مقالة منهجية

تعمل العملية الحيوية الماصة على تحسين إنتاج الميلانين من Pseudomonas stutzeri

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

يناير 12, 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا بشأن العملية الحيوية الماصة لإنتاج منتج بيولوجي ، وخاصة الصبغة التي تمنع التخليق الحيوي الخاص بها وتمنع نمو الكائنات الحية الدقيقة التي تنتجها.

الملخص

الميلانين أصباغ طبيعية ، ووجود حلقة الإندول والعديد من المجموعات الوظيفية يجعل الميلانين خيارا مثاليا للعديد من التطبيقات مثل عوامل الحماية من الأشعة فوق البنفسجية والعناية بالبشرة ومستحضرات التجميل وما إلى ذلك. ينتج Pseudomonas stutzeri البحري الميلانين دون إضافة التيروزين. لوحظ الميلانين تثبيط التغذية الراجعة في ثقافة بكتيريا بحرية منتجة للميلانين ، Pseudomonas stutzeri. أظهر الميلانين أيضا تثبيط النمو الميكروبي. حدد التحليل القائم على نموذج Han-Levenspiel تثبيط منتج من النوع غير التنافسي للميلانين على نمو الخلايا. تم تثبيط إنزيم التيروزيناز ، الذي ينتج الميلانين ، بواسطة الميلانين. كشفت المخطط المتبادل المزدوج للتفاعل الأنزيمي في وجود تركيزات مختلفة من الميلانين عن تثبيط غير تنافسي للمنتج. تم تطوير عملية حيوية ماصة قائمة على الممتزات لتقليل تثبيط التغذية الراجعة بواسطة الميلانين. تم فحص مواد ممتزة مختلفة لتحديد أفضل مادة ماصة لامتصاص الميلانين. تم تحسين كمية الجرعة ووقتها لتطوير العملية الحيوية الماصة ، مما أدى إلى زيادة إنتاج الميلانين بمقدار 8.8 أضعاف بواسطة البكتيريا البحرية Pseudomonas stutzeri (153 مجم / لتر إلى 1349 مجم / لتر) دون مكملات مستخلص التيروزين والخميرة.

المقدمة

الميلانين عبارة عن مركبات بوليفينول وحدتها الأحادية هي حلقة الإندول. الميلانين مسؤول عن معظم الألوان السوداء والبنية والرمادية للنباتات والكائنات الحية الدقيقة1. أكثر أنواع الميلانين شيوعا هي الميلانين ، وهي أصباغ بنية داكنة أو سوداء موزعة على نطاق واسع في الفقاريات واللافقاريات2. رأسيات الأرجل والنباتات والميكروبات هي المصادر الرئيسية للميلانين3. الميلانين الذي يتم الحصول عليه من الكائنات الحية الدقيقة له العديد من المزايا على الميلانين من رأسيات الأرجل والنباتات. إنها سريعة النمو ولا تسبب أي مشاكل في الاختلافات الموسمية. أيضا ، يقومون بتعديل أنفسهم وفقا لوسط النمو وظروف التشغيل المتوفرة. بالنظر إلى كل هذه الحقائق ، يتم استغلال المصادر الميكروبية كمصدر رئيسي للميلانين مع تطبيقات تجارية محتملة4،5،6. Guo et al. استخدم العقدة المؤتلفة cathirae SC-1 لإنتاج الميلانين حتى 28.8 جم / لتر في وسط محسن7. لاغوناس - مونيوز وآخرون. تم الحصول على حوالي 6 جم / لتر من الميلانين في المؤتلف بكتريا قولونية8. وانغ وآخرون حصل على حوالي 4.2 جم / لتر من الميلانين القابل للذوبان بعد التحسين المتوسط9. قام الباحثون أيضا بالتحقيق في الثقافات البحرية لإنتاج الميلانين. أنتج كيران وآخرون الميلانين من الأنواع الزائفة البحرية10. Kumar et al. عزل Pseudomonas stutzeri HMGM-7 من الأعشاب البحرية البحرية ، التي أنتجت الميلانين في مرق المغذيات. يحتاج جميع منتجي الميلانين المبلغ عنهم إلى مكملات متوسطة ومستخلص الخميرة و / أو الببتون لإنتاج الميلانين ، مما قد يعيق توسيع نطاق العملية الحيوية. قام Raman et al. بالتحقيق في إنتاج الميلانين من Aspergillus fumigatus AFGRD105 ، والذي لا يتطلب إضافات باهظة الثمن11.

تم اختيار بكتيريا بحرية تعرف باسم Pseudomonas stutzeri ، معزولة من الأعشاب البحرية ، لإنتاج الميلانين. لا تتطلب هذه الكائنات الحية الدقيقة مكملات إضافية من مستخلص التيروزين والخميرة لإنتاج الميلانين القابل للذوبان وتنمو في الوسائط القائمة على مياه البحر ، مما يقلل من بصمة مياه الشرب والتكلفة المتوسطة. أثيرا وآخرون أبلغ عن عملية حيوية محسنة باستخدام وجبة كعكة جوز الهند لإنتاج صبغة الميلانين النانوية باستخدام هذه البكتيريا البحرية في منشور سابق12. تم استخدام الميلانين المنتج لإزالة المعادن الثقيلة عالية الكفاءة من المياه الجوفية الاصطناعية. ومع ذلك ، أثناء التحسين المتوسط ، تم تحديد تثبيط التغذية الراجعة المعقولة للميلانين على النمو وتكوين المنتج. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم التحقيق في تثبيط التغذية الراجعة للميلانين وقياسه كميا باستخدام نموذج Han-Levenspiel المعمم. تم تطوير بروتوكول عملية حيوية امتصاصية بسيط وفعال لتقليل تثبيط التغذية الراجعة إلى أقصى حد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. نمو وصيانة ثقافة Pseudomonas stutzeri .

  1. الحصول على البكتيريا Pseudomonas stutzeri من MTCC Chandigarh (يتم توفيرها كأمبولة مجففة بالتجميد).
    1. تطهير سطح الأمبولة بالكحول (70٪). ضع علامة على الأمبولة بالقرب من منتصف المقياس وكسر في المنطقة المحددة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند فتح الأمبولة لأن المحتويات في فراغ. اتخذ الاحتياطات أثناء كسر الأمبولة ، حيث أن الفتحة المفاجئة ستسحب السدادة القطنية إلى أحد طرفيها وستطلق الفتحة المتسرعة الجزيئات الدقيقة المجففة بالتجميد للميكروب في الهواء.
    2. قم بإزالة السدادة القطنية بعناية باستخدام ملاقط معقمة وأضف 0.3 مل من مرق لوريا بيرتاني (LB) إلى الأمبولة. دعها تقف لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بتلقيح 100 ميكرولتر من المعلق إلى 10 مل من مرق LB (في قارورة مخروطية 100 مل) وضعها في شاكر الحاضنة عند 180 دورة في الدقيقة ، ويتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. انقل 100 ميكرولتر من التعليق في وقت واحد إلى أجار LB الصلب وانتشر للحصول على مستعمرات معزولة. احتضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. بمجرد نمو الثقافة ، قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بالزراعة الفرعية بعد كل 4 أسابيع عن طريق وضع مستعمرة على صفيحة أجار LB جديدة واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل حتى تظهر المستعمرات.

2. دراسات تثبيط الميلانين على النمو ونشاط الإنزيم

  1. تحضير وسط الاستزراع بإضافة 51.4 جم / لتر من الجلوكوز ، و 49.8 جم / لتر من وجبة كعكة جوز الهند ، و 0.09 جم / لتر ، و 0.03 جم / لتر و 0.05 جم / لتر من CuSO4 و FeSO4 و MgSO4 ، على التوالي ، في مياه البحر الاصطناعية (جدول المواد). قم بإجراء جميع التجارب في قارورة اهتزاز سعة 250 مل بحجم تعبئة 15 مل عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، ودرجة حموضة أولية تبلغ 7.
  2. أضف تركيزات مختلفة من الميلانين (100 مجم / لتر ، 200 مجم / لتر ، 500 مجم / لتر ، و 1000 مجم / لتر) في كل وسط استزراع في بداية العملية الحيوية.
  3. قياس معدل النمو المحدد ، ونشاط الإنزيم للخلايا ، والميلانين في فترات زمنية مختلفة من العملية الحيوية لكل تركيز إضافي من تركيز الميلانين (القسم 3.2).

3. نمذجة حركية تثبيط الميلانين

  1. استخدم المعادلة المعممة التالية ل Han و Levenspiel13 لنمذجة حركية التثبيط لإنتاج الميلانين ،
    figure-protocol-1 (1)
    أين
    μ = معدل نمو محدد واضح (1 / ساعة)
    μكحد أقصى = الحد الأقصى لمعدل النمو النوعي (1 / ساعة)
    p = تركيز المنتج (جم / لتر)
    p * = تركيز المنتج الحرج الذي يتوقف عنده النمو (جم / لتر)
    s = تركيز الركيزة (جم / لتر)
    م ، ن = المعلمات
    يمكن إعادة كتابة المعادلة أعلاه ك
    figure-protocol-2 (2)
    أين
    figure-protocol-3 (3)
    و figure-protocol-4 (4)
    يمكن إعادة ترتيب المعادلة أعلاه إلى مخطط مقلوب مزدوج 1/μ مقابل 1/s، كما هو موضح أدناه
    figure-protocol-5 (5)
  2. ارسم خطا مستقيما باستخدام بيانات معدلات النمو المحددة المختلفة وتركيزات الركيزة باستخدام المعادلة أعلاه. يعطي الاعتراض على المحور Y- و X ، على التوالي ، μmax و Ks ، والتي يمكن استبدالها في المعادلة 3 و 4 على التوالي للحصول على μ obs و Kobs.
    يمكن كتابة المعادلة (3) على النحو التالي
    figure-protocol-6 (6)
  3. احسب معدل النمو المحدد للثقافة المزروعة في الخطوة 2.2 وقم بتسميته باسم μobs.
  4. استخدم قيمة معدل النمو النوعي الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.3 في المعادلة (6). قم بملاءمة البيانات في معادلة خطية واحسب المنحدر والاعتراض.
  5. استخدم المعادلة (3) لحساب الحد الأقصى لمعدل النمو النوعي في حالة عدم وجود الميلانين.

4. تطوير العملية الحيوية الماصة

  1. قم بإجراء جميع التجارب في قارورة اهتزاز سعة 250 مل بحجم تعبئة 15 مل عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية ، ودرجة حموضة أولية تبلغ 7.
  2. قم بإجراء العملية الحيوية المحسنة النهائية في مفاعل حيوي للخزان المقلوب سعة 5 لتر بحجم حفظ 3 لتر. الحفاظ على درجة الحموضة في الثقافة بين 7-7.5 والأكسجين المذاب بين 50٪ - 60٪ من التشبع في دراسات المفاعل الحيوي.

5. اختيار أفضل المواد الماصة من مختلف المواد الماصة المتاحة

  1. أضف مواد ماصة مختلفة مثل الألومينا والزيوليت والكلين وأرض فولر والكربون المنشط في قوارير مختلفة تحتوي على مرق الاستزراع.
  2. أضف كل مادة ماصة على حدة بتركيز 1 جم / لتر إلى مرق المزرعة واحتفظ بها في شاكر دوار عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 12.
  3. افصل الممتزات عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق وقم بقياس امتصاص المادة الطافية عند 400 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  4. حدد المادة الماصة التي تمتص أكبر قدر ممكن من الميلانين من مرق الاستزراع.

6. تأثير وقت الجرعة من الممتزات

  1. ابدأ العملية الحيوية وأضف المادة الممتزة التي تنتج أعلى امتصاص للميلانين من الثقافة (تم تحديدها بعد القسم 5). التركيز المختار في الخطوة الأولية هو 1 جم / لتر.
  2. قياس الحد الأقصى لإنتاج الميلانين وفقا للبروتوكول المنشورسابقا 12.
  3. كرر الخطوة 6.1 بإضافة المادة الماصة بعد 12 ساعة من بدء العملية الحيوية وقياس إنتاج الميلانين في أوقات مختلفة من العملية الحيوية.
  4. كرر الخطوة 6.3 بإضافة المادة الماصة بعد 24 ساعة و 36 ساعة و 48 ساعة من بدء العملية الحيوية.
  5. قارن الميلانين المنتج في كل عملية عملية حيوية وحدد أفضل وقت جرعة لأقصى إنتاج للميلانين واستعادته.

7. تأثير كمية جرعة الممتزات

  1. أضف تركيزات مختلفة من أفضل مادة ماصة (0.5 و 1 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 جم / لتر) إلى المزارع في الوقت المحدد في القسم 6.
  2. حصاد العملية الحيوية عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق.
  3. اجمع المادة الطافية واحسب كمية الميلانين عن طريق قياس الامتصاص عند 400 نانومتر.
  4. اغسل الحبيبات المحتوية على مادة ماصة مرتين لكل منهما بالماء المقطر والإيثانول لإزالة الخلايا والمركبات الأخرى المرتبطة بالمادة الماصة. قم بإجراء خطوة الغسيل عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق.
  5. أضف محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M إلى المادة الماصة المغسولة لامتصاص الميلانين.
  6. قم بالطرد المركزي للخليط عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق وقم بقياس كمية الميلانين في المادة الطافية عند 400 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
  7. كرر عملية الامتصاص ثلاث مرات أو حتى يعود الممتز إلى لونه الطبيعي.
  8. قلل درجة الحموضة لمحلول الميلانين الممتص المركز هذا إلى 3 أو أقل عن طريق إضافة 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك باستخدام محرك مع حبات مغناطيسية لترسيب الميلانين. قم بتخزين المحلول الحمضي في الثلاجة لمدة 1 ساعة لزيادة هطول الأمطار إذا لزم الأمر.
  9. اغسل الميلانين المترسب الذي تم الحصول عليه بهذه الطريقة ثلاث مرات بالماء المقطر عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم جففه واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

8. النمذجة الرياضية للعملية الحيوية

  1. حركية نمو الكتلة الحيوية
    1. تحديد معدل نمو الكتلة الحيوية باستخدام نموذج Verhulset المعدل التالي الذي تم تطويره لتثبيط المنتج ، كما هو موضح في المعادلة الواردة أدناه14 ، 15 ، 16 ، 17 ،
      figure-protocol-7 (7)
      أين
      x = تركيز الكتلة الحيوية (جم / لتر)
      ×م = الحد الأقصى لتركيز الكتلة الحيوية (جم / لتر)
      μobs = الحد الأقصى لمعدل النمو النوعي (1 / ساعة) كما هو موضح في المعادلة (2)
      فاسكيس وآخرون (2008) اشتق كذلك المعادلة التالية لتركيز الكتلة الحيوية من المعادلة (7)
      figure-protocol-8 (8)
      أين
      vx = معدل نمو الكتلة الحيوية (جم / لتر / ساعة) = μobs·x
      μOBS       = معدل نمو محدد ملحوظ (1 / ساعة)
      τx = وقت التأخر (h)
      t = الوقت (ح)
    2. استخدم المعادلة (8) لحساب تركيز الكتلة الحيوية في أوقات مختلفة من العملية الحيوية ومحاكاة ملف نمو Pseudomonas stutzeri.
  2. حركية استهلاك الركيزة
    ملاحظة: تستخدم الركيزة لنمو الكتلة الحيوية وتشكيل المنتج والصيانة في العملية الحيوية.
    1. استخدم المعادلة التالية لموازنة استخدام الركيزة في العملية الحيوية ،
      figure-protocol-9 (9)
      يتم استخدام غالبية الجلوكوز لتوليد الكتلة الحيوية. لذلك ، من أجل التبسيط ، فإن إهمال استهلاك الركيزة لتكوين المنتج من شأنه أن يقلل من المعادلة (9) إلى ،
      figure-protocol-10 (10)
      أين
      S = تركيز الركيزة (جم / لتر)
      YP / S = معامل عائد المنتج ، أي معامل إنتاج الميلانين (جم / جم)
      P = تركيز المنتج (جم / لتر) ، أي تركيز الميلانين (جم / لتر)
      YX / S = معامل عائد الكتلة الحيوية (جم / ز)
      مس = معامل الصيانة (ز / ز / ساعة)
      دمج المعادلة أعلاه من الوقت t = 0 إلى الوقت t = t ، واستبدال قيمة x من المعادلة (8) يعطي المعادلة التالية لملف تعريف تركيز الركيزة17 ،
      figure-protocol-11 (11)
      حيث ، s 0 = تركيز الركيزة الأولي (جم / لتر) و × 0 = تركيز الكتلة الحيوية الأولي (جم / لتر)
    2. استخدم المعادلة (11) لحساب تركيز الركيزة على فترات زمنية مختلفة من العملية الحيوية أو إذا كان تركيز الركيزة معروفا ، فاستخدم نفس المعادلة لتقدير المعلمات الواردة في المعادلة.
  3. حركية إنتاج الميلانين
    1. استخدم معادلة Ludeking-Pirate لمحاكاة إنتاج الميلانين. ومع ذلك ، فإن الميلانين مرتبط بالنمو ، وبالتالي ، يتم إهمال مصطلح تكوين المنتج المرتبط بعدم النمو ، ويمكن كتابة المعادلة المبسطة على النحو التالي ،
      figure-protocol-12 (12)
      أين
      α = ثابت Ludeking-Pirate مرتبط بتكوين المنتج المرتبط بالنمو (g / g)
      يؤدي دمج المعادلة (12) من الزمن t = 0 إلى t = t إلى المعادلة التالية لملف تعريف تركيز المنتج
      figure-protocol-13 (13)
    2. استخدم المعادلة (13) لحساب α.
  4. تقدير المعلمات الحركية
    1. قم بتقدير جميع المعلمات المذكورة أعلاه باستخدام طريقة المربع الأدنى غير الخطية لتقدير المعلمات باستخدام أي أداة برمجية مناسبة (على سبيل المثال ، أداة حل Microsoft Excel).
    2. استخدم بيانات التجربة الدفعية لتقدير المعلمات وتقليل مجموع الخطأ التربيعي (SSE) باستخدام أداة Solver ، كما هو موضح في المعادلة التالية ،
      تصغير
      figure-protocol-14 (14)
      أين
      xsim = قيمة محاكاة و xexp = قيمة تجريبية

9. التقنيات التحليلية

  1. استخراج الميلانين
    1. الطرد المركزي لثقافة النمو عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الكتلة الحيوية.
    2. أضف حجما متساويا قدره 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى المادة الطافية.
    3. قم بتحمض المادة الطاففية القلوية إلى درجة الحموضة 2 عن طريق إضافة 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك لترسيب الميلانين.
    4. جهاز طرد مركزي المادة الطافية المحمضة عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة لجمع الميلانين.
    5. اغسل الميلانين الذي تم جمعه ثلاث مرات ب 5 مل من الماء المقطر ، وجففه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية18.
  2. القياس الكمي للميلانين
    1. تحضير تركيزات مختلفة من محاليل الميلانين (0-500 مجم / لتر) عن طريق إذابة الكمية المناسبة من الميلانين في مياه البحر الاصطناعية (درجة الحموضة 8).
    2. قم بقياس الامتصاص عند 400 نانومتر باستخدام مقياس الطيفالضوئي 18.
    3. إعداد منحنى المعايرة باستخدام البيانات المذكورة أعلاه.
    4. جهاز الطرد المركزي لثقافة النمو عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الكتلة الحيوية وقياس امتصاص المادة الطافية عند 400 نانومتر. احسب تركيز الميلانين في ثقافة النمو باستخدام منحنى المعايرة المعد في الخطوة 9.2.3
  3. فحص التيروزيناز
    1. اتبع البروتوكول الموضح أدناه لمقايسة إنزيم التيروزيناز الذي طوره Ren et al. (2013) 19 لتحديد نشاط إنزيم التيروزيناز المستخرج من مرق ثقافة Pseudomonas stutzeri .
    2. الطرد المركزي للثقافة البكتيرية عند 5,000 × جم لجمع الخلايا.
    3. قم بتقطيع الخلايا في محلول فوسفات بارد 100 ملي مولار من درجة الحموضة 6.5 والطرد المركزي المتجانس عند 9000 × جم لمدة 15 دقيقة وجمع المادة الطافية ، وهي مصدر لإنزيم التيروزيناز.
    4. أضف 0.2 مل من محلول الإنزيم الذي تم الحصول عليه في الخطوة أعلاه إلى 2.8 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 6.5) الذي يحتوي على 1 ملي مولار لتيروزين (الركيزة).
    5. لاحظ تكوين الدوباكروم عن طريق قياس الامتصاص عند 475 نانومتر.
    6. احسب نشاط التيروزيناز على النحو التالي. يتم تعريف وحدة دولية واحدة (IU) من نشاط التيروزيناز على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لأكسدة 1 ميكرومول من L-tyrosine إلى دوباكروم في الدقيقة. احسب ذلك باستخدام معامل الانقراض المولي للدوباكروم (3600 لتر -1 سم -1) بالمعادلة التالية ،
      figure-protocol-15 (15)
  4. تقدير الكتلة الحيوية
    1. اجمع 5 مل من العينات بفاصل 4 ساعات في خزانة السلامة الحيوية ، مع الحفاظ على العقم. قم بإشعال السدادة القطنية للقارورة قبل وبعد أخذ العينات لتقليل فرص التلوث. قم بقياس الكثافة البصرية (OD) للعينات عند 660 نانومتر لجميع هذه العينات.
      ملاحظة: تعمل الوسائط غير الملقحة كفارغة. سيتم استخدام هذه القراءات لدراسة نمو الكائنات الحية الدقيقة.
    2. قم بالطرد المركزي في مرق الاستزراع عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق و 4 درجات مئوية ، واجمع حبيبات الخلية وجفف الحبيبات لمدة 8 ساعات عند 60 درجة مئوية في فرن الهواء الساخن للحصول على كتلة الخلية الجافة.
    3. إعداد منحنى المعايرة باستخدام OD المقاس في الخطوة 1.4.9 والكتلة الحيوية المقابلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4.9
    4. استخدم منحنى المعايرة (OD = 0.820 الكتلة الحيوية (جم / لتر)) لقياس الكمية غير المعروفة من الكتلة الحيوية عن طريق قياس الكثافة البصرية لمرق الاستزراع في أي وقت.
  5. تقدير الحمض النووي
    1. تقدير كمية الحمض النووي في العينة عن طريق قياس الكثافة البصرية عند 260 نانومتر.
    2. احسب الحمض النووي باستخدام الصيغة التالية ،
      figure-protocol-16 (16)
      أين
      أ260 = الامتصاص عند 260 نانومتر
      0.1 = حجم العينة
      1 = امتصاص محلول الحمض النووي القياسي بتركيز 50 ميكروغرام / مل ، عند 260 نانومتر
  6. تقدير البروتين
    1. تقدير كمية البروتين في العينات باستخدام مجموعة تقدير بروتين برادفورد (جدول المواد).
    2. أضف 5 مل من كاشف برادفورد إلى 0.1 مل من المادة الطافية واحتفظ بها لمدة 5 دقائق. تتفاعل البروتينات الموجودة في المادة الطافية مع كاشف برادفورد لتشكيل مركب ملون.
    3. قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر20 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  7. تقدير السكر المختزل الكلي (TRS)
    1. قم بقياس TRS بطريقة dinitrosalicylic (DNS)21.
    2. قم بإعداد حل DNS عن طريق إذابة 1 جم من DNS في 50 مل من الماء المقطر. أضف 30 جم من طرطرات البوتاسيوم الصوديوم إلى هذا المحلول بكميات صغيرة حتى يصبح لون المحلول أصفر حليبي ، متبوعا باللون البرتقالي والأصفر الشفاف مع إضافة 20 مل من 2 N هيدروكسيد الصوديوم. ارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر واحفظه في الظلام.
    3. تحضير محلول عمل الجلوكوز (0.01 م) عن طريق إذابة 180 مجم من الجلوكوز في 100 مل من الماء المقطر في قارورة قياسية.
    4. ماصة خارج محلول الجلوكوز القياسي (0.2 ، 0.4 ، 0.6 ، 0.8 و 1 مل) في 5 أنابيب اختبار منفصلة. استخدم أنبوب اختبار يحتوي على الماء المقطر (1 مل) كمحلول فارغ.
    5. ارفع الحجم إلى 2 مل في كل أنبوب اختبار باستخدام الماء المقطر.
    6. أضف 1 مل من كاشف DNS إلى كل أنبوب اختبار وقم بتغطيته بورق الألمنيوم.
    7. سخني أنابيب الاختبار في حمام مائي مغلي لمدة 5 دقائق واتركيها تبرد إلى RT.
    8. أضف 9 مل من الماء المقطر إلى كل أنبوب اختبار واخلطه جيدا. قم بقياس OD للمحتوى عند 575 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    9. قم بقياس التركيز باستخدام مخطط معايرة معد بكمية الجلوكوز على المحور X مقابل الامتصاص عند 575 نانومتر (A575) على المحور Y.
  8. تحليل حجم الجسيمات
    1. قم بتفريق الميلانين المركب بيولوجيا في الماء المقطر (1 مل) باستخدام مكبر صوت.
    2. أضف محلول العينة المشتت (1 مل) إلى محلل الجسيمات النانوية وقم بقياس حجم الجسيمات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  9. تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)
    1. جفف مسحوق الميلانين الذي تم الحصول عليه بعد الاستخراج عن طريق إبقائه عند 60 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
    2. قم بتحميل مسحوق الميلانين في مصفوفة عينة TEM وقم بقياس الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال باتباع بروتوكول المشغل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 أ ، ب النمو وإنتاج الميلانين تحت تأثير تركيزات الميلانين الأولية المختلفة. انخفض نمو الخلايا وإنتاج الميلانين بشكل كبير مع زيادة التركيز الأولي للميلانين. عند تركيز الميلانين الأولي 500 مجم / لتر في الوسط ، انخفضت الكتلة الحيوية والميلانين إلى ما يقرب من 50٪ من القيمة القصوى التي تم الحصول عليها في السيطرة. عند 1000 مجم / لتر من تركيز الميلانين الأولي ، كان هناك إنتاج هامشي للميلانين. انخفض معدل نمو الكتلة الحيوية بشكل ملحوظ عند تركيز الميلانين الأولي 1000 ملغم/...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تثبيط المنتج عنق الزجاجة الرئيسي في المعالجة الحيوية مما يؤدي إلى انخفاض الإنتاجية. توجد عدة طرق لتقليل تثبيط المنتج ، مثل المعالجة الحيوية المستمرة وتقنيات إزالة المنتج في الموقع . ومع ذلك ، تتطلب هذه الخيارات إصلاحا شاملا لمنشأة المعالجة الحيوية الحالية23،24،25،26،27،28. لا تتط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح

شكر وتقدير

نشكر وزارة العلوم والتكنولوجيا (DST/TSG/WP/2014/58) والهند والمعهد الوطني للتكنولوجيا في ولاية كارناتاكا على توفير التمويل لتطوير البروتوكول المذكور أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  الألومينا +A15A26A3:A13A3:A16A3:A17هايميدياGRM1909
الكربون المنشطهايميدياPCT1001
مياه البحر الاصطناعية المتوسطةهايميدياM1942
طقم كاشف برادفوردهايميدياML106
كليتهايميدياGRM226
جهاز طرد مركزيREMICM-8
أنابيب الطرد المركزيهاي ميدياPW1207
حمض دينيتروساليسيليكهايميدياGRM1582
قارورة إرلينمايربوروسيل4980021
فولر إيردهايميدياGRM232
الجلوكوزهاي ميدياMB037
حمض الهيدروكلوريكهايميدياAS004
L-تيروزينهايميدياRM069
مايكروسوفت إكسلمايكروسوفت
محلل الجسيماتالنانوية HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
المغذيات أجار متوسطهايميدياM001
لوحة بتريهايميدياPW054
عازلة الفوسفاتHiMediaM1452
هيدروكسيد الصوديومHiMediaMB095
مقياس الطيفالضوئي ThermofisherGenesys 10
مفاعل حيوي للخزان المقلوبScigenicsBioferm LS
TE BufferHiMediaML060
مجهر إلكترونيناقل الحركة JEOLJEM-2100
الزيوليتHiMediaGRM3834

المراجع

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة