التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

تستخدم مقصورات الدهون ثنائية الطبقة كخلايا اصطناعية نموذجية لدراسة التفاعلات العضوية المغلقة والعمليات القائمة على الأغشية أو كوحدات حاملة في تطبيقات توصيل الأدوية ^1,2. تتطلب البيولوجيا من أسفل إلى أعلى مع المكونات النقية الحد الأدنى من الأنظمة التجريبية لاستكشاف الخصائص والتفاعلات بين الجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون ^3,4. ومع ذلك ، مع تقدم هذا المجال ، هناك حاجة متزايدة لأنظمة تجريبية أكثر تعقيدا تقلد بشكل أفضل الظروف في الخلايا البيولوجية. التغليف في GUVs هو نهج عملي يمكن أن يوفر بعض هذه الخصائص الشبيهة بالخلايا من خلال توفير طبقة ثنائية من الدهون قابلة للتشوه ونفاذية بشكل انتقائي ومساحة تفاعل ضيقة. على وجه الخصوص ، في المختبر إعادة تشكيل الأنظمة الهيكلية الخلوية ، كنماذج للخلايا الاصطناعية ، يمكن أن تستفيد من التغليف في مقصورات الغشاء⁵. ترتبط العديد من البروتينات الهيكلية الخلوية وتتفاعل مع غشاء الخلية. نظرا لأن معظم التجميعات الهيكلية الخلوية تشكل هياكل تمتد عبر كامل الخلية ، يتم تحديد شكلها بشكل طبيعي بواسطة الحبس بحجم الخلية⁶.

يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد GUVs ، مثل التورم ^7,8 ، واندماج الحويصلة الصغيرة^9,10 ، ونقل المستحلب^11,12 ، والنفث النبضي 13 ، وغيرها من طرق الموائع الدقيقة ^14,15. على الرغم من أن هذه الأساليب لا تزال تستخدم ، إلا أن لكل منها حدودها. وبالتالي ، فإن اتباع نهج قوي ومباشر مع غلة عالية من تغليف GUV أمر مرغوب فيه للغاية. على الرغم من أن تقنيات مثل التورم التلقائي والتورم الكهربائي معتمدة على نطاق واسع لتشكيل GUVs ، إلا أن هذه الطرق متوافقة في المقام الأول مع تركيبات الدهون المحددة¹⁶ ، والمخازن المؤقتة منخفضة تركيز الملح 17 ، والحجم الجزيئي المغلف الأصغر¹⁸ ، وتتطلب حجما كبيرا من الكفائف. إن دمج العديد من الحويصلات الصغيرة في GUV غير موات بطبيعته ، مما يتطلب خصوصية في تركيبات الدهون المشحونة⁹ و / أو العوامل الخارجية المسببة للاندماج ، مثل الببتيدات¹⁹ أو غيرها من المواد الكيميائية. من ناحية أخرى ، قد يتطلب نقل المستحلب وطرق الموائع الدقيقة تثبيت القطيرات من خلال إزالة الفاعل بالسطح والمذيبات بعد تكوين الطبقة الثنائية ، على التوالي^18,20. يفرض تعقيد الإعداد التجريبي والجهاز في تقنيات الموائع الدقيقة مثل النفث النبضي تحديا إضافيا²¹. cDICE هي طريقة قائمة على المستحلب مشتقة من مبادئ مماثلة تحكم نقل المستحلب^22,23. يتم تقسيم المحلول المائي (المحلول الخارجي) وخليط الدهون والزيت إلى طبقات بواسطة قوى الطرد المركزي في غرفة أسطوانية دوارة (غرفة cDICE) تشكل واجهة مشبعة بالدهون. يؤدي نقل قطرات مائية أحادية الطبقة من الدهون إلى غرفة cDICE الدوارة إلى سحاب طبقة ثنائية الطبقة حيث تعبر القطرات الواجهة المشبعة بالدهون إلى المحلول المائي الخارجي^22,24. نهج cDICE هو تقنية قوية لتغليف GUV. مع الطريقة المعدلة المقدمة ، لا يتم تحقيق غلة الحويصلة العالية النموذجية ل cDICE مع وقت تغليف أقصر بكثير (بضع ثوان) فحسب ، بل يتم تقليل وقت توليد GUV الذي يسمح بمراقبة العمليات المعتمدة على الوقت (على سبيل المثال ، تكوين شبكة actin cytoskeletal network) بشكل كبير. يستغرق البروتوكول حوالي 15-20 دقيقة من البداية إلى جمع GUV وتصويرها. هنا ، يتم وصف توليد GUV باستخدام طريقة cDICE المعدلة لتغليف الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs). ومع ذلك ، فإن التقنية المقدمة قابلة للتطبيق لتغليف مجموعة واسعة من التفاعلات البيولوجية والتفاعلات الغشائية ، من تجميع البوليمرات الحيوية إلى التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا إلى نقل البضائع القائمة على الاندماج الغشائي.

1. إعداد خليط الزيت والدهون

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة في غطاء الدخان باتباع جميع إرشادات السلامة للتعامل مع الكلوروفورم.

1. خذ 0.5 مل من الكلوروفورم في قارورة زجاجية سعة 15 مل. أضف 88 ميكرولتر من 25 ملغم / مل من ثنائي oleoyl-phosphocholine (DOPC) ، و 9.3 ميكرولتر من 50 ملغ / مل من الكوليسترول ، و 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من ديولويل - فوسفويثانولامين - ليسامين رودامين B (رودامين PE) (انظر جدول المواد) إلى القارورة الزجاجية سعة 15 مل.
   ملاحظة: أجزاء الخلد النهائية من DOPC والكوليسترول في زيت السيليكون / الزيت المعدني هي 69.9٪ و 30٪ على التوالي. ثبت أن 20-30 مول ٪ من الكوليسترول هو تركيز محسن لسيولة الغشاء واستقرار GUVs المتولدة باستخدام التقنية المقدمة^25,26. من الناحية الفسيولوجية ، هذه القيم تقع ضمن نطاق تركيز الكوليسترول الموجود في أغشية بلازما خلايا الثدييات⁶. يتم الحصول على مخزونات الدهون كحلول في الكلوروفورم وتخزينها في -20 درجة مئوية. يجب أن تتأقلم قوارير مخزون الدهون مع درجة حرارة الغرفة قبل فتحها.
2. ماصة 7.2 مل من زيت السيليكون و 1.8 مل من الزيت المعدني في قارورة ثانية سعة 15 مل (انظر جدول المواد). بشكل عام ، يجب القيام بذلك في صندوق قفازات منخفض الرطوبة ، خاصة إذا تم إعادة استخدام الزيت المعدني.
3. امزج الزيوت عن طريق الدوامة بسرعة دوران قصوى (3200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 ثوان ، وأضف الخليط إلى القارورة التي تحتوي على خليط الدهون في الكلوروفورم وضعه على الفور على خلاط الدوامة. دوامة لمدة 10-15 ثانية عند أقصى سرعة دوران (3200 دورة في الدقيقة). يجب أن يكون مزيج الدهون في الزيت الناتج غائما قليلا ، حيث لا يتم إذابة الدهون بالكامل في الزيت ولكن يتم تشتيتها على شكل مجاميع صغيرة²⁴.
4. ضع تشتت الدهون في الزيت في سونيكتور الحمام (انظر جدول المواد) بقوة بالموجات فوق الصوتية تبلغ 80 واط وتردد تشغيل 40 كيلو هرتز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استخدم الخليط على الفور أو خزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة.

2. توليد الحويصلة

1. قم بتركيب العمود المطبوع ثلاثي الأبعاد (الملف التكميلي 1) المصنوع من الراتنج الأسود (انظر جدول المواد) على لوحة التحريك على الطاولة واضبط سرعة الدوران على 1200 دورة في الدقيقة.
2. قم بتركيب غرفة cDICE المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 2) المصنوعة من راتنج شفاف (انظر جدول المواد) على العمود (الشكل 1A ، B).
3. تحضير محاليل الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABP) بشكل منفصل في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
   1. تحضير 1-10 ميكرومتر من الأكتين في المخزن المؤقت الكروي للأكتين (G-buffer)، بما في ذلك 10٪ ATTO 488 أكتين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت G-1x من 5 ملليمتر من Tris-HCl والرقم الهيدروجيني 8.0 و0.2 ملليمتر من CaCl₂.
   2. أضف المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين الخيطية (F-buffer) لبدء بلمرة الأكتين على الجليد. احتفظ بالمحاليل على الجليد لإبطاء بلمرة الأكتين قبل إضافة رابط متقاطع.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت F-1x على 50 ملليمتر من KCl و2 ملليمتر من MgCl₂ و3 ملليمتر من ATP في 10 ملليمتر من Tris، والرقم الهيدروجيني 7.5.
   3. انتظر لمدة 15 دقيقة للسماح ببدء بلمرة الأكتين على الجليد قبل إضافة روابط متقاطعة ذات أهمية عند النسبة المولية المطلوبة. احتفظ بالمحلول على الجليد حتى تغليفه.
   4. تحضير البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) بشكل منفصل في أنبوب دقيق (الشكل 1C).
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة عندما يتم تغليف مجموعة من ABPs (على سبيل المثال ، myosin ، α-actinin ، fascin ، Arp2/3 complex) مع actin^25,26,27. وفي مثل هذه الحالات، تسحب الكمية المطلوبة من كل برنامج من برامج الجسر الأكاديمي من مخزونها وتضاف إلى الأنبوب الدقيق المخصص لبرامج الجسر الأكاديمي. وبما أن الحل الكلي يجب أن يكون 20 ميكرولتر، يجب تحضير الحصص المخزونية من ABPs بحيث لا تتجاوز الكمية المطلوبة من خليط ABP الكلي 5-6 ميكرولتر. وبرنامج الجسر الأكاديمي الوحيد المستخدم في النتائج التمثيلية هنا هو الافتتان، الذي يرد أدناه ذكر إعداده.
      1. Aliquot 1.57 ميكرولتر من اللفافة من 1.75 ملغم / مل من مخزون اللفافة (انظر جدول المواد) ، وإضافة مباشرة إلى محلول الأكتين في الخطوة 2.7. هذا يتوافق مع 2.5 ميكرومتر من اللفافة في المحلول.
4. أضف 7.5٪ من وسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) إلى محلول الأكتين لإنشاء تدرج كثافة بين الطور المائي الخارجي والداخلي لتسهيل ترسيب GUV.
5. استغني عن 700 ميكرولتر من المحلول الخارجي البالغ 200 مللي متر من الجلوكوز في الغرفة (الشكل 1D ، إلى اليسار).
   ملاحظة: تحدد الأسمولية للمحلول الداخلي تركيز الجلوكوز. بالنسبة لهذه التجارب ، تبلغ أسمولية المحلول الداخلي ~ 200 mOsm ، لذلك يتم استخدام محلول الجلوكوز 200 mM كمحلول خارجي.
6. أضف كمية كافية من خليط زيت الدهون (>3 مل بناء على حجم الغرفة) إلى الغرفة حتى يتم ملء 60٪ -80٪ من الغرفة (الشكل 1D ، يمين). سيتم تشكيل واجهة بين خليط الدهون والزيت والمحلول الخارجي.
7. نقل ABPs (المعدة في الخطوة 2.3.4) إلى محلول الأكتين. باستخدام ماصة منتظمة 100-1000 ميكرولتر ، انقل على الفور 700 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى خليط الأكتين - ABP (الشكل 1E ، اليسار). ماصة لأعلى ولأسفل 8 مرات لتوليد قطرات أحادية الطبقة من الدهون بحجم الخلية بقطر يتراوح بين 7-100 ميكرومتر (الشكل 1E ، الوسط).
   ملاحظة: يجب إكمال الخطوة 2.7 في بضع ثوان لتجنب أي تجميع لشبكة actin قبل التغليف. وبالتالي ، قبل تنفيذ الخطوة ، تأكد من إدخال أطراف الماصة بالفعل في الماصات وجاهزة لنقل الخلائط.
8. باستخدام نفس الماصة 100-1000 ميكرولتر ، قم على الفور بتوزيع المستحلب بأكمله في الغرفة الدوارة. ستحصل القطرات على نشرة ثانية من الدهون عن طريق عبور الطبقة الأحادية الدهنية في واجهة المحلول الخارجي للزيت ، وبالتالي تشكيل GUVs (الشكل 1E ، إلى اليمين).
9. قم بإزالة الغرفة من لوحة التحريك وتخلص من معظم خليط الزيت الدهني عن طريق إمالة الغرفة في حاوية النفايات بحيث يتم تصريف جزء كبير من خليط زيت الدهون من الفتحة الكبيرة في وسط الغرفة.
   ملاحظة: بهذه الطريقة ، يتم سحب خليط زيت الدهون خارج الغرفة ، وتجنب خلط خليط الدهون والزيت مع المحلول الخارجي في الخطوة التالية.
10. أمسك الغرفة مع توجيه غطائها نحو المستخدم. افتح غطاء الغرفة وقم بإمالة الغرفة قليلا نحو المستخدم. يمكن رؤية الواجهة بين المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وخليط زيت الدهون من فتحة الغرفة (حيث يوجد الغطاء).
11. باستخدام ماصة ، قم بجمع ما يكفي من المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وتوزيع 50-300 ميكرولتر من المحلول الخارجي في صفيحة 96 بئرا للحصول على كثافة مناسبة من GUVs.
    ملاحظة: بعد هذا البروتوكول ، يتم إطلاق ما مجموعه حوالي 2 × 10⁵ GUVs في المحلول الخارجي داخل الغرفة. ولم يتم تحديد تشتت الاتحاد العام الفنزويلي الموحد؛ ومع ذلك ، فإن قطر حوالي 90 ٪ من GUVs في حدود 12-30 ميكرومتر. اعتمادا على وسط تدرج الكثافة المغلف ، وحجم GUV ، وعمق المحلول في لوحة البئر ، يستغرق الأمر من 2 إلى 15 دقيقة حتى تستقر GUVs على السطح. يبلغ عائد GUVs مع حزم الأكتين المعاد تشكيلها حوالي 90٪.

3. التصوير وإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد

1. قم بإعداد لوحة البئر 96 على مسرح مجهر مقلوب مجهز بقرص دوار (أو مسح ضوئي بالليزر) وحدة بؤرية ، وكاميرا EMCCD أو كاميرا sCMOS ، وعدسة موضوعية لغمر الزيت 60x (انظر جدول المواد).
2. ركز على أي منطقة ذات أهمية (ROI) والتقط تسلسل صور z-stack من عائد الاستثمار مع فاصل زمني z-step يبلغ 0.5 ميكرومتر.
   ملاحظة: نظرا لأن GUVs يمكن إزاحتها قليلا على السطح بمرور الوقت ، فمن المستحسن التقاط مجموعة متعددة الأطوال الموجية من الصور في كل مستوى z إذا تم تصوير العديد من الفلوروفورات ، أي التقاط مجموعة من صور 561 نانومتر و 488 نانومتر في كل حارة z في وقت واحد لالتقاط صور ATTO 488 actin و Rhod PE.
3. احفظ كل تسلسل صور z-stack بتنسيق .tiff.
4. افتح تسلسل صور ذي أهمية في برنامج معالجة صور (ImageJ/Fiji). حدد الصورة بأعلى كثافة. اضغط باستمرار على "ctrl + shift + c" لفتح نافذة السطوع والتباين وانقر فوق إعادة تعيين.
5. من قائمة ImageJ/Fiji، انتقل إلى تحليل > تعيين المقياس وأدخل المسافة الفعلية المعروفة ووحدتها لكل بكسل صورة.
6. من القائمة ImageJ/Fiji، انتقل إلى Image > Stacks > 3D لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد من المكدس z. قم بتعيين "طريقة الإسقاط" كنقطة سطوع، و"تباعد الشرائح (μm)" ك 0.5، ووضع علامة اختيار Interpolate. يمكن استخدام الخيارات الافتراضية لبقية الإعدادات.
   ملاحظة: قد لا تتم معايرة الفواصل الزمنية z في بعض المجاهر ، وقد تختلف الحركة الفعلية في اتجاه z اختلافا طفيفا عن الفاصل الزمني z الذي تم إدخاله (أي 0.5 ميكرومتر). في مثل هذه الحالات ، يمكن استخدام عينة معايرة 3D مثل المجهر الفلورسنت بقطر معروف للحصول على الفاصل الزمني z الفعلي. وبالتالي سيتم استخدام هذه القيمة ك "تباعد الشرائح (μm)" للإسقاط 3D.

لإثبات النجاح في توليد GUVs الهيكلية الخلوية باستخدام البروتوكول الحالي ، أعيد تشكيل هياكل حزم fascin-actin في GUVs. Fascin هو رابط متقاطع قصير من خيوط الأكتين التي تشكل حزم أكتين متوازية صلبة ويتم تنقيتها من E. coli كبروتين اندماج Glutathione-S-Transferase (GST)26. تم إعادة تشكيل 5 ميكرومتر من الأكتين لأول مرة ، بما في ذلك 0.53 ميكرومتر من الأكتين ATTO488 في المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين و 7.5٪ من وسط تدرج الكثافة. عند إضافة اللفافة بتركيز 2.5 ميكرومتر وتغليف خليط الأكتين الفاشي ، تم تشكيل هياكل حزمة الأكتين في GUVs. تم التقاط تسلسلات الصور البؤرية Z-stack لهياكل حزمة الأكتين المغلفة في GUVs المسماة ب PE rhodamine بعد 1 ساعة من التغليف (الشكل 2A). باستخدام هذا البروتوكول ، تم إثبات المنافسة المتأصلة وفرز روابط الأكتين المتقاطعة المغلفة ، α-actinin ، و fascin ، والتي ، معا ، تشكل أنماطا مختلفة من حزم الأكتين بطريقة تعتمد على حجم GUV ، في السابق26.

مثل نهج المستحلب المقلوب المعدل المقدم هنا ، تولد عملية cDICE التقليدية GUVs ذات الهيكل الخلوي ذات العائد العالي ولكنها تتطلب مضخة حقنة وإعداد أنابيب للحقن المتحكم فيه لمحلول البروتين في الغرفة الدوارة بمعدلات تدفق منخفضة بترتيب نانولتر في الثانية22,28. في هذا النهج ، يتم إنشاء المستحلب مباشرة في غرفة cDICE الدوارة ؛ يتم إدخال الشعيرات الدموية رقيقة في مرحلة الزيت. يتم حقن محلول البروتين من خلال مضخة حقنة. تتشكل القطرات ويتم قصها عند الطرف الشعري قبل أن تنتقل نحو المرحلة الخارجية المائية ، حيث تتحول إلى GUVs ، على غرار الطريقة الموضحة أعلاه. ويبين الشكل 2 باء الحويصلات التي تغلف خليط التفاعل باستخدام هذا النهج. يحتوي مزيج التفاعل على 6 ميكرومتر من الأكتين الذي يتم تجميعه بواسطة 0.9 ميكرومتر من الفاكن. هنا ، لا تتم مقارنة الطريقتين ونتائجهما ولكن لاحظ أنهما يولدان عائدا عاليا من GUVs.

الشكل 1: الإعداد التجريبي لتوليد GUVs . (أ) العرض العلوي وعرض القسم الجانبي لغرفة cDICE. (ب) صور الإعداد لغرفة الغزل. (ج-هاء) الرسوم التوضيحية التخطيطية للإجراءات التدريجية لتوليد المركبات متعددة الرسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تغليف هياكل حزمة الأكتين. (أ) تظهر الصور شرائح متحدة البؤرة التألق التمثيلية من الكائنات متعددة الاستخدامات (يسار) وإسقاطات قصوى لكومة z-stack متحدة البؤرة من قنوات الأكتين والدهون (يمين). اللفافة ، 2.5 ميكرومتر ؛ الأكتين ، 5 ميكرومتر (بما في ذلك 10 ٪ ATTO 488 أكتين). شريط المقياس = 10 ميكرومتر (B) تغليف هياكل حزمة الأكتين باستخدام cDICE التقليدي. تظهر الصورة إسقاطا أقصى تمثيليا لصور التألق البؤري لحزم الأكتين المغلفة التي تشكلت في وجود الفاكن. اللفافة ، 0.9 ميكرومتر ؛ Actin, 6 μM. Scale bar = 10 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1: تصميم رمح مطبوع 3D. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تصميم غرفة cDICE المطبوعة ثلاثية الأبعاد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.