هنا ، نقترح بروتوكولا منهجيا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوروريسين ثنائي الفلور 2′,7′ (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). تحدد هذه الطريقة إجمالي مستويات ROS الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذا البروتوكول سهل الاستخدام للغاية ومناسب وقابل للتكرار.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توازن الأكسدة والاختزال له دور مهم في الحفاظ على التوازن الخلوي. يعزز الجيل المتزايد من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تعديل البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما قد يؤدي في النهاية إلى تغيير في الوظيفة الخلوية وموت الخلايا. لذلك ، من المفيد للخلايا زيادة دفاعها المضاد للأكسدة استجابة للإهانات الضارة ، إما عن طريق تنشيط مسار مضاد للأكسدة مثل Keap1 / Nrf2 أو عن طريق تحسين زبالات الأكسدة والاختزال (الفيتامينات A و C و E β كاروتين والبوليفينول ، من بين أمور أخرى). يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي في التسبب في اعتلال الشبكية وتطوره ، مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) واعتلال الشبكية الخداجي (ROP). نظرا لأن خلايا مولر الدبقية (MGCs) تلعب دورا رئيسيا في توازن أنسجة الشبكية العصبية ، فإنها تعتبر نموذجا مثاليا لدراسة آليات الحماية الخلوية هذه. وبهذا المعنى ، فإن تحديد مستويات ROS كميا بطريقة بسيطة وقابلة للتكرار أمر ضروري لتقييم مساهمة المسارات أو الجزيئات التي تشارك في آلية الدفاع عن الخلايا المضادة للأكسدة. في هذه المقالة ، نقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس ROS باستخدام مسبار DCFH-DA وقياس التدفق الخلوي في MGCs. يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج هنا ، بحيث سيتمكن القراء من قياس مستويات ROS (الوسائل الهندسية ل FITC) وتحليل الرسوم البيانية الفلورية. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم ليس فقط الزيادة في ROS بعد إهانة خلوية ولكن أيضا لدراسة التأثير المضاد للأكسدة لبعض الجزيئات التي يمكن أن توفر تأثيرا وقائيا على الخلايا.
المقدمة
الشبكية العصبية هي نسيج منظم للغاية يقدم طبقات عصبية محددة جيدا. في هذه ، ترتبط الخلايا العصبية (العقدة ، الأمكرين ، الخلايا ثنائية القطب ، الأفقية ، والمستقبلات الضوئية) ببعضها البعض وكذلك مع خلايا مولر الدبقية (MGCs) والخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى نقل ضوئي كاف ومعالجة المعلومات البصرية 1,2. من المعروف أن MGCs لها دور مهم في الحفاظ على توازن الشبكية لأنها تعبر قسم الشبكية بأكمله ، وبالتالي ، يمكنها التفاعل مع جميع أنواع الخلايا التي تعدل عمليات الحماية المتعددة. وقد أفيد أن MGCs لديها العديد من الوظائف الهامة للحفاظ على وبقاء الخلايا العصبية الشبكية ، بما في ذلك تحلل السكر لتوفير الطاقة للخلايا العصبية ، وإز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: للحصول على تركيبات المخزن المؤقت، راجع الجدول 1.
1. إعداد زراعة الخلايا
ملاحظة: فيما يلي التحضير الاستزراعي لخلايا MIO-M1 ، وهو خط خلايا دبقية بشري مخلد تلقائيا من مولر (مورفيلد / معهد طب العيون - مولر 1). استخدم دائما تقنية التعقيم المناسبة واعمل في غطاء تدفق صفائحي.
- قم بإعداد وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) وسط كامل. إلى DMEM التي تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز D و 110 مجم / لتر من بيروفات الصوديوم ، أضف 10٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ، و 2 mM L-glutamine ، و 50 U / mL penicillin / streptomy....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كما هو موضح في قسم البروتوكول ، أظهرنا بيانات تمثيلية وكمية توضح اكتشاف التدفق الخلوي لإنتاج ROS باستخدام مسبار التألق DCFH-DA من خلايا MIO-M1 التي تم تحفيزها باستخدام محفز ROS ، A أو B. كما هو متوقع ، لاحظنا تغيرات في تألق FITC في الخلايا غير المحفزة فوق مستويات التألق الذاتي (الشكل 1A ، قارن "التحكم القاعدي" مقابل "التحكم في التألق الذاتي" ، الرسم البياني للمخططات النقطية). حدث هذا بسبب الإنتاج القاعدي ل ROS في خلايا MIO-M1. (الشكل 1 ب، قارن بين "التحكم القاعد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان والأمراض الالتهابية ونقص التروية / التروية وأمراض القلب الإقفارية والسكري واعتلال الشبكية ، وكذلك الحالات الفسيولوجية مثل الشيخوخة ، تؤدي إلى فرط إنتاج ROS6،7،8،9،10،11. لذلك ، فإن اكتشاف وقياس وفهم المسار الذي ينطوي عليه تعديل ROS هي أهداف مهمة للعديد من الأمراض. يمكن الوصول إلى استخدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يشكرا ماريا بيلار كريسبو وبولا أليخاندرا أبادي من مركز البحوث في مجال الكيمياء الحيوية وعلم الاندماج، كونيسيت - أون سي، قرطبة، الأرجنتين، وغابرييلا فورلان ونويليا مالدونادو على المساعدة في زراعة الخلايا. كما نشكر فيكتور دياز (نائب وزير الاتصالات المؤسسية في FCQ) على إنتاج الفيديو وتحريره.
تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) التضامنية 2018-2021 ، و Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، و Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2 & prime ؛ 7 & prime ؛ -DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4- (2-hydroxyethyl) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES) | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| BD FACSمقياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACSكانتو | |
| BD FACSبرنامج BD | Biosciences | ||
| أطباق ثقافة الخلية 100x20 مم | سيل ستار- جراينر بيو ون | 664 160 | |
| طرد مركزي | ثيرمو | سورفال ليجند مايكرو 17 آر | |
| الطرد المركزي (15 مل) | بيوفيل CFT011150 | ||
| (50 مل) | بيوفيل | CFT011500 | |
| كرايوفيال | كريو. S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | W387520-1 كجم | |
| ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات سباعي هيبتاهيدرات | Merck | 106575 | |
| DMEM بدون فينول أحمر | جيبكو من لايف تكنولوجيز | 31053-028 | |
| Dulbecco s النسر المعدل s medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | 11995065 | |
| حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي هيدرات | ميرك | 324503 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| الدم ، غرفة Neubauer | BOECO ، ألمانيا | ||
| غطاء التدفق الصفحي | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | ؛ M36008 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو من لايف تكنولوجيز | 15140-122 | |
| كلوريد البوتاسيوم | ميرك | 104936 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين | ميرك | 4878 | |
| أنابيب البوليسترين المستديرة 5 مل (أنابيب قياس التدفق الخلوي) | فالكون - كورنينج | BD-352008 | |
| أزيد الصوديوم | ميرك 822335 | ||
| كلوريد الصوديوم | ميرك | 106404 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | ميرك | 106462 | |
| أنبوب الطرد المركزي الصغير سبينوين 1.5 مل | صفيحة زراعة الأنسجة Tarson | 500010-N | |
| 6 آبار | بيوفيل | TCP011006 | |
| تريبان بلو | ميرك | 111732 | |
| تريبسين-EDTA 0.5٪ 10X | جيبكو من لايف تكنولوجيز | 15400-054 | |
| دوامة خلاط | لابنت إنترناشيونال |
المراجع
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
