مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للأنسجة الدهنية للفئران للتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين

DOI:

10.3791/63348

⸱

أغسطس 29, 2022

 ,  ,  , 
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تكون الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) مصدرا محتملا ل MSCs التي تتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين (IPCs). في هذا البروتوكول ، نقدم خطوات مفصلة لعزل وتوصيف الفئران البربخية Ad-MSCs ، متبوعة ببروتوكول بسيط وقصير لتوليد IPCs من نفس الفئران Ad-MSCs.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اكتسبت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) - وخاصة تلك المعزولة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) - اهتماما خاصا كمصدر متجدد وفير للخلايا الجذعية التي لا تشكل أي مخاوف أخلاقية. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لعزل Ad-MSCs ليست موحدة وتستخدم بروتوكولات معقدة تتطلب معدات خاصة. لقد عزلنا Ad-MSCs من الدهون البربخية لفئران Sprague-Dawley باستخدام طريقة بسيطة قابلة للتكرار. عادة ما تظهر Ad-MSCs المعزولة في غضون 3 أيام بعد العزل ، حيث تعرض الخلايا الملتصقة مورفولوجيا الأرومة الليفية. هذه الخلايا تصل إلى 80 ٪ التقاء في غضون 1 أسبوع من العزل. بعد ذلك ، في الممر 3-5 (P3-5) ، تم إجراء توصيف كامل ل Ad-MSCs المعزولة عن طريق التنميط المناعي لمجموعة MSC المميزة من علامات سطح التمايز (CD) مثل CD90 و CD73 و CD105 ، بالإضافة إلى تحفيز تمايز هذه الخلايا أسفل السلالات العظمية والشحمية والغضرونية. وهذا بدوره يعني تعدد قدرات الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، قمنا بتحفيز تمايز Ad-MSCs المعزولة نحو سلالة الخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs) عبر بروتوكول بسيط وقصير نسبيا من خلال دمج وسط النسر المعدل عالي الجلوكوز في Dulbecco (HG-DMEM) ، β-mercaptoethanol ، nicotinamide ، و exendin-4. تم تقييم تمايز IPCs وراثيا ، أولا ، عن طريق قياس مستويات التعبير عن علامات محددة للخلايا β مثل MafA و NKX6.1 و Pdx-1 و Ins1 ، بالإضافة إلى تلطيخ dithizone ل IPCs المتولدة. ثانيا ، تم إجراء التقييم أيضا وظيفيا عن طريق فحص إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS). في الختام ، يمكن عزل Ad-MSCs بسهولة ، وعرض جميع معايير توصيف MSC ، ويمكنها بالفعل توفير مصدر وفير ومتجدد ل IPCs في المختبر لأبحاث مرض السكري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا اللحمية الوسيطة ، هي من بين أنواع الخلايا الأكثر استخداما على نطاق واسع للطب التجديدي 1,2. يتم تصنيفها على أنها خلايا جذعية بالغة وتتميز بإمكانات التمايز متعدد السلالات وقدرة التجديد الذاتي3. يمكن عزل MSCs والحصول عليها من مصادر مختلفة ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية ونخاع العظام والدم المحيطي وأنسجة الحبل السري والدم وبصيلات الشعر والأسنان 4,5.

ينظر إلى عزل الخلايا الجذعية عن الأنسجة الدهنية على أنه جذاب وواعد على حد سواء بسبب سهولة الوصول إليها ، والتوسع السريع في المختبر ، والعائد العالي6. يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) من أنواع مختلفة مثل البشر والأبقار والفئران والجرذان ، ومؤخرا الماعز7. لقد ثبت أن Ad-MSCs هي الآن مرشحة محتملة لهندسة الأنسجة والعلاج الجيني / الخلوي الذي يمكن استخدامه حتى لتطوير بديل ذاتي لإصلاح إصابة الأنسجة الرخوة أو عيوبها على المدى الطويل 7,8.

حددت الجمعية الدولية للعلاج الخلوي والجيني (ISCT) ثلاثة معايير دنيا يجب أن تظهرها MSCs للتوصيف الكامل9. أولا ، يجب أن يكونوا من أتباع البلاستيك. ثانيا ، يجب أن تعبر MSCs عن علامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة مثل CD73 و CD90 و CD105 وتفتقر إلى التعبير عن علامات المكونة للدم CD45 أو CD34 أو CD14 أو CD11b أو CD79α أو CD19 و HLA-DR. أخيرا ، يجب أن تظهر MSCs القدرة على التمييز في السلالات الوسيطة الثلاثة: الخلايا الشحمية ، الخلايا العظمية ، والخلايا الغضروفية. ومن المثير للاهتمام ، يمكن أن تتمايز MSCs أيضا إلى سلالات أخرى مثل الخلايا العصبية ، والخلايا العضلية القلبية ، وخلايا الكبد ، والخلايا الظهارية10،11.

في الواقع ، تمتلك MSCs خصائص فريدة تمكنها من تطبيقها كعوامل علاجية محتملة في العلاج التجديدي للأمراض المختلفة. يمكن ل MSCs إفراز عوامل قابلة للذوبان للحث على بيئة مناعية توفر فوائد علاجية12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تهاجر MSCs نحو مواقع الإصابة والبيئات الدقيقة للورم لتقديم العلاج المستهدف ؛ ومع ذلك ، لم يتم توضيح الآليات بشكل كامل13. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع MSCs بالقدرة على إفراز الإكسوسومات ، والحويصلات خارج الخلية في المقياس النانوي التي تحمل شحنة من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، والبروتين ، والعوامل القابلة للذوبان ، والتي ظهرت مؤخرا كآلية جديدة للإمكانات العلاجية ل MSCs في مختلف الأمراض14.

الأهم من ذلك ، أن MSCs قد ولدت اهتماما ملحوظا لقدرتها على التمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين (IPCs) ، إما عن طريق التعديل الوراثي15,16 أو من خلال استخدام مختلف العوامل الخارجية المحفزة داخل وسائط الثقافة في المختبر17. تختلف فترة تحريض IPC اختلافا كبيرا ، لأنها تعتمد على بروتوكول الحث المستخدم والعوامل الخارجية المستخدمة. يمكن أن تستمر عملية التمايز من أيام إلى أشهر ، وتتطلب مزيجا من العوامل الخارجية التي يجب إضافتها و / أو سحبها في مراحل مختلفة. العديد من هذه العوامل التي تم استخدامها لتمايز البنكرياس الغدد الصماء هي مركبات نشطة بيولوجيا ثبت أنها تعزز انتشار أو تمايز / النشأة الجديدة للخلايا β المفرزة للأنسولين و / أو تزيد من محتوى الأنسولين في IPCs18،19،20،21. ومن الجدير بالذكر هنا أنه تم الإبلاغ أيضا عن أن MSCs لها آثار علاجية في مرض السكري ومضاعفاته عبر العديد من الآليات ، بما في ذلك إفرازاتها ، بالإضافة إلى مجموعة واسعة من الإجراءات المناعية22،23،24.

في هذا البروتوكول ، نقدم بروتوكولا مفصلا تدريجيا لعزل وتوصيف Ad-MSCs من الدهون البربخية للفئران ، متبوعا ببروتوكول بسيط وقصير نسبيا لتوليد IPCs من Ad-MSCs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة ، وتم اعتماد جميع الإجراءات من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) ، القاهرة ، مصر. تم اعتماد بروتوكول عزل Ad-MSC من لوبيز وسبنسر ، مع التعديلات15.

1. عزل Ad-MSCs عن منصات الدهون البربخ الفئران

  1. استخدم ذكور الفئران Sprague-Dawley التي تزن 250-300 جم والتي لا يزيد عمرها عن شهر 1 (اثنان لكل عزلة). تخدير الحيوانات ، ثم القتل الرحيم لهم عن طريق خلع عنق الرحم. رش الحيوان الرحيم مع 70 ٪ من الإيثانول. قم باستئصال الجلد والعضلات في الجزء السفلي من البطن ، ثم اسحب الخصيتين لفضح منصات الدهون البربخية.
  2. قطع بلطف منصات الدهون البربخ والحرص على عدم قطع الأوعية الدموية.
  3. اعزل الأنسجة الدهنية المحيطة بالبربخ ، ثم ضعها في طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  4. في خزانة السلامة الأحيائية ، قم بقطع منصات الدهون هذه إلى قطع صغيرة باستخدام الملقط والمشرط. انقل قطع الأنسجة الدهنية المقطوعة هذه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من PBS المعقم.
  5. اغسل الأنسجة الدهنية المفرومة 5 مرات مع 10 مل من PBS في كل مرة لإزالة الدم الملوث. يجب تنفيذ إجراءات الغسيل التالية بدقة.
    1. أضف 10 مل من PBS إلى الأنسجة واخلطها جيدا لمدة 45 ثانية. بعد ذلك ، اسمح للأنسجة بالاستقرار عبر الجاذبية عن طريق الحفاظ على الأنبوب واقفا لمدة 5 دقائق لفصله إلى طبقتين.
    2. استنشق PBS من البنية التحتية باستخدام حقنة 10 مل واستبدلها ب 10 مل طازجة من PBS لغسل آخر.
    3. كرر خطوة الغسيل هذه 4-5 مرات حتى يصبح PBS خاليا من الدم. هذا يشير إلى أن معظم ، إن لم يكن كل ، الدم تتم إزالته.
  6. بعد الغسيل ، أعد تعليق الأنسجة الدهنية في 10 مل من محلول الكولاجيناز (0.1٪ كولاجيناز من النوع 1 في PBS). أغلق الأنبوب بإحكام باستخدام البارافيلم ، ثم احتضنه في حمام مائي مهتز (37 درجة مئوية ، 80 دورة في الدقيقة ، لمدة 45 دقيقة) حتى يصبح النسيج متجانسا تقريبا.
    ملاحظة: تجنب الهضم الكامل للأنسجة (عندما يصبح المحلول متجانسا تماما مع الاختفاء التام لجميع بقايا / قطع الأنسجة) ، لأنه يؤثر سلبا على زراعة الخلايا بعد ذلك. عادة ، يستغرق الهضم 30-45 دقيقة.
  7. بمجرد الانتهاء من هضم الكولاجيناز ، دوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. دوامة الأنبوب مرة أخرى لمدة 10 ثوان ، تليها 5 دقائق أخرى الطرد المركزي. سيتم بعد ذلك ملاحظة ثلاث طبقات. تخلص بعناية من طبقة الزيت ، متبوعة بالطبقة المائية ، دون إزعاج حبيبات الكسر الوعائي اللدود (SVF).
    ملاحظة: قم بإزالة المادة الفائقة التي تحتوي على الخلايا الشحمية ومحلول الكولاجيناز. أولا ، قم بإزالة الخلايا الشحمية وطبقة الزيت المصاحبة لها باستخدام ماصة 10 مل لضمان الإزالة الكاملة لقطرات الزيت ، ثم قم بإزالة الطبقة المائية السفلية.
  8. أعد تعليق بيليه SVF في الجزء السفلي من الأنبوب في 10 مل من محلول BSA المعقم (1٪ ألبومين ، محلول مصل البقر Fraction V في PBS) ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
  9. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة بيليه SVF في 8.5 مل من الوسائط الكاملة ل Ad-MSCs (يتكون من خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل F-12 [DMEM / F12] من Dulbecco المكمل ب 10٪ FBS ، و 100 U / mL البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine).
  10. استزرع الخلايا في قارورة 25 سم 2 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. في اليوم التالي ، تحقق من الخلايا المرفقة ، وقم بإزالة الخلايا المعلقة ، واستبدل الوسائط. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط كل يومين.
  11. قم بتمرير الخلايا كل 5-7 أيام عندما تكون ملتقية بنسبة 80٪ -90٪ باستخدام Trypsin-EDTA. استخدم الخلايا بين الممرات 3-5 للتجارب اللاحقة الموضحة في هذا البروتوكول. ويرد في الشكل 1 عرض تخطيطي لجميع خطوات العزل.
    ملاحظة: عادة ، قد تختلف فعالية Trypisn-EDTA بين الموردين المختلفين ، لذا حاول تقليل وقت التربسين لتجنب التأثيرات السامة على الخلايا.

2. توصيف Ad-MSCs عن طريق التنميط المناعي باستخدام تحليلات قياس التدفق الخلوي

  1. في المقطع 3 ، قم بتقسيم الخلايا باستخدام Trypsin-EDTA. اغسل مع PBS 2 مرات ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  2. احتضان 100000 خلية عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة باستخدام إما CD90 أو CD105 المضاد للفئران (علامات اللحمة المتوسطة) أو CD34 (علامة المكونة للدم) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموسومة بالفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC).
  3. اغسل الخلايا وعلقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي25.

3. تقييم إمكانات التمايز ل Ad-MSCs المعزولة إلى مختلف سلالات اللحمة المتوسطة

  1. التمايز الأديبوجيني
    1. أعد تعليق الخلايا في وسائط كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.9) ، ثم قم بزراعة الخلايا بكثافة 3.7 × 104 خلايا / بئر في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. احتضان في 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 100٪ تقريبا ، والتي تستغرق عادة 3 أيام.
    2. عندما تصل الخلايا إلى الالتقاء المطلوب ، استبدل وسائط الانتشار بوسائط التمايز الشحمية (التي تتكون من وسائط LG-DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS ، و 100 U / mL penicillin ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine مع مكمل 1x أدبوجينيك ، مزود بمجموعة أدوات التعرف الوظيفي للخلايا الجذعية الوسيطة) للحث على تكوين الشحم. ثم قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام (0.5 مل / بئر). احرص على إجراء استبدال الوسائط بلطف حتى لا تعطل الفجوات الدهنية.
    3. بعد 21 يوما ، قم بتقييم التمايز الشحمي عن طريق الفحص المجهري لمظهر الفجوات الدهنية وعن طريق تلطيخ الزيت الأحمر.
    4. قم بإعداد محلول مخزون من الزيت الأحمر عن طريق إذابة 30 ملغ من بقعة الزيت الأحمر في 10 مل من الأيزوبروبانول ، ثم احتفظ به لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد حل عمل عن طريق خلط محلول مخزون 3 أجزاء مع جزأين من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ، واخلطهما جيدا ، واحتفظ به لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بالتصفية بعد ذلك بواسطة ورق التصفية.
    5. لتوثيق التمايز الشحمي ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الفورمالين المحايد المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ (0.75 مل / بئر) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا 2 مرات باستخدام PBS باستخدام 1 مل / بئر واحتضن الخلايا لمدة 5 دقائق في كل مرة. من المهم أن تستنشق PBS بالكامل قبل إضافة حل عمل Oil Red.
    6. بعد الغسيل الأخير ، أضف محلول عمل Oil Red إلى الخلايا واحتضنها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول البقع واغسل الخلايا بلطف 2 مرات باستخدام PBS. راقب قطرات الدهون الملطخة تحت المجهر.
  2. التمايز العظمي المنشأ
    1. البذور 7.4 × 10 3 خلايا / بئر (0.5 مل متوسطة / بئر) في صفيحة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 في وسائط كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.9) لمدة3 أيام للوصول إلى ما يقرب من 70٪ من التقاء.
    2. حث الخلايا مع ملحق osteogenic (المقدمة مع مجموعة) في وسائط LG-DMEM المكملة مع 10٪ FBS ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 2 مللي متر L-الجلوتامين.
    3. استمر في الحث العظمي لمدة 21 يوما ، مع تغيير وسائط التمايز كل 3 أيام.
    4. قم بإعداد حل عملي لبقعة Alizarin Red S عن طريق إذابة 200 ملغ من بقعة Alizarin Red S في 9 مل من ddH2O ، ثم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.1-4.3 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم و HCl. بعد ذلك ، قم بتكوين الحجم إلى 10 مل بواسطة ddH2O. بعد ذلك ، قم بإزالة أي رواسب عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح.
    5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ (0.75 مل / بئر) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا 2 مرات باستخدام PBS (1 مل / بئر). في كل مرة ، احتضن الخلايا لمدة 5 دقائق.
    6. احتضن الخلايا الثابتة بمحلول Alizarin-Red S المحضر بنسبة 2٪ لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    7. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول البقع ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام ddH2O ومرة واحدة باستخدام PBS ، ثم راقب المصفوفة خارج الخلية الغنية بالكالسيوم الملطخ لتقييم التمايز العظمي تحت المجهر.
  3. التمايز الغضروفي
    1. البذور 7.4 × 10 3 خلايا / بئر (0.5 مل متوسطة / بئر) في صفيحة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 في وسائط كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.9) لمدة3 أيام للوصول إلى ما يقرب من 70٪ من التقاء.
    2. عندما يتم الوصول إلى الالتقاء المطلوب ، قم بتحفيز التمايز الغضروفي للخلايا مع DMEM / F12 الخالي من المصل الذي يحتوي على السيلينيوم الأنسولين - الترانسفيرين (ITS) ، والملحق الغضروفي (المقدم مع المجموعة) ، والبنسلين 100 U / mL ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine21.
    3. احتضان الخلايا مع الوسائط الغضروفية لمدة 21 يوما ، مع تغيير وسائط التمايز الغضروفي كل 3 أيام.
    4. قم بإعداد محلول عمل من بقعة Alcian Blue 8GX على النحو التالي: أولا ، قم بإعداد محلول حمض الخليك الجليدي بنسبة 3٪ في ddH2 O عن طريق إضافة 3 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 97 مل من ddH2O. بعد ذلك ، قم بإعداد حل عملي من بقعة Alcian Blue 8GX عن طريق خلط 0.1 جم في 100 مل من محلول الحمض الجليدي 3٪ ، وإزالة أي رواسب عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح.
    5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ (0.75 مل / بئر) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا 2 مرات باستخدام PBS (1 مل / بئر). في كل مرة ، احتضن الخلايا لمدة 5 دقائق.
    6. الخطوة التالية هي احتضان الخلايا في بقعة Alcian Blue 8GX المحضرة بنسبة 0.1٪ في حمض الخليك الجليدي بنسبة 3٪ لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا الملطخة مرتين باستخدام ddH2O ومرة واحدة باستخدام PBS ، ثم راقب البروتيوغليكان الكبريتي الملون تحت المجهر.

4. التمييز بين Ad-MSCs و IPCs

  1. في المقطع 3 ، قم بتقسيم Ad-MSCs باستخدام Trypsin- EDTA. أولا ، قم بإزالة الوسائط ، ثم اغسل الخلايا بينما لا تزال متصلة في قارورة الثقافة ب 5 مل من PBS. بعد ذلك ، أضف 5 مل من التربسين- EDTA إلى قارورة 75 سم2 واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3-10 دقائق.
    ملاحظة: حاول حث الخلايا في الممرات المبكرة ، عادة بين P3-P5 ، حيث تؤثر الممرات المتأخرة سلبا على خصائص الخلايا وقدرات التمايز17,24.
  2. بعد ذلك ، افحص الخلايا بحثا عن مفرزة وعن كونها معلقة أحادية الخلية. أضف 5 مل من وسائط DMEM/F12 الكاملة إلى القارورة لمنع عمل التربسين. اجمع تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب 15 مل ، ثم أضف 5 مل أخرى من وسائط DMEM / F12 الكاملة إلى الأنبوب.
  3. الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة 2 دقيقة لتكوير الخلايا.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، وقم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × g لمدة دقيقتين ، ثم أعد تعليق حبيبة الخلية في 3-5 مل من وسائط DMEM / F12 الكاملة.
  5. عد الخلايا باستخدام صبغة استبعاد تريبان الزرقاء ومقياس الدم.
  6. ثم ، قم بزرع الخلايا في ألواح من 6 آبار (1 × 10 6 خلايا / لوحة) ولوحة 12 بئرا (لفحص GSIS ؛ 1 × 106 خلايا / لوحة) واحتضنها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 في وسائط كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.9.) لمدة 3 أيام للوصول إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء.
  7. في يوم الحث ، قم بإزالة الوسائط ، واغسل الخلايا باستخدام PBS ، ثم قم بتحفيز الخلايا مسبقا لمدة يومين بواسطة وسائط ما قبل الحث (DMEM / F12 مكمل بنسبة 10٪ FBS ، و 100 U / mL penicillin ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine ، و 10 mM nicotinamide [NA] ، و 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
  8. حث الخلايا لمدة يوم آخر باستخدام DMEM HIGH GLUCOSE (HG-DMEM ، 4.5g / L glucose) مع 2.5٪ FBS ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، 2 mM L-الجلوتامين ، 10 mM NA ، و 1mM β-mercaptoethanol. جمع كريات الخلايا في نهاية هذه المرحلة (الخلايا D3 المعينة في هذا البروتوكول).
  9. احتضن الخلايا لمدة 7 أيام إضافية في وسائط تحريض التمايز النهائية المكونة من HG-DMEM المكملة بنسبة 2.5٪ FBS ، و 100 U / mL penicillin ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine ، و 10 mM NA ، و 1mM β-mercaptoethanol ، و 10 nM exendin-4.
  10. في نهاية الفترة المحددة ، قم بجمع كريات الخلايا (المسماة Final في هذا البروتوكول) ، وتقييم التمايز الناجح للخلايا عن طريق تلطيخ DTZ وفحص GSIS ، على النحو التالي في هذا البروتوكول.
  11. تقييم التصنيف الدولي للبراءات الذي تم إنشاؤه باتباع الخطوتين 5 و6 أدناه.

5. تلطيخ ديثيزون

  1. تحضير محلول مخزون البقع ثنائي الثيزون (DTZ) على النحو التالي: يذوب تماما 25 ملغ من DTZ في 2.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، ويقسم إلى أليكوتس ، ويخزن في -20 درجة مئوية في الظلام حتى الاستخدام.
  2. للتلطيخ ، قم بإعداد حل عمل 1:100 (الحجم / الحجم) عن طريق تخفيف محلول المخزون في وسط ثقافة كامل (HG-DMEM مكمل بنسبة 5٪ FBS ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، و 2 mM L-glutamine). ثم قم بتصفية حل العمل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
  3. بعد ذلك ، بالنسبة لخلايا زراعة تلطيخ DTZ المحددة في لوحة من 6 آبار ، وبعد شفط وسائط الثقافة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم أضف 2 مل من محلول عمل DTZ في كل بئر. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 .
  4. اغسل الخلايا بعناية 2 مرات باستخدام PBS. بعد الغسيل الأخير ، أضف 2 مل من PBS في كل بئر. ثم ، لاحظ IPCs القرمزية الملطخة باللون الأحمر تحت المجهر المقلوب. استخدم Ad-MSCs غير المستحثة التي تم زراعتها في البداية في وسط نمو كامل (10٪ FBS - DMEM/F12) كعنصر تحكم.

6. التعبير الجيني لعلامات الخلايا β بواسطة RT-qPCR

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. بعد التمايز ، اجمع كريات الخلايا وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قم بتعليق كل حبيبة خلية (مشتقة من الآبار الستة لصفيحة واحدة من 6 آبار مجمعة) في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي للجوانيديوم ثيوسيانات في أنبوب خال من النوكليز 1.5 مل ، إلى جانب السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. احتضان العينات المحللة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بالتفكك الكامل لمجمعات البروتين النووي.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي ، وقم بتغطية الأنابيب بإحكام ليتم هزها بقوة باليد لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، احتضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي للعينات عند 13800 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سيؤدي ذلك إلى فصل الخليط إلى طور كلوروفورم أقل ، وطور بيني ، وطور مائي علوي عديم اللون ، مع بقاء الحمض النووي الريبي في المرحلة المائية.
    4. ضع الطور المائي العلوي في أنبوب جديد ، مع تجنب لمس الطور البيني بعناية.
    5. أضف 600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى الطور المائي (حجم 1: 1) ، ثم اخلط العينات جيدا عن طريق الانعكاس 25 مرة ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    6. الطرد المركزي للعينات عند 18800 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يشكل الحمض النووي الريبي المترسب حبيبة صغيرة تشبه الهلام على جانب الأنبوب.
    7. قم بإزالة supernatant واغسل الكريات ب 1 مل من الإيثانول البارد المثلج بنسبة 80٪. بعد إضافة الإيثانول ، قم بإجراء سحب متعدد ببطء لحبيبات الحمض النووي الريبي لمدة 10 ثوان.
    8. الطرد المركزي للعينات لمدة 5 دقائق عند 9600 × جم عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة واترك كريات الحمض النووي الريبي لتجف في الهواء لمدة 5-10 دقائق.
    9. بعد التجفيف ، قم بإذابة كريات الحمض النووي الريبي في 25-100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase (وفقا لحجم الكريات الأولي) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات حتى الذوبان الكامل في أنابيب خالية من النوكليز 1.5 مل. تجنب التجفيف المفرط لحبيبات الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: عادة ما تصبح الكريات شفافة عندما تجف. ومع ذلك ، بمجرد أن يصبح الأمر واضحا ، أعد تعليقه على الفور لتجنب الجفاف المفرط للحبيبات.
    10. حدد كمية الحمض النووي الريبي عن طريق تحديد الكثافات البصرية (OD) عند 260 نانومتر و 280 نانومتر، باستخدام الماء الخالي من النوكليز على أنه فارغ.
    11. تأكد من أن العينات تحتوي على OD260/OD280 = 1.8-2.0.
  2. تخليق cDNA
    1. توليف cDNA من الحمض النووي الريبي الكلي المعزول باستخدام مجموعة توليف cDNA.
    2. قم بإجراء تفاعل تخليق cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر، أضف حجما من محلول الحمض النووي الريبي يحتوي على 0.5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى المزيج الرئيسي للتفاعل الموضح في الجدول 1.
    3. بعد إضافة الحمض النووي الريبي إلى المزيج الرئيسي ، أدخل الخليط من خلال برنامج ركوب الدراجات من 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لدورة واحدة ، تليها دورة تعطيل 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، باستخدام دورة حرارية.
    4. قم بتخفيف cDNA باستخدام الماء الخالي من النوكليز إلى تركيز نهائي قدره 2 نانوغرام / ميكرولتر.
  3. RT-qPCR باستخدام SYBR جرين ماستر ميكس
    1. قم بإجراء تفاعل RT-qPCR لكل جين مستهدف باستخدام قالب cDNA وفقا لمزيج التفاعل الموضح في الجدول 2. قم بجميع التدابير في ثلاثة أضعاف.
    2. ويبين الجدول 3 مجموعات الاشعال المستخدمة. قم بتنفيذ جميع إجراءات RT-qPCR على الجليد.
    3. قم بتنفيذ تفاعل RT-qPCR باستخدام جهاز PCR في الوقت الفعلي على إعدادات البرنامج الافتراضية. وشملت ظروف التدوير الحراري تمسخ أولي قدره 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 45 دورة من تمسخ (95 درجة مئوية، 15 ثانية) والتلدين/التمديد المشترك (60 درجة مئوية، 1 دقيقة).
    4. تحديد قيم Ct والكشف عن مستويات التعبير وفقا ل 2-ΔΔCt ، مع β-actin كعنصر تحكم داخلي.

cDNA توليف المزيج الرئيسيالحجم (ميكرولتر)
5x cDNA توليف المخزن المؤقت4
دنتي بي2
الحمض النووي الريبي التمهيدي1
فيرسو انزيم ميكس1
محسن RT1
المياه الخالية من النوكليزمتغير
إجمالي الحمض النووي الريبيمتغير
إجمالي حجم التفاعل20

الجدول 1: أحجام المزيج الرئيسي لتخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين.

مزيج تفاعل RT-qPCRالحجم (ميكرولتر)التركيز النهائي في 10 ميكرولتر
cDNA22 نانوغرام / بئر
RT-qPCR التمهيدي الأمامي (3 ميكرومتر)1300 نانومتر
RT-qPCR التمهيدي العكسي (3 ميكرومتر)1300 نانومتر
المياه الخالية من النوكليز1-------
2x SYBR الأخضر ماستر ميكس51x
إجمالي حجم التفاعل10

الجدول 2: خليط تفاعل RT-qPCR.

الجينالتمهيدي الأماميالتمهيدي العكسي
فوكسا2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
مافاTTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
إنس-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTGTGA
β أكتينTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

الجدول 3: تسلسلات تمهيدية أمامية وعكسية.

7. إفراز الأنسولين بتحفيز الجلوكوز

  1. إعداد المخزن المؤقت لبيكربونات رينجر (KRB) من كريب
    1. قم بإعداد محلول كريب رينجر بيكربونات (KRB) العازل مع كل من الجلوكوز 2 مللي متر (الجلوكوز المنخفض) وتركيزات الجلوكوز 20 مللي متر (الجلوكوز العالي) لفحص إفراز الأنسولين الذي يحفز الجلوكوز (GSIS). وترد في الجدول 4 المكونات المستخدمة لإعداد المخزن المؤقت ل KRB.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت باستخدام 1 N HCl إلى حوالي 7.25-7.35 (أي 0.1-0.2 وحدة أقل من الرقم الهيدروجيني المطلوب 7.4 ، لأنه قد يرتفع أثناء الترشيح).
    3. أضف ألبومين مصل البقر (BSA) طازجا بتركيز 0.1٪ (الوزن / الحجم).
    4. أضف الجلوكوز بعد ذلك (18 مجم مقابل 50 مل من KRB لإعداد المخزن المؤقت KRB منخفض الجلوكوز 2 mM ، و 180 mg ل 50 مل من KRB لإعداد المخزن المؤقت KRB عالي الجلوكوز 20 mM).
    5. قم بتعقيم المخازن المؤقتة LG و HG KRB المعدة عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر لتكون جاهزة لفحص GSIS.
  2. فحص GSIS
    1. في البداية البذور 1 × 105 خلايا / بئر في لوحة زراعة الخلايا 12 بئر وحث هذه الخلايا باستخدام نفس بروتوكول تحريض التمايز بالضبط.
    2. في نهاية بروتوكول الحث ، اغسل بلطف IPCs التي تم إنشاؤها (في اللوحة) 2 مرات مع PBS ومرة واحدة مع LG-KRB.
    3. بعد ذلك ، احتضن IPCs مع 300 ميكرولتر من LG-KRB / well لمدة 1 ساعة ، ثم تجاهل هذا المخزن المؤقت.
    4. بعد ذلك ، احتضن IPCs ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2 mM (LG) أو 20 mM (HG) KRB لمدة 1 ساعة إضافية. في نهاية فترة الحضانة ، قم بجمع supernatant وتخزينه عند -80 درجة مئوية لفحص الأنسولين المفرزة اللاحقة باستخدام مجموعة ELISA التجارية واتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: حاول أن تكون لطيفا قدر الإمكان أثناء شفط أو إضافة المخزن المؤقت PBS و KRB عند إجراء فحص GSIS.
مكونتركيز
كلوريد المغنيسيوم (اللامائي)0.0468 جم/لتر
كلوريد البوتاسيوم0.34 جم/لتر
كلوريد الصوديوم7.00 جم/لتر
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (اللامائي)0.1 جم/لتر
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (اللامائي)0.18 جم/لتر
بيكربونات الصوديوم1.26 جم/لتر
كلوريد الكالسيوم0.2997 جم/لتر

الجدول 4: المكونات المستخدمة لإعداد المخزن المؤقت KRB.

8. التحليل الإحصائي

  1. التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). تم إجراء جميع المقارنات باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) واختبار توكي اللاحق المخصص باستخدام برنامج إحصائي. واعتبرت النتائج ذات القيم p ** p ≤ 0.01 و * p ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتوصيف Ad-MSCs
وكما هو مبين في الشكل 2، أظهرت الخلايا المعزولة من الأنسجة الدهنية وجود مجموعة غير متجانسة من الخلايا المستديرة والشبيهة بالخلايا الليفية بدءا من اليوم التالي للعزل (الشكل 2 أ). بعد 4 أيام من العزلة ، بدأت الخلايا الليفية في الزيادة في العدد والحجم وتنمو كمجموعة متجانسة من خلال الممر 1 (الشكل 2B ، C). استمرت هذه الخلايا في النمو كخلايا تشبه الخلايا الليفية المرتبطة بالبلاستيك ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تمكنا من تقديم بروتوكول مفصل لعزل Ad-MSCs عن الدهون البربخية للفئران والتمايز بين Ad-MSCs هذه في IPCs. في الواقع ، تعد الدهون اللبدينة للفئران مصدرا يمكن الوصول إليه بسهولة للأنسجة الدهنية للحصول على Ad-MSCs ولا تتطلب أي معدات خاصة ، لا للجمع ولا لمعالجة15،26،27. أظهرت Ad-MSCs المعزولة توسعا ثقافيا ممتازا وعرضت جميع المعايير التي يجب تعريفها على أنها MSCs. تم وصف البروتوكول المستخدم سابقا مع تعديلات طفيفة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن جميع المؤلفين المشاركين عدم وجود تضارب في المصالح المرتبطة بهذا العمل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر الدكتورة روضة سمير محمد ، ماجستير ، أخصائي طبيب بيطري ، كلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) للمساعدة في تشريح الفئران.

كما نود أن نعرب عن تقديرنا وتقديرنا للجهود التي تبذلها كلية الإعلام بالجامعة البريطانية في مصر لإنتاج وتحرير فيديو هذه المخطوطة.

نود أن نشكر الآنسة فاطمة مسعود، ماجستير، محاضرة مساعدة في اللغة الإنجليزية، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) على مراجعة المخطوطة وتصحيحها باللغة الإنجليزية.

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مركز أبحاث وتطوير الأدوية (CDRD) ، كلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) ، القاهرة ، مصر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الألبومين ، مصل الأبقار Fraction VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةA5533
هيدروكسيد الأمونيومفيشر العلمي ، ألمانيا
الأجسام المضادة للفئران CD90 ، تقنيات الخلايا الجذعية FITC60024FI
ألبومين مصل الأبقارSigma AldrichA3912
كلوريد الكالسيومفيشر Scientific ، ألمانيا
CD105 الجسم المضاد أحادي النسيلة ، FITCThermo Fisher Scientific ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةMA1-19594
CD34 الأجسام المضادة متعددة النسيلةالحرارية فيشر العلمية ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةPA5-85917
كلوروفورمفيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
الكولاجيناز من النوع الأول ، مسحوقجيبكو ، ثيرمو فيشر ، الولايات المتحدة الأمريكية17018029
D-Glucose اللامائي ، نقاء إضافيفيشر Scientific ، ألمانياG / 0450/53
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) فيشرساينتفيك ، ألمانياBP231-100
تلطيخ DithizoneSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةD5130
DMEM - نسبة عالية من الجلوكوز 4.5 جم / لترLonza ، سويسرا12-604F
DMEM - منخفض الجلوكوز 1 جم / لترلونزا ، سويسرا12-707F
DMEM / F12 متوسطلونزا ، سويسراBE12-719F
DNA / RNAse مياه خاليةمن Gibco Thermo Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية10977-035
الإيثانول المطلق ، درجة البيولوجيا الجزيئيةSigma-Aldrich ، ألمانيا24103
Exendin-4سيجما ألدريتش ، ألمانياE7144
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو ثيرمو فيشر ، البرازيل10270-106
الفورمالديهايد 37٪فيشر ساينتيفيك
حمض الهيدروكلوريك (HCl)فيشر ساينتفيك ، ألمانيا
الأيزوبروبانول ، درجة البيولوجيا الجزيئيةفيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةBP2618500
L-GlutamineGibco Thermo Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية25030-024
كلوريد المغنيسيوم (اللامائية)فيشر العلمية ، ألمانيا
مجموعة التعريف الوظيفي للخلايا الجذعية الوسيطةR & amp شركة D systems Inc. ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكيةSC006
نيكوتيناميدسيجما ألدريتش ، ألمانياN0636
زيت وصمة عارحمراء سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةO0625
البنسلين الستربتومايسين الأمفوتريسينجيبكو ثيرمو فيشر ، الولايات المتحدةالأمريكية 15240062
ملحي مخزن بالفوسفات ، 1X ، بدون Ca / MgLonza ، سويسراBE17-516F
البوتاسيوم كلوريدفيشر العلمي ، ألمانيا
الأنسولين الفئران ELISAKit Cloud-Clone Corp. ، الولايات المتحدة الأمريكيةCEA682Ra
بيكربونات الصوديومفيشر العلمية ، ألمانيا
كلوريد الصوديومفيشر العلمية ، ألمانيا
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (اللامائية)فيشر العلمية ، ألمانيا
الصوديوم الفوسفات أحادي القاعدة (اللامائية)فيشر العلمي ، ألمانيا
SYBR Green MaximaThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةK0221
، 0.2 ميكرونكورنينج ، الولايات المتحدةالأمريكية 431224
TRIzolThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية15596026
Trypan blueGibco Thermo Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية15250061
Trypsin-Versene-EDTA ، 1XLonza ، سويسراCC-5012
Verso مجموعة توليف cDNAThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةAB-1453 / A &
beta ؛ -mercaptoethanolSigma-Aldrich ، ألمانياM3148
محلول مرشح حقنة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43(2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572(2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387(2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345(2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236(2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339(2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108(2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221(2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , Hoboken, NJ. 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277(2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652(2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16(2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232(2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838(2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484(2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD

مقالات ذات صلة