مقالة منهجية

القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية

DOI:

10.3791/63337

⸱

مايو 13, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقترح بروتوكولا منهجيا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوروريسين ثنائي الفلور 2′,7′ (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). تحدد هذه الطريقة إجمالي مستويات ROS الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذا البروتوكول سهل الاستخدام للغاية ومناسب وقابل للتكرار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توازن الأكسدة والاختزال له دور مهم في الحفاظ على التوازن الخلوي. يعزز الجيل المتزايد من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تعديل البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما قد يؤدي في النهاية إلى تغيير في الوظيفة الخلوية وموت الخلايا. لذلك ، من المفيد للخلايا زيادة دفاعها المضاد للأكسدة استجابة للإهانات الضارة ، إما عن طريق تنشيط مسار مضاد للأكسدة مثل Keap1 / Nrf2 أو عن طريق تحسين زبالات الأكسدة والاختزال (الفيتامينات A و C و E β كاروتين والبوليفينول ، من بين أمور أخرى). يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي في التسبب في اعتلال الشبكية وتطوره ، مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) واعتلال الشبكية الخداجي (ROP). نظرا لأن خلايا مولر الدبقية (MGCs) تلعب دورا رئيسيا في توازن أنسجة الشبكية العصبية ، فإنها تعتبر نموذجا مثاليا لدراسة آليات الحماية الخلوية هذه. وبهذا المعنى ، فإن تحديد مستويات ROS كميا بطريقة بسيطة وقابلة للتكرار أمر ضروري لتقييم مساهمة المسارات أو الجزيئات التي تشارك في آلية الدفاع عن الخلايا المضادة للأكسدة. في هذه المقالة ، نقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس ROS باستخدام مسبار DCFH-DA وقياس التدفق الخلوي في MGCs. يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج هنا ، بحيث سيتمكن القراء من قياس مستويات ROS (الوسائل الهندسية ل FITC) وتحليل الرسوم البيانية الفلورية. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم ليس فقط الزيادة في ROS بعد إهانة خلوية ولكن أيضا لدراسة التأثير المضاد للأكسدة لبعض الجزيئات التي يمكن أن توفر تأثيرا وقائيا على الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشبكية العصبية هي نسيج منظم للغاية يقدم طبقات عصبية محددة جيدا. في هذه ، ترتبط الخلايا العصبية (العقدة ، الأمكرين ، الخلايا ثنائية القطب ، الأفقية ، والمستقبلات الضوئية) ببعضها البعض وكذلك مع خلايا مولر الدبقية (MGCs) والخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى نقل ضوئي كاف ومعالجة المعلومات البصرية 1,2. من المعروف أن MGCs لها دور مهم في الحفاظ على توازن الشبكية لأنها تعبر قسم الشبكية بأكمله ، وبالتالي ، يمكنها التفاعل مع جميع أنواع الخلايا التي تعدل عمليات الحماية المتعددة. وقد أفيد أن MGCs لديها العديد من الوظائف الهامة للحفاظ على وبقاء الخلايا العصبية الشبكية ، بما في ذلك تحلل السكر لتوفير الطاقة للخلايا العصبية ، وإزالة النفايات العصبية ، وإعادة تدوير الناقلات العصبية ، وإطلاق عوامل التغذية العصبية ، من بين أمور أخرى3،4،5.

من ناحية أخرى ، يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي والنيتروجيني في التسبب في العديد من الأمراض البشرية وتطورها ، بما في ذلك اعتلالات الشبكية6،7،8،9،10،11. يعتمد توازن الأكسدة والاختزال في الخلايا على التنظيم الصارم لمستويات ROS. يتم إنشاء ROS باستمرار في ظل الظروف الفسيولوجية نتيجة للتنفس الهوائي بشكل رئيسي. يشمل الأعضاء الرئيسيون في عائلة ROS الجذور الحرة التفاعلية مثل أنيون الأكسيد الفائق (O 2 ̘ ̘ •−) ، وجذور الهيدروكسيل (•OH) ، والبيروكسيدات المختلفة (ROOR′) ، والهيدروبيروكسيدات (ROOH) ، وبيروكسيد الهيدروجين غير الجذري (H 2 O 2)12,13. في السنوات الأخيرة ، أصبح من الواضح أن ROS يلعب دورا مهما في الإشارة في الخلايا من خلال التحكم في العمليات الأساسية. تتمتع MGCs بدفاع قوي مضاد للأكسدة عن طريق تنشيط العامل النووي النسخي الإريثرويد 2 المرتبط بالعامل 2 (Nrf2) والتعبير اللاحق عن البروتينات المضادة للأكسدة للقضاء على الإنتاج المفرط ل ROS في ظل الظروف المرضية14،15،16. عندما تفقد الخلايا توازن الأكسدة والاختزال بسبب الإنتاج المبالغ فيه ل ROS أو القدرة المعيبة على إزالة ROS ، فإن تراكم الإجهاد التأكسدي يعزز التعديلات الضارة في البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما يؤدي إلى الإجهاد الخلوي أو الموت. تعمل زيادة نظام الدفاع المضاد للأكسدة في الشبكية على تحسين دقة اعتلالات الشبكية والوقاية منها ، مثل ROP و RD 17,18,19,20,21,22,23,24. لذلك ، يعد قياس إنتاج ROS في الوقت الفعلي أداة قوية ومفيدة.

هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، مسبار ثنائي الأسيتات ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الفلور ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) هو واحد من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لتحديد حالة الأكسدة والاختزال للخلية مباشرة25،26،27،28. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسامه بواسطة الاسترازات داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية ، 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). يتراكم هذا الجزيء غير الفلوري داخل الخلايا ، وينتج عن الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج DCF عالي الفلورسنت. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS (البيروكسينتريت ، جذور الهيدروكسيل ، أكسيد النيتريك ، أو البيروكسيدات) ، والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري (الانبعاثات عند 530 نانومتر والإثارة عند 485 نانومتر). الحد من هذه التقنية هو أن الأكسيد الفائق وبيروكسيد الهيدروجين لا يتفاعلان بقوة مع H2DCF25,29. في هذه المقالة ، نستخدم مسبار DCFH-DA لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. لهذا السبب ، فإننا نحث على إنتاج ROS عن طريق تحفيز MGCs باستخدام محفز ROS ، A أو B ، قبل تحميل الخلايا باستخدام مسبار الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم مركبا مضادا للأكسدة. أخيرا ، نعرض بيانات تمثيلية وموثوقة تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: للحصول على تركيبات المخزن المؤقت، راجع الجدول 1.

1. إعداد زراعة الخلايا

ملاحظة: فيما يلي التحضير الاستزراعي لخلايا MIO-M1 ، وهو خط خلايا دبقية بشري مخلد تلقائيا من مولر (مورفيلد / معهد طب العيون - مولر 1). استخدم دائما تقنية التعقيم المناسبة واعمل في غطاء تدفق صفائحي.

  1. قم بإعداد وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) وسط كامل. إلى DMEM التي تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز D و 110 مجم / لتر من بيروفات الصوديوم ، أضف 10٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ، و 2 mM L-glutamine ، و 50 U / mL penicillin / streptomycin. قم بإعداد الوسط الطازج ، في اليوم الذي سيتم فيه إذابة خلايا MIO-M1.
  2. قم بإذابة خلايا MIO-M1 المجمدة في اليوم الأول.
    1. للقيام بذلك ، قم بإزالة الخلايا المبردة التي تحتوي على 5 × 105 خلايا MIO-M1 في FBS مع 10٪ DMSO من تخزين النيتروجين السائل ووضعها على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ارتد دائما قناع الوجه أو نظارات السلامة ، لأن الكريوفيالات المخزنة في النيتروجين السائل تشكل خطر الانفجار عند إذابتها.
    2. قم بإذابة خلايا MIO-M1 بسرعة (في أقل من دقيقة واحدة) عن طريق تسخين القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى لا يكون هناك سوى القليل من الجليد المتبقي في القارورة.
    3. امسح الجزء الخارجي من القارورة بالإيثانول بنسبة 70٪ وانقله إلى غطاء تدفق صفائحي.
    4. انقل الخلايا المذابة من القارورة إلى أنبوب معقم سعة 15 مل ثم أضف 6 مل من متوسط DMEM الكامل الذي تم تسخينه مسبقا.
    5. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند حوالي 600 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، سيتم تصور supernatant واضحة وبيليه كامل. تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة دون إزعاج حبيبات الخلية.
    6. افصل الكريات بلطف وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط DMEM الكامل. انقل هذا التعليق الخلوي إلى صفيحة زراعة أنسجة قطرها 100 مم واحتضن اللوحة لمدة يومين تقريبا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. عندما تصبح خلايا MIO-M1 ملتقية بنسبة 80٪ -90٪ في اليوم 4 ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. انقل اللوحة إلى غطاء تدفق صفائحي من الحاضنة. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية واغسل 2x ب 5 مل من PBS المعقمة والدافئة مسبقا. شفط PBS.
    2. استغني عن 1 مل من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.5٪ واحتضنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لمدة 3-5 دقائق لفصل الخلايا.
    3. أضف 7 مل من وسط DMEM الكامل لمنع عمل التربسين. قم بتصنيف MGCs المتراكبة المصنفة عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل (P1000). جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل.
    4. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف في 2 مل من وسائط DMEM الكاملة. انقل 1 مل من هذا التعليق الخلوي إلى لوحة 100 مم تحتوي على 9 مل من وسط DMEM الكامل الذي تم تسخينه مسبقا.
    5. كرر الإجراء باستخدام لوحة 100 مم أخرى. احتضن اللوحة لمدة 1 يوم تقريبا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  4. عندما تصبح كلتا اللوحتين ملتقيتين بنسبة 80٪ -90٪ (في اليوم 6) ، انقل اللوحة إلى غطاء تدفق صفائحي. اتبع الخطوة 1.3. للحصول على بيليه الخلية.
  5. افصل الكريات بلطف وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط DMEM الكاملة. عد خلايا MIO-M1 باستخدام مقياس الدم (غرفة نيوباور) ومحلول تريبان الأزرق باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع الغطاء الزجاجي على المنطقة المركزية لغرفة نيوباور. ضع الغرفة على سطح مستو (على سبيل المثال، طاولة أو طاولة عمل).
    2. امزج كمية متساوية من بقعة التربان الزرقاء مع الخلايا. على سبيل المثال ، امزج 60 ميكرولتر من التربان الأزرق مع 60 ميكرولتر من الخلايا لتخفيف 1: 2.
    3. من هذا الخليط ، قم بتحميل 10 ميكرولتر باستخدام ماصة دقيقة في غرفة نيوباور.
    4. ضع غرفة نيوباور المحملة على مسرح المجهر. ثم قم بتشغيل الضوء وضبط السطوع.
    5. حرك مرحلة المجهر إلى الوضع الأمثل واضبط التركيز البؤري حتى يتم الحصول على صورة حادة للخلايا.
    6. عد الخلايا داخل المربعات الأربعة (مقسمة إلى 16) الموجودة في زاوية مقياس الدم (الحجم: 0.1 مم3 لكل منها ).
    7. احسب تركيز الخلية باستخدام المعادلات أدناه.
      التركيز = (عدد الخلايا × 10.000)/عدد المربعات
      التركيز = (عدد الخلايا × 10.000)/4
      التركيز = عدد الخلايا × 2500
      ملاحظة: إذا تم إجراء تخفيف الخلايا ، فيجب تحويل التركيز الذي تم الحصول عليه إلى التركيز الأصلي قبل التخفيف.
      التركيز = (عدد الخلايا × 2500 × 2) = (عدد الخلايا × 5000 خلية / مل)
    8. اضبط تعليق الخلية على 1 × 10 5 خلايا / مل في وسط DMEM كامل ولوحة 2 مل من تعليق الخلية هذا في لوحة 6 آبار (2 × 105 خلايا / بئر). هز اللوحة بلطف لتوزيع الخلايا بشكل متجانس. احتضن الصفيحة المكونة من 6 آبار بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.

2. شروط وضوابط الفحص

  1. قم بتضمين عناصر التحكم التجريبية التالية لكل تجربة:
    1. التحكم في التألق الذاتي (الخلايا بدون مسبار DCFH-DA ، التحكم في تعيين معلمات التدفق الخلوي).
    2. التحكم القاعدي (الخلايا غير المحفزة).
    3. التحكم الإيجابي (الخلايا المعالجة بمحفز ROS ، A أو B).
    4. السيطرة السلبية (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة)
    5. عينة (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة ومحرض ROS ، A أو B).

3. إجراء الفحص

ملاحظة: يتم إجراء الفحص في اليوم 7. استخدم دائما تقنية التعقيم المناسبة واعمل في غطاء التدفق الرقائقي ما لم تصدر تعليمات بخلاف ذلك.

  1. تحضير مصل DMEM منخفض. ملحق DMEM يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز D و 110 مجم / لتر من بيروفات الصوديوم مع 0.5٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 10 mM HEPES ، و 2 mM L-glutamine ، و 50 U / mL البنسلين / الستربتومايسين. قم بإعداد الوسط الطازج في اليوم الذي سيتم فيه علاج MIO-M1.
  2. انقل اللوحة المكونة من 6 آبار (التقاء 60٪ -70٪) إلى غطاء تدفق صفائحي من الحاضنة. شفط supernatant وغسل الخلايا 1x مع PBS. أضف 2 مل من المصل المنخفض DMEM لكل بئر واحتضن لوحة 6 آبار لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. يتم ذلك لتجويع الخلايا.
  3. بعد تجويع المصل ، عالج الخلايا بمركب مضاد للأكسدة لمدة 6 ساعات.
    1. استنشاق supernatant وإضافة 2 مل من المخزون المخفف إلى الحالات التالية: السيطرة السلبية (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة) والعينة (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة ومحرض ROS ، A أو B).
    2. احتضن لوحة 6 آبار لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: في حالة استخدام مركب آخر مضاد للأكسدة أو مثبط ROS ، قم بتوحيد الوقت والتركيز الأمثل للمحفزات.
  4. بعد 6 ساعات من الحضانة ، عالج الخلايا باستخدام محفز ROS ، A أو B ، لمدة 30 دقيقة.
    1. أضف المحفزات إلى الحالات التالية: التحكم الإيجابي (الخلايا المعالجة بمحفز ROS ، A أو B) وآبار العينات (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة ومحفز ROS ، A أو B).
      ملاحظة: حافظ على حلول المخزون على الجليد.
    2. احتضن اللوحة المكونة من 6 آبار لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: في حالة استخدام محفز ROS آخر ، قم بتوحيد الوقت والتركيز الأمثل للمحفزات بشكل صحيح.
  5. قم بتحميل الخلايا باستخدام مسبار DCFH-DA.
    1. شفط supernatant وغسل الخلايا في لوحة 6-well 3x مع PBS لإزالة جميع المحفزات.
    2. أطفئ ضوء غطاء التدفق الرقائقي واعمل في الظلام. قم بإعداد تخفيف قدره 1:1000 من محلول مخزون المسبار 5 mM DCFH-DA للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر DCFH-DA في DMEM بدون الفينول الأحمر في أنبوب 15 مل.
    3. اخلطي بلطف باستخدام دوامة وأضيفي 1 مل من هذا المحلول إلى الآبار التالية: التحكم القاعدي (الخلايا غير المحفزة) ، والتحكم الإيجابي (الخلايا المعالجة بمحفز ROS) ، والتحكم السلبي (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة) ، وآبار العينات (الخلايا المعالجة بمركب مضاد للأكسدة ، ومحفز ROS ، A أو B).
    4. أضف 1 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر إلى خلايا التحكم في التألق الذاتي.
    5. احتضن اللوحة المكونة من 6 آبار لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: المسبار حساس للضوء. تخلص من جميع حلول المسبار غير المستخدمة.

4. إعداد الخلايا لقياس التدفق الخلوي

  1. بعد 6 ساعات ، احتفظ بالطبق على الجليد. من هذه الخطوة فصاعدا ، ليس من الضروري استخدام تقنية التعقيم المناسبة والعمل في غطاء تدفق صفائحي.
  2. اغسل الخلايا 3x مع 2 مل من PBS البارد لكل بئر. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المنفصل البارد إلى كل بئر. حصاد الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000.
  3. اجمعها في أنابيب 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: عند حصاد الخلايا، تجنب تكوين الفقاعة عن طريق ضبط ماصة P1000 على 0.4 مل. من هذه الخطوة فصاعدا ، اعمل بسرعة.
  4. عندما ينتهي الطرد المركزي ، ضع أنابيب 1.5 مل مع الخلايا على الجليد. تخلص من السوبرناتانت بعناية وافصل حبيبات الخلية بلطف مع التنصت.
  5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب 1.5 مل لغسل الخلايا. إذا لزم الأمر ، استخدم دوامة في أدنى كثافة لها للتفكك الكامل لحبيبات الخلية. الطرد المركزي لهم في 600 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. كرر هذه الخطوات 2x أكثر. (قم بإجراء ثلاث غسلات في المجموع).
  6. عندما ينتهي الغسيل الأخير، ضع علامة على أنابيب البوليسترين المستديرة القاع 5 مل (أنابيب قياس التدفق الخلوي) لجميع الظروف التجريبية (انظر الخطوة 2).
  7. عندما ينتهي الطرد المركزي ، أعد تعليق كريات الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. افصل الكريات بلطف في كل أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام دوامة. نقل إلى أنابيب مستديرة القاع 5 مل الملصقة. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحليلها على مقياس التدفق الخلوي.

5. الحصول على البيانات في مقياس التدفق الخلوي

  1. باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي ، قم بإنشاء تجربة جديدة. للقيام بذلك، في شريط القوائم، انتقل إلى التجربة وانقر فوق تجربة جديدة (Ctrl+E).
  2. أيضا، في شريط القوائم، انتقل إلى عرض وانقر فوق الخيارات التالية: شريط الأدوات، شريط الحالة، المستعرض، مقياس الخلايا، المفتش، ورقة العمل، لوحة معلومات الاكتساب والمحرر ثنائي الأس لرؤية هذه النوافذ في مساحة العمل.
  3. على يمين البرنامج، انقر فوق Specimen_001 . سيؤدي ذلك إلى فتح قائمة بالأنابيب (Tube_001 ، Tube_002 ، إلخ). لتسمية الأنابيب الخاصة بعناصر التحكم والظروف التجريبية المختلفة، انقر نقرا مزدوجا فوق Tube_001 Tube_002 وما إلى ذلك وأعد تسميتها (راجع الخطوة 2).
  4. حدد القنوات / المعلمات المراد تحليلها (FSC و SSC و FTC و APC أو أي فلوروكروم آخر لرؤية الرباعي) في الأنبوب الأول من إعدادات Cytometer للتجربة.
  5. انقر فوق أيقونة مؤشر الأنبوب الحالي لتحديد الأنبوب، وستتغير الأيقونة إلى اللون الأخضر. ضع أنبوب "التحكم في التألق الذاتي" على ذراع الشافط، مع تحريك القاعدة بعناية إلى اليسار فقط.
    1. لتشغيل نموذج "التحكم في التألق التلقائي"، انتقل إلى نافذة لوحة معلومات الاستحواذ وانقر فوق الحصول على البيانات. افتح مخططا نقطيا ل FSC (على المحور x) مقابل SSC (على المحور y).
    2. اضبط جهد التشتت الأمامي والجانبي بسرعة لضمان ظهور الأحداث على الرسم البياني. في نافذة لوحة معلومات الاستحواذ، انقر فوق إيقاف الاكتساب. في هذه التجربة ، تم استخدام إعدادات الجهد التالية: FSC - 200 فولت ، SSC - 423 فولت.
  6. لضبط جهد FITC ، قم بتشغيل "التحكم الإيجابي (الخلايا المعالجة بمحفز ROS ، A أو B)". اضبط الجهد بحيث تظهر جميع الأحداث على الرسم البياني ل FITC. في هذه الحالة ، استخدم جهدا يبلغ 280 فولت. في نافذة لوحة معلومات الاستحواذ، انقر فوق إيقاف الاكتساب.
  7. ضع مرة أخرى أنبوب "التحكم في التألق الذاتي" على ذراع الشافط. في نافذة لوحة معلومات الاستحواذ، انقر على الحصول على البيانات، ثم على تسجيل البيانات، وحدد شروط الإيقاف المطلوبة (على سبيل المثال، 50000 حدث). ارسم بوابة حول الخلايا المثيرة للاهتمام ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام.
    ملاحظة: لوحظت هذه الأحداث على أنها أصغر بكثير من عدد الخلايا الرئيسية وتظهر في أسفل يسار المؤامرة.
  8. عندما ينتهي الاكتساب ، قم بإزالة الأنبوب من ذراع الشافط. سوف تغسل المعدات نفسها. في نافذة لوحة معلومات الاستحواذ، انقر فوق الأنبوب التالي وقم بتشغيل عنصر التحكم الأساسي (الخلايا غير المحفزة). انقر فوق الحصول على البيانات ثم فوق تسجيل البيانات.
    1. من البوابة الأولية (البوابة التي تستثني الخلايا الميتة والحطام) ، قم بإنشاء مخطط نقطي آخر من FITC (على المحور x) مقابل APC (على المحور y). ارسم بوابة رباعية واضبط الإحداثيات من أجل تصور الأحداث في الربع السفلي الأيسر من مخطط FITC مقابل APC.
  9. لتسجيل العينات التالية، قم بإزالة الأنبوب وانقر فوق الأنبوب التالي > الحصول على البيانات > بيانات التسجيل.
    ملاحظة: يسجل مقياس التدفق الخلوي المستخدم هنا (انظر جدول المواد) 1 × 106 أحداث كحد أقصى لكل أنبوب.
  10. عند انتهاء تسجيل جميع الأنابيب ، قم بتصدير البيانات إلى القرص D. للقيام بذلك، انقر فوق ملف > تصدير ملفات FCS > > حدد الإصدار 3.0 أو 3.1.
    ملاحظة: على الرغم من أن الحصول على البيانات باستخدام برنامج واحد (انظر جدول المواد) موصوف بالتفصيل في هذا البروتوكول، إلا أنه يمكن استخدام أي برنامج آخر لقياس التدفق الخلوي. يمكن تعيين معلمات الاستحواذ (FSC و SSC و FITC) بنفس الطريقة للحصول على النتائج.

6. تحليل البيانات المكتسبة

  1. افتح البرنامج وأضف العينات باستخدام زر الإجراء إضافة عينات ؛ وهو موجود على شريط المهام أو في نطاق التنقل.
    1. انقر على إضافة عينات.
    2. باستخدام مستعرض الملفات، انتقل إلى المجلد التجريبي.
    3. حدد المجلد التجريبي وانقر فوق اختيار.
      ملاحظة: يتم تحميل ملفات العينة كجزء من المجموعة "كافة العينات" في مساحة العمل.
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق النموذج الأول في مساحة العمل: التحكم في التألق التلقائي.
    ملاحظة: يفتح هذا الإجراء نافذة رسم بياني ترسم الأحداث على طول معلمات التشتت الأمامي (FSC-A على المحور x) مقابل معلمات التشتت الجانبي (SSC-A على المحور y).
  3. ارسم بوابة مضلع لعزل الخلايا ذات الأهمية ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام.
    1. انقر فوق أداة بوابة المضلع .
    2. انقر داخل المؤامرة لتشكيل بوابة المضلع. اصنع أكبر عدد ممكن من الجوانب حسب الحاجة.
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة الأخيرة لإغلاق المضلع وإنشاء البوابة المطلوبة.
    4. أدخل اسما للبوابة، مثل "خلايا MIO-M1"، ثم اضغط على موافق.
      ملاحظة: تظهر نافذة رسم بياني جديدة تعرض أحداث MIO-M1 فقط بدون خلايا ميتة وحطام.
    5. كرر مع جميع العينات لتحليلها.
  4. تغيير المؤامرة إلى رسم بياني. للقيام بذلك، انقر فوق تسمية معلمة المحور X وحدد FITC-A. انقر فوق تسمية معلمة المحور Y وحدد الرسم البياني. هذا يغير المؤامرة إلى رسم بياني أحادي البعد.
  5. إضافة إحصائيات باستخدام النافذة إضافة إحصائية.
    1. أسفل الرسم البياني للرسم البياني، انقر على إضافة إحصائيات. سيفتح البرنامج نافذة إحصائية جديدة.
    2. على يسار النافذة الجديدة حدد إحصائيات الوسط الهندسي.
    3. حدد خلايا MIO-M 1 للسكان.
    4. من قائمة المعلمات المتاحة، حدد FIT-C.
    5. انقر فوق الزر إضافة لتطبيقها على التحليل.
      ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء الإحصائيات الجديدة "الوسط الهندسي: FITC" في شجرة بوابة العينة، ويتم عرض قيمها في مساحة العمل الخاصة بك.
  6. ضع قيم الوسط الهندسي هذه في برنامج إحصائي وقم بتحليلها.
  7. انقر فوق الرمز L لفتح محرر التخطيط ؛ هذا الرمز موجود في علامة التبويب القائمة في مساحة العمل. ضع نافذة مساحة العمل ومحرر التخطيط جنبا إلى جنب.
    ملاحظة: محرر التخطيط عبارة عن نافذة مساحة عمل منفصلة تحتوي على أدوات لعرض مخططات وإحصائيات رسوم بيانية متعددة في تقرير رسومي بسيط. يمكن تصدير هذا مع ملف الامتداد الذي تفضله ، مثل PDF أو JPG ، من بين أمور أخرى.
    1. من شجرة البوابة لعينة في نافذة مساحة العمل، اسحب مجموعة خلايا MIO-M 1 إلى محرر التخطيط.
    2. تأكد من عرض رسم بياني للرسم البياني يحتوي على الأحداث في البوابة في محرر التخطيط. سيتم تفصيل معلومات أساسية إضافية في مربع نص أدناه.
    3. اسحب جميع العينات لمقارنتها في نفس الرسم البياني. سوف يتداخل البرنامج معها.
    4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني للرسم البياني وحدد خصائص. سيقوم البرنامج بفتح نافذة تعريف الرسم البياني جديدة. تحتوي هذه النافذة على أربع علامات تبويب (التعليق التوضيحي، والخطوط، ووسيلة الإيضاح، والتحديد). انقر فوق علامة التبويب تحديد وقم بتغيير المحور y من تلقائي إلى نمطي. انقر على تطبيق.
    5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق العينة وقم بتغيير التلوين ونمط الخط ووزن الخط وما إلى ذلك لتخصيص الرسم البياني.
    6. لتصدير الصورة، انقر فوق علامة التبويب ملف، وبعد ذلك مباشرة، حدد حفظ الصورة في نطاق المستند. اختر النوع المفضل من ملف الصورة (على سبيل المثال، PDF).
      ملاحظة: يتم فتح مربع حوار حفظ، مما يطالبك بتحديد موقع حفظ. انقر على حفظ.
  8. احفظ التحليل كملف مساحة عمل (.wsp).
    1. في الزاوية العلوية اليمنى، انقر على أيقونة تحليل قياس الخلايا وحدد حفظ باسم.
    2. اختر حفظ كمساحة عمل (WSP) لحفظ المستند بالبيانات والتحليلات.
    3. أدخل اسما لملف مساحة العمل.
    4. انقر على حفظ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في قسم البروتوكول ، أظهرنا بيانات تمثيلية وكمية توضح اكتشاف التدفق الخلوي لإنتاج ROS باستخدام مسبار التألق DCFH-DA من خلايا MIO-M1 التي تم تحفيزها باستخدام محفز ROS ، A أو B. كما هو متوقع ، لاحظنا تغيرات في تألق FITC في الخلايا غير المحفزة فوق مستويات التألق الذاتي (الشكل 1A ، قارن "التحكم القاعدي" مقابل "التحكم في التألق الذاتي" ، الرسم البياني للمخططات النقطية). حدث هذا بسبب الإنتاج القاعدي ل ROS في خلايا MIO-M1. (الشكل 1 ب، قارن بين "التحكم القاعد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان والأمراض الالتهابية ونقص التروية / التروية وأمراض القلب الإقفارية والسكري واعتلال الشبكية ، وكذلك الحالات الفسيولوجية مثل الشيخوخة ، تؤدي إلى فرط إنتاج ROS6،7،8،9،10،11. لذلك ، فإن اكتشاف وقياس وفهم المسار الذي ينطوي عليه تعديل ROS هي أهداف مهمة للعديد من الأمراض. يمكن الوصول إلى استخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفان أن يشكرا ماريا بيلار كريسبو وبولا أليخاندرا أبادي من مركز البحوث في مجال الكيمياء الحيوية وعلم الاندماج، كونيسيت - أون سي، قرطبة، الأرجنتين، وغابرييلا فورلان ونويليا مالدونادو على المساعدة في زراعة الخلايا. كما نشكر فيكتور دياز (نائب وزير الاتصالات المؤسسية في FCQ) على إنتاج الفيديو وتحريره.

تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) التضامنية 2018-2021 ، و Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، و Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 & prime ؛ 7 & prime ؛ -DCFH-DASigma35845-1G
4- (2-hydroxyethyl) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES)Gibco by Life Technologies15630-080
BD FACSمقياس التدفق الخلويBD BiosciencesFACSكانتو
BD FACSبرنامج BDBiosciences
أطباق ثقافة الخلية 100x20 ممسيل ستار- جراينر بيو ون664 160
طرد مركزيثيرموسورفال ليجند مايكرو 17 آر
الطرد المركزي (15 مل)بيوفيل CFT011150
(50 مل)بيوفيلCFT011500
كرايوفيالكريو. S - Greiner Bio-One126263
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشW387520-1 كجم
ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات سباعي هيبتاهيدراتMerck106575
DMEM بدون فينول أحمرجيبكو من لايف تكنولوجيز31053-028
Dulbecco s النسر المعدل s medium (DMEM)Gibco by Life Technologies11995065
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي هيدراتميرك324503
مصل الأبقار الجنينيInternegocios
FlowJo v10 SoftwareBD Biosciences
GlucoseMerck108337
الدم ، غرفة NeubauerBOECO ، ألمانيا
غطاء التدفق الصفحيESCOAC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RedInvitrogen  ؛ M36008
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو من لايف تكنولوجيز15140-122
كلوريد البوتاسيومميرك104936
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجينميرك4878
أنابيب البوليسترين المستديرة 5 مل (أنابيب قياس التدفق الخلوي)فالكون - كورنينجBD-352008
أزيد الصوديومميرك 822335
كلوريد الصوديومميرك106404
هيدروكسيد الصوديومميرك106462
أنبوب الطرد المركزي الصغير سبينوين 1.5 ملصفيحة زراعة الأنسجة Tarson500010-N
6 آباربيوفيلTCP011006
تريبان بلوميرك111732
تريبسين-EDTA 0.5٪ 10Xجيبكو من لايف تكنولوجيز15400-054
دوامة خلاطلابنت إنترناشيونال
الثاني أجهزة أنابيب أنابيب الطرد المركزي مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43(2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199(2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة