الجينات ذات الأهمية ، مثل معلومات التسلسل أو أرقام الانضمام. تلخص الخطوات المحددة التالية كيفية تصميم MOs مقابل اليد2 في أسماك الزرد:

أولا ، ابحث عن تفاصيل الجين محل الاهتمام من قاعدة بيانات NCBI. لليد 2 ، في سمك الزرد¹³.
احصل على معرف نسخة الرنا المرسال GenBank من NCBI¹⁴.
احصل على تسلسل mRNA من NCBI¹⁵.
ملاحظة: تتوفر قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المعدلة بمورفولينو (MO) لجين Hand2 لسمك الزرد وتم نشرها مسبقا. اليد 2 تسلسل MO⁹^،¹⁰^،¹¹: 5'-CCTCCAACTAACTCATGGCGACAG-3 '، تسلسلات MO المستخدمة في الدراسة مذكورة في جدول المواد.
احصل على تحكم سلبي من MO غير متطابق أو مخلوطة (تسلسلات مماثلة مع تغييرات عشوائية في زوج القاعدة) من أدوات الجينات¹⁶ ليتم حقنها. هذا من شأنه أن يساعد في التصديق على خصوصية النمط (الأنماط الظاهرية) التي لوحظت في حقن MO محددة وتقليل مخاطر أن تكون التأثيرات الملحوظة ناتجة عن قطعة أثرية من إجراء الحقن.

2. تحضير حقن المورفولينو

تحضير المخزون
1. إذابة مخزون MO مع ddH₂O ؛ يمكن أن يؤدي ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) إلى إتلاف MOs ويكون ساما للأجنة. ومن ثم ، استخدم ddH₂O الخالي من DEPC. عند الطلب ، يتم تسليم MOs في قارورة بتركيز 300 نانومتر.
  ملاحظة: بينما توصي Gene Tools بحلول مخزون 1 ملي مولار (~ 8 نانوغرام / نانولتر) ، يمكن أن يكون هذا منخفضا جدا ، خاصة إذا كان المورفولينو يتطلب جرعة عالية أو تم خلطه مع MOs الأخرى. لذلك ، فهو مثالي لصنع تركيزات مختلفة من محاليل مخزون MO (2 أو 3 ملليمتر).
2. قم بإعداد محلول عمل 0.2 ملي مولار عن طريق التخفيف الفرعي لمحلول العمل (على سبيل المثال ، لمخزون 2 ملي ، تخفيف 1:10). قم بإعداد 10 ميكرولتر من محلول العمل عن طريق إضافة محلول Danieaux (7 ميكرولتر) ، ومورفولينو المخزون (1 ميكرولتر) ، والفينول الأحمر (2 ميكرولتر من 10x مخزون). يعطي الفينول الأحمر المحلول لونا أحمر داكنا للمساعدة في تتبع المادة المحقونة في الجنين.
3. احتفظ ب MOs في درجة حرارة الغرفة (RT) في حاويات محكمة الإغلاق لمنع التبخر. لا تحتفظ ب MOs على الجليد على سطح الطاولة ، فقد يترسب المحلول. التعامل مع RT هو الأنسب.
  ملاحظة: توصي Gene Tools بأي من طريقتي تخزين MOs: يمكن الاحتفاظ بمحلول العمل عند -20 درجة مئوية (لعدة أشهر إلى سنوات) أو RT في أنبوب مغلق للتخزين طويل الأجل. إذا تم الاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية ، قم بتسخين محلول قليل النوكليوتيدات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ودوامة لإذابة المورفولينو تماما قبل الاستخدام (لا حاجة لتسخينه إذا تم الاحتفاظ به في RT).
النسخ في المختبر ل mRNA
ملاحظة: تم استخدام النسخ في المختبر لتوليد mRNA من Hand2 من Plasmid HAND2 (NM_021973) Human Tagged ORF Clone ليتم حقنه في أجنة الزرد لإنقاذ النمط الظاهري بسبب هدم يد سمكة الزرد 2 باستخدام مورفولينوس ، يتم سرد تفاصيل البلازميد المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. خطي الحمض النووي البلازميد بواسطة إنزيم تقييد مناسب وتنقية باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (جدول المواد). استخدم الحمض النووي الخطي المنقى كقالب للنسخ في المختبر لتوليد mRNA للحقن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
2. أخيرا ، قم بحقن 250 بيكوغرام من الرنا المرسال البشري للجين المعني لإجراء إنقاذ النمط الظاهري لاختبار ما إذا كان عدم وجود نمط ظاهري هو بالفعل من فقدان جين الزرد بواسطة MO.
التحضير للحقن
1. اسحب إبرة باستخدام أداة سحب الماصات الدقيقة (جدول المواد)، باتباع الخطوات 2.3.2-2.3.6.
2. استخدم أنابيب شعرية مقاس 1 مم مع خيوط ومجتذب ماصة دقيقة. قم بتشغيل الجهاز وافتح الغطاء
3. أدر مقبض تحديد الوضع إلى سخان NO.2 . باستخدام سخان NO.2 ، اضبط المقبض لرفع الحرارة إلى 68 درجة مئوية
4. أعد مقبض تحديد الوضع إلى موضع الخطوة 1 . استخدم أربعة أوزان (2 نوع خفيف / 2 نوع ثقيل)
5. ضع الشعيرات الدموية على الحامل وأغلق الغطاء. اضغط على زر البدء للحصول على الإبرة المسحوبة.
  ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى توليد إبر شعرية ذات تفتق طويل
6. قطع طرف الإبر لفترة وجيزة باستخدام ملقط. شحذ طرف الإبرة المسحوبة لسهولة اختراق أجنة الزرد باستخدام شطبة شعرية لمدة 30 ثانية تقريبا ، مما ينتج عنه أطراف بأقطار حوالي 15-25 ميكرومتر.
7. معايرة الإبرة لتقدير كمية الحقن باتباع الخطوات 2.3.8-2.3.13.
8. امزج محلول mRNA / morpholino لفترة وجيزة قبل تحميله في الإبرة لإذابة الجزيئات التي يمكن أن تسد الإبرة تماما.
9. أضف ~ 3-4 ميكرولتر من محلول MO إلى الجزء الخلفي من إبرة الحقن باستخدام طرف ماصة برأس ميكرون. تم تجهيز إبر الحقن بخندق صغير لتسهيل الردم الشعري.
10. تأكد من عدم وجود فقاعات في إبرة الحقن. قم بتركيب الإبرة على الحاقن الدقيق.
11. تأكد من عدم انسداد طرف الإبرة وأن محلول MO يمكن أن يتدفق من الإبرة بالضغط على دواسة الحقن.
12. معايرة حجم الحقن عن طريق قياس حجم القطرة. ضع طرف الإبرة في الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر. اضغط على دواسة الحقن واضبط ضغط الحقن (رطل لكل بوصة مربعة) و / أو وقت الحقن (مللي ثانية) حتى يبلغ قطر القطرة المقذوفة 0.1 مم ، أي ما يعادل 0.5 نانولتر.
13. تأكد من أن حجم الحقن حوالي 0.5-1 nL. اضبط مستوى الصوت عن طريق تغيير ضغط الحقن (الإخراج) أو الوقت (مللي ثانية).
14. بالنسبة لبروتوكول إعداد حاقن بيكوليتر، اتبع الخطوات 2.3.15-2.3.16
15. استخدم حاقن بيكوليتر لحقن سمك الزرد. قم بتشغيل مضخة تغذية الحاقن.
16. قم بإعداد الحاقن وفقا للمتطلبات الموضحة أدناه:
  1. P الميزان: تأكد من أن P-balance حوالي 0. تأكد من أنه سلبي قليلا لمنع تدفق الصفار مرة أخرى إلى الإبرة ، مما يؤدي إلى تخفيف محلول MO في الإبرة. على العكس من ذلك ، إذا كان الضغط الخلفي مرتفعا جدا ، فسوف يتدفق MO باستمرار من الإبرة حتى بدون ممارسة الضغط على الدواسة ، مما يؤدي إلى التباين والتناقضات في الجرعة المحقونة والأنماط الظاهرية المرصودة.
  2. حقن P: 20-25 رطل لكل بوصة مربعة مثالي. قم بتغيير هذا لضبط حجم الحقن. يمكن أن يتراوح هذا من 10-30 رطل لكل بوصة مربعة ولكن ابدأ ب ~ 20 رطل لكل بوصة مربعة للتحقق مما إذا كان يوفر الحجم المطلوب.
  3. وقت الحقن: تأكد من تقليل وقت الحقن إلى 300 مللي ثانية. قبل ضبط حجم الحقن، قم بإجراء تعديلات على وقت الحقن.
17. لحقن مورفولينو ، اتبع الخطوات 2.3.18-2.3.19.
18. تحضير غرفة الحقن على النحو التالي: اصنع 2٪ agarose من 0.6 غرام من agarose و 30 مل من E3 متوسط. صب الاغاروز في طبق بتري وضع قالب حقن على الاغاروز باستخدام قالب حقن TU-1. بمجرد أن تبرد في الفريزر ، تتشكل الأخاديد لوضع الأجنة وتثبيتها (الشكل 1 أ).
  ملاحظة: تتكون وصفة محلول مخزون 60x E3M من 5.0 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، 0.16 ملي مللي كلوريد₄ ·7 ساعات₂درجة مئوية ، 0.4 ملي كالسيوم₂ · 2 ساعة₂درجة مئوية في 1 لتر ddH₂O مع درجة حموضة نهائية 7.6.
19. انقل الأجنة المجمعة إلى الأخاديد باستخدام ماصة نقل ، وقم بإزالة كل وسيط E3 الزائد حول الأجنة لمنع تعويم الأجنة (الشكل 1 ب).

3. حقن محلول MO و mRNA في صفار البيض

أدخل الإبرة من خلال المشيمة ، وحقن بالقرب من حدود الخلية / صفار البيض إلى جانب الجنين واضغط على دواسة الحقن (الشكل 1 ج).
ملاحظة: لن ينتشر محلول MO المحقون / الفينول الأحمر على الفور داخل صفار البيض. ستلاحظ بقعة حمراء في صفار البيض تتبدد تدريجيا. يجب ألا تتجاوز المادة المحقونة أكثر من 10٪ من حجم الجنين. يمكن حقن MOs في صفار بيض الزرد الذي تم وضعه حديثا حتى المرحلة المكونة من 8 خلايا لأنه يمكن بسهولة امتصاص MOs في التيار السيتوبلازمي لكيس الصفار بواسطة الخلايا النامية¹⁷^،¹⁸. في حقن البلازميد أو حقن mRNA المقطوعة ، يجب إجراء الحقن في بلاستومير واحد لجنين من مرحلة خلية واحدة.
انقل الأجنة إلى طبق بتري بوسط E3 واحتضانها عند 28 درجة مئوية حتى 3 dpf ، مع التجديد اليومي لوسط E3. في تلك المرحلة ، قم بإجراء تقييم النمط الظاهري باستخدام المجهر.
ملاحظة: يجب تخفيف محاليل MO بعناية لكل تحقيق لتحديد أقل تركيز مطلوب للحث على نمط ظاهري معين. يجب أيضا تحديد الفتك الجنيني لكل MOs. بتركيزات أعلى (أعلى من 4-10 نانوغرام ، اعتمادا على MO) ، تميل MOs إلى إثارة تأثيرات غير محددة ، مثل موت الدماغ أو الخلايا العامة.
قم بحقن MO مع 250 بيكوغرام من mRNA من اليد البشرية 2 بنفس الطريقة لتأكيد إنقاذ النمط الظاهري الناجم عن فقدان جين Hand2 لسمك الزرد بواسطة MO.

4. وصمة عار الغربية للتحقق من نجاح ضربة قاضية مورفولينو

اجمع الأجنة في نقاط زمنية محددة (48 حصانا ، 72 حصان) وقم بإزالة الأجنة إذا لزم الأمر باستخدام إنزيم بروناز.
إزالة صفار الأجنة لإزالة Vitellogenin باستخدام منهجية معروفة^{سابقا 19}.
ملاحظة: Vitellogenin هو بروتين سكري فوسفوليبو يعمل كمصدر للعناصر الغذائية للجنين المتنامي. أصبح الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد عالي الدقة والنشاف الغربي المحسن بشكل كبير ممكنا عن طريق إزالة صفار الأجنة وإزالة Vitellogenin.
قم بإجراء النشاف الغربي كما هو موضح سابقا²⁰.

5. هيكل القلب وتقييم وظيفته:

التصوير الحي لأسماك الزرد: تصوير البطين
ملاحظة: يمكن حساب العديد من معلمات وظائف القلب / ديناميكا الدم من خلال تصور القلب النابض لجنين الزرد²¹^،²². تشمل هذه المعلمات النتاج القلبي (CO) ، والكسر القذفي (EF) ، وحجم السكتة الدماغية (SV) ، والتقصير الجزئي (FS) ، وتغيير المنطقة الكسرية (FAC) (يرجى الاطلاع على الأوراق السابقة التي تتضمن بروتوكولات مفصلة لتقييم وظائف القلب لأجنة الزرد²²^،²³). تشرح الخطوات التالية بإيجاز كيفية حساب هذه المعلمات لأجنة أسماك الزرد عند ~ 3 dpf ، وهي المرحلة التي يكون فيها جلد هذه الكائنات شفافا ، مما يتيح التصور باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع.
1. ضع قطرة من محلول ميثيل السليلوز بنسبة 3٪ (RT) في شريحة تصوير البئر المقعرة.
2. ضع جنين الزرد في البئر باستخدام قطارة بلاستيكية مناسبة (الشكل 2 أ ، ب)
  ملاحظة: قد يؤدي الإفراط في ملء البئر إلى إزاحة الأسماك من البئر.
3. امزج برفق قطرة ميثيل السليلوز بنسبة 3٪ مع وسط E3 لتثبيت الجنين المفرغ.
  ملاحظة: لتحضير محلول ميثيل السليلوز بنسبة 3٪ ، قم بإذابة 3 جم من مسحوق ميثيل السليلوز في 100 مل من PBS ، أو وسائط التثبيت الأخرى ، في قارورة. ضع مغناطيس التحريك في قارورة الخليط وضع القارورة على لوح تقليب مغناطيسي. اضبط السرعة على "منخفضة" واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية لمدة ~ 1 يوم لإذابة جميع التكتلات. بمجرد إذابة ميثيل السليلوز تماما ، قم بتخزينه في أنابيب صغيرة وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
4. ضع السمكة على يسارها ، بحيث يكون جانبها الأيمن متجها لأعلى والنقطة الأمامية إلى اليسار لتسهيل التصوير الواضح للبطين (الشكل 2 ج).
5. تحت المجهر ، قم بتكبير قلب الجنين بتكبير 100x وابدأ التسجيل لمدة ~ 5 ثوان. تأكد من أن حدود البطين داخل نافذة التصوير (الشكل 2 د).
6. سجل أفلام الفاصل الزمني باستخدام كاميرا عالية السرعة ومجمهر مجسم بحوالي 100 إطار في الثانية (fps) من الجنين بأكمله (الشكل 2C) ، وضرب البطين (الشكل 2D) ، وتحريك خلايا الدم الحمراء (RBC) في الأوعية الرئيسية ، مثل الشريان الأورطي الظهري أو الوريد الكاردينال الخلفي (الشكل 2E) ، لتحليل وظائف القلب.
7. احفظ الفيلم إما بتنسيق فيلم AVI أو تنسيق تسلسلات صور TIFF (أو JPEG).
احسب معدل ضربات القلب
1. احسب الوقت اللازم لتسجيل إطارين متتاليين. بالنسبة إلى 100 إطارا في الثانية ، يساوي الفاصل الزمني 0.01 ثانية.
2. اختر نقطة معروفة من أي دورة قلبية مسجلة (مثل الانبساط النهائي أو الانقباض النهائي). احسب عدد الإطارات اللازمة لتكرار الدورة.
3. اضرب الفاصل الزمني من الخطوة 5.2.1 بعدد الأرتال من الخطوة 5.2.2. والنتيجة هي المدة الزمنية (بالثواني) لنبضة قلب واحدة.
4. لحساب النبضات في الدقيقة ، اقسم 60 على الرقم الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة. بالنسبة للأجنة الطبيعية 3 dpf ، يجب أن يكون هذا حوالي 150 نبضة في الدقيقة (2.5 هرتز).
  ملاحظة: يمكن للعديد من تطبيقات البرامج حساب معدل ضربات القلب تلقائيا من تسجيلات القلب النابض مثل ViewPoint²⁴ و DanioVision²⁵.
5. قم بتحليل بنية القلب باستخدام فيلم بفاصل زمني قياسي بحوالي 100 إطارا في الثانية لفحص القلب كله للكشف عن وجود وذمة قلبية أو أي عيب هيكلي آخر.
  ملاحظة: يوضح الشكل 3 أ قلبا جنينيا طبيعيا 3 dpf ، ويوضح الشكل 3 ب قلبا 3 dpf مصاب بوذمة قلبية وعيب في حلقة القلب (بطين ممدود).
احسب تغير المساحة الكسرية (FAC):
ملاحظة: تغيير المنطقة الجزئية (FAC) هو معلمة تستخدم لمقارنة مناطق الانبساط البطيني والانقباض النهائي لتقييم انقباض البطين.
1. استخدم فيلم بفاصل زمني قياسي بمعدل 100 إطارا في الثانية تقريبا لتحديد الإطارات التي تمثل دورة قلبية واحدة. استخرج الإطارات التي توضح نهاية كل من الانقباض النهائي والانبساط النهائي.
2. احسب كل من منطقة الانبساط النهائي (EDA) ومنطقة الانقباض النهائي (ESA) باستخدام ImageJ أو برنامج تحليل صور مشابه.
3. استخدم الصيغة التالية لحساب FAC²²^،²⁶^،²⁷:
  القوات المسلحه الكونغوليه
احسب التقصير الكسري (FS):
ملاحظة: التقصير الجزئي (FS) هو معلمة أخرى تستخدم لتقييم انقباض البطين. لتحديد FS, يجب قياس أقطار نهاية الانبساطي والانقباضي النهائي للبطينين²¹.
1. كرر الخطوة 5.3.1
2. استخدم ImageJ أو أي برنامج آخر لتحليل الصور المكافئ لقياس أقطار جدران البطين في الانبساط النهائي D_d ونقاط الانقباض النهائي D_s . في معظم الحالات ، يتم استخدام أقطار المحور القصير لتحديد النعومة الجزئية (FS) (الشكل 4).
3. استخدم الصيغة التالية لحساب FS^22,27:
  خ
حساب حجم السكتة الدماغية (SV):
ملاحظة: لكل نبضة قلب ، فإن SV هي كمية الدم التي يتم ضخها من البطين ، والتي يمكن حسابها بسهولة من أحجام الانبساط النهائي والانقباض النهائي^{للبطينين 28}.
1. كرر الخطوتين 5.3.1 و 5.3.2
2. قم بقياس أقطار الانبساط النهائي (D_L) و End-sytache (D_S) كما هو موضح في الشكل 4.
  ملاحظة: بافتراض أن بطيني قلوب الزرد لهما شكل كروي برولاتي²¹^،²² ، يتم حساب حجم البطين باستخدام الصيغة التالية.
  حجم
  يمكن حساب SV باتباع الصيغة^{أدناه 27}. نطاق SV الطبيعي هو 0.15-0.3 nL ل 2-6 dpf أجنة²⁹. هنا ، EDV هو حجم الانبساط النهائي ، و ESV هو حجم الانقباض النهائي.
  SV = (EDV - ESV)
احسب كسر القذف (EF):
ملاحظة: يعرف EF بأنه جزء الدم المخرج من البطين مع كل نبضة قلب²⁸.
1. من الصيغ المذكورة أعلاه ، استخرج EDV و ESV للأسماك.
2. احسب EF على النحو التالي²²^،²⁷:
  إي أف (٪)
احسب النتاج القلبي (CO):
ملاحظة: ثاني أكسيد الكربون هو حجم الدم الذي يضخه القلب²⁸. قيمة ثاني أكسيد الكربون 10-55 نانولتر / دقيقة ل 2-6 dpf الأجنة²⁹.
1. احسب SV و HR كما هو مذكور في القسمين الفرعيين السابقين 5.5 و 5.2.
2. استخدم الصيغة التالية لحساب ثاني أكسيد الكربون²²^،²⁷:
  ثاني أكسيد الكربون (nL / دقيقة) = SV (nL / beat) × HR (نبضات / دقيقة).
قياس سرعات كرات الدم الحمراء:
ملاحظة: يعد تحديد سرعة الخلايا أمرا حيويا لتقييم معدل التدفق وقطر الوعاء وحساب إجهاد القص الذي يمارس على الخلايا البطانية للوعاء الدموي (على سبيل المثال ، إجهاد القص ، من ناحية أخرى ، هو قوة الاحتكاك المفروضة على الخلايا البطانية عن طريق تحريك الدم). بالنسبة للأجنة 2-5 dpf ، يبلغ متوسط سرعة خلايا الدم الحمراء (RBC) حوالي 300-750 ميكرومتر / ثانية²⁹. لقياس سرعات كرات الدم الحمراء:
1. تحت المجهر ، قم بتكبير ذيل بتكبير 100x. يجب أن تكون حركة كرات الدم الحمراء مرئية عند هذا التكبير (الشكل 5 أ ، ب).
2. ابدأ التسجيل لمدة 8 ثوان تقريبا. تأكد من أن الشريان الأورطي الظهري (DA) والوريد القلبي الخلفي (PCV) ، وهما أهم شريانين محوريين ، يتراوحان بين 100 و 120 إطارا في الثانية داخل نافذة التصوير. تتبع الخلايا الفردية من الإطارات المتسلسلة (الشكل 5 أ ، ب).
3. استخرج عدة إطارات باستخدام ImageJ أو أي برنامج آخر مماثل لتحليل الصور.
4. احسب الفرق في المسافة التي يتحركها RBC الفردي (Δx).
5. حدد الفرق الزمني بين الإطارات المتتالية (Δt).
6. استخدم الصيغة التالية لسرعة كرات الدم الحمراء²²^،²⁷:
  سرعة كرات الدم الحمراء (ميكرومتر / ثانية)
  ملاحظة: يمكن استخراج السرعة القصوى والمتوسطة من تكرار الإطارات المتتالية للخلايا الفردية²¹. تمثل سرعة كرات الدم الحمراء أيضا سرعة تدفق الدم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من تطبيقات البرامج المتاحة تجاريا لقياس سرعة كرات الدم الحمراء تلقائيا. ViewPoint²⁴ ، وكذلك DanioVision²⁵ ، لهما مثل هذه التطبيقات (الشكل 5 ج). علاوة على ذلك ، هناك عدد قليل من المكونات الإضافية المتاحة مع ImageJ ، مثل TrackMate³⁰ و MTrackJ³¹ ، المتوافقة مع الأفلام المسجلة فوق 100 إطارا في الثانية.
حساب إجهاد القص من سرعات الخلايا المقاسة
تمثل سرعات كرات الدم الحمراء المقاسة في الأوعية الدموية أيضا سرعات تدفق الدم (الشكل 5 ج). من هذه القياسات ، احسب إجهاد القص τ في وعاء ذي أهمية على النحو التالي مع افتراض تدفق Poiseuille²²^،²⁷:

حيث V هو متوسط سرعة الدم (ميكرومتر / ثانية) ، μ هو لزوجة الدم (داينز / سم²) ، و D هو قطر الوعاء الدموي (ميكرومتر). بالنسبة إلى 3 أجنة dpf ، يبلغ إجهاد القص في DA²²^،²⁶^،²⁷ حوالي 4 داينات / سم².

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الرسم البياني في الشكل 6 متوسط النسبة المئوية للأجنة الباقية على قيد الحياة عند 24 و 48 و 72 حصانا لكل من MO الخاص ب HAND2 والأجنة المخفوقة المحقونة MO. أظهرت الأجنة المحقونة بمقدار 1 ملي مولار (8 نانوغرام / ميكرولتر) و 0.8 ملي مولار (6.4 نانوغرام / ميكرولتر) انخفاضا كبيرا في نسبة البقاء على قيد الحياة مقارنة بالأجنة المخفوقة المحقونة بالمو. لوحظ ذلك عبر كل نقطة زمنية مقاسة حيث لوحظ الفتك أو التشوه. أشارت النتائج إلى أن التركيز العالي ل HAND2MO كان له نسبة بقاء أقل بكثير بسبب التأثيرات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام تقنية Morpholino (MO) على نطاق واسع في أسماك الزرد ، xenopus ، قنافذ البحر ، ومؤخرا في أنظمة نماذج زراعة الخلايا. مع معظم الطرق ، إلى جانب الفوائد ، هناك أيضا مزالق يجب أن يكون المجرب على دراية بها. تتضمن إحدى المزالق الرئيسية في تقنية MO القلق من أن تأثيرات النمط الظاهري التي لوحظها نهج ضربة قاضية للجينات بوساطة MO لا ترجع إلى فقدان الوظيفة المرتبطة بمنتج الجين الأساسي ولكن بعض الجينات الأخرى جنبا إلى جنب مع الجين الأساسي أو مستقلة عن الجين الأساسي الذي تم استهدافه ، وبالتالي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن المصالح المالية أو غيرها من تضارب المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت تغطية نشر هذا المقال بدعم سخي من BARZAN HOLDINGS. يتم دعم RR جزئيا من خلال R61HL154254 وأموال من قسم طب الأطفال ومستشفى الأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أكريلاميد 40٪	سيجما	سيجما ، القط رقم C977M88
Agarose	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. رقم A9539-250G
All Prep DNA / RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen cat. رقم 80204.
ألفا توبولين	أبكام	أبكام- ab4074	أرنب متعدد النسيلة إلى ألفا توبولين الكثير GR3 180877-1 (50 كيلو دالتون)
بيرسلفات الأمونيوم الصف الجزيئي	سيجما	سيجما ، القط لا C991U65
BV10 الشعيرات الدموية شطبة	أدوات سوتر أدوات المنتج	كتالوج المنتجات # BV10
الكيميائي التصوير جين جنوم	SYNGENE SYNGENE
CVS10D_OmniPAGEMini Cleaver Scientific Blotting		CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. لا C861C44
مجموعة التلألؤ الكهربائي الكيميائي (ECL)	Abcam Biochemicals	Abcam Biochemicals cat. no ab65623
Glycine	Sigma	Sigma، cat. no C988U91
Goat Anti Rabbit	Abcam	Abcam- ab6721	الماعز المضاد للأرانب IgG H& L (HRP) 2^{nd< / sup> الأجسام المضادة الكثير GR3179871-1}
HAND2	أدوات الجينات	مصنوعة خصيصا ل HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAACTGGCGAC AG-3'Hand2
	Abcam	Abcam- ab10131	الكثير من الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب المضادة ل HAND2 GR143200-9 (24-26 كيلو دالتون)
HAND2 (NM_021973) الكلمات الدلالية البشرية ORF استنساخ	OriGene Technologies، Inc	RC224436L3	ناقلات: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092) IBI
DNA / RNA / طقم استخراج البروتين	IBI Scientific IBI	Scientific cat. no -r IB47702
نظام التصوير	iBright	iBright CL1000 نظام التصوير
Isopropanol	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. رقم 278475-2L
Laemmli عازل تحميل العينة (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. رقم 70607
Mercaptoethanol	Sigma	Sigma ، cat. لا M6250-1L
مقياس الطيف الضوئي المجهري مع واجهة برنامج تحليل البيانات Gen5			مجهر
	عصر Ziess SteREO Lumar V12 مجهر فلورسكوب	Ziess SteREO Lumar V12 مجهر
المعدني	فيشر العلمي	القط العلمي. رقم 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7 / T3 / SP6 طقم النسخ	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. لا. AM1340	لتوليد mRNA
المياه الخالية من Nuclease	New England Biolabs	New England Biolabs cat. رقم B1500L
PC-100 مجتذب الماصات	الدقيقة NARISHIGE GROUP المنتج	كتالوج منتجات NARISHIGE GROUP # PC-100
Phenol Red	Sigma	Sigma ، cat. No. P-0290
Picolitre Injector	Harvard Apparatus	Harvard Appliance Cataloge # PLI-90A
فحص البروتين بيرس بيسنشونيك (BCA)	قطة ثيرمو فيشر ثيرمو	23227
PMSF ، مثبط البروتياز كمثبطات للبروتياز	قطة ثيرمو فيشر	فيشر رقم 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich-Aldrich-Aldrich	cat. لا 10165921001
مثبطات البروتياز كوكتيل	ثيرمو فيشر	ثيرمو فيشر القط رقم 88668
سلم البروتين	SMOBiO	SMOBiO cat. لا PM2500
مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA)	قطة ثيرمو فيشر	الحرارية رقم 89900
Ringer s حل	كتالوج Thermofisher	رقم S25513
SDS	Sigma Sigma	، cat. لا 436143
أدوات الجينات	للتحكم القياسي	SKU: PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTT A-3'- التي تستهدف طفرة بيتا جلوبين إنترون بشرية
تجريد المخزن المؤقت	Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich-Aldrich	cat. 21059
Temed	القط العلمي IBI	IBI لا C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no BP-152-500
Tween	sigma Life Science	sigma Life Science cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Track System Chamber مع برنامج EthoVision XT 11.5	Noldus Information Technology و NL	Noldus Information Technology و NL
Zeiss أكسيوكام ERc 5s	زايس	ستيمي 508 زايس
زايس ستيمي 2000-سي	زايس	ستيمي 2000-C

التصوير عصر فلورسكوب الزيوت فيشر مجموعة فيشر رقم الحرارية العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
Eve, A. M., Place, E. S., Smith, J. C. Comparison of Zebrafish tmem88a mutant and morpholino knockdown phenotypes. PLoS One. 12 (2), 0172227(2017).
Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Developmental Biology. 331 (2), 237-249 (2009).
Chen, Z., et al. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovascular Research. 79 (1), 97-108 (2008).
Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
Reichenbach, B., et al. Endoderm-derived Sonic hedgehog and mesoderm Hand2 expression are required for enteric nervous system development in zebrafish. Developmental Biology. 318 (1), 52-64 (2008).
Maves, L., Tyler, A., Moens, C. B., Tapscott, S. J. J. Pbx acts with Hand2 in early myocardial differentiation. Developmental Biology. 333 (2), 409-418 (2009).
Hinits, Y., et al. Zebrafish Mef2ca and Mef2cb are essential for both first and second heart field cardiomyocyte differentiation. Developmental Biology. 369 (2), 199-210 (2012).
Gene Tools, custom-sequence Morpholinos. , Available from: https://oligodesign.gene-tools.com/ (2011).
hand2 heart and neural crest derivatives expressed 2 [ Danio rerio (zebrafish). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58150 (2021).
Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_131626.3 (2021).
NCBI reference sequence -Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA FASTA. , hand2), mRNA FASTA at (2021). Prepared control oligos at (2021).
Prepared control oligos. , Available from: https://store.gene-tools.com/prepared-control-oligos (2021).
Schubert, S., Keddig, N., Hanel, R., Kammann, U. Microinjection into zebrafish embryos (Danio rerio)-a useful tool in aquatic toxicity testing. Environmental Sciences Europe. 26 (1), 32(2014).
Moulton, J. D. Guide for morpholino users: toward therapeutics. Journal of Drug Discovery, Development, and Delivery. 3 (2), 1023(2016).
Link, V., Shevchenko, A., Heisenberg, C. -P. Proteomics of early zebrafish embryos. BMC Developmental Biology. 6 (1), 1(2006).
Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiological Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Developmental Dynamics: An Officical Publication of the American Association of Anatomists. 246 (11), 868-880 (2017).
Zakaria, Z. Z., et al. Using zebrafish for investigating the molecular mechanisms of drug-induced cardiotoxicity. Biomed Research International. 2018, 1642684(2018).
Parker, T., et al. A multi-endpoint in vivo larval zebrafish (Danio rerio) model for the assessment of integrated cardiovascular function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (1), 30-38 (2014).
Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), 0151148(2016).
Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
Benslimane, F. M., et al. Cardiac function and blood flow hemodynamics assessment of zebrafish (Danio rerio) using high-speed video microscopy. Micron. 136, 102876(2020).
DeGroff, C. G. Doppler echocardiography. Pediatric Cardiology. 23 (3), 307-333 (2002).
Bagatto, B., Burggren, W. A three-dimensional functional assessment of heart and vessel development in the larva of the zebrafish (Danio rerio). Physiological and Biochemical Zoology. 79 (1), 194-201 (2005).
Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods (San Diego, Calif.). 115, 80-90 (2017).
Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
Sumanas, S. Inducible inhibition of gene function with photomorpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 51-57 (2017).
Kyritsi, K., et al. Knockdown of hepatic gonadotropin-releasing hormone by vivo-morpholino decreases liver fibrosis in multidrug resistance gene 2 knockout mice by down-regulation of miR-200b. The American Journal of Pathology. 187 (7), 1551-1565 (2017).
Flynt, A. S., Rao, M., Patton, J. G. Blocking zebrafish microRNAs with morpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 59-78 (2017).
Schoenebeck, J. J., Keegan, B. R., Yelon, D. Vessel and blood specification override cardiac potential in anterior mesoderm. Developmental Cell. 13 (2), 254-267 (2007).
Lu, F., Langenbacher, A., Chen, J. -N. Transcriptional regulation of heart development in zebrafish. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 14(2016).
Laurent, F., et al. HAND2 target gene regulatory networks control atrioventricular canal and cardiac valve development. Cell Reports. 19 (8), 1602-1613 (2017).
Miura, G. I., Yelon, D. A guide to analysis of cardiac phenotypes in the zebrafish embryo. Methods in Cell Biology. 101, 161-180 (2011).
De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA

تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة