مقالة منهجية

تسجيل فجوة تقاطع التيار من البويضات Xenopus

DOI:

10.3791/63361

⸱

يناير 21, 2022

 , 
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير غير المتجانس عن connexins و innexins في بويضات Xenopus هو نهج قوي لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية لتقاطعات الفجوة (GJs). ومع ذلك ، فإن هذا النهج يمثل تحديا تقنيا لأنه يتطلب مشبك جهد تفاضلي لبويضتين متعارضتين تتشاركان أرضية مشتركة. على الرغم من أن عددا صغيرا من المختبرات قد نجح في تنفيذ هذه التقنية ، إلا أن جميعها استخدمت بشكل أساسي إما مكبرات صوت محلية الصنع أو مكبرات صوت تجارية تم تصميمها لتسجيل البويضة الواحدة. غالبا ما يكون من الصعب على المختبرات الأخرى تنفيذ هذه التقنية. على الرغم من أن وضع قياس التيار الجانبي العالي قد تم دمجه في مكبر صوت تجاري لتسجيلات الجهد المزدوج للبويضات المشبك ، إلا أنه لم يكن هناك تقرير عن تطبيقه حتى دراستنا الأخيرة. لقد جعلنا نهج قياس التيار الجانبي العالي أكثر عملية وملاءمة من خلال إدخال العديد من التعديلات التقنية ، بما في ذلك بناء منصة تسجيل قائمة على المغناطيسية تسمح بوضع البويضات والأقطاب الكهربائية المختلفة بدقة ، واستخدام محلول الحمام كموصل في الأقطاب الكهربائية التفاضلية للجهد ، واعتماد قطب KCl تجاري منخفض التسرب كقطب مرجعي ، تصنيع أقطاب التيار والجهد من الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق ، وتحديد مواقع جميع الأقطاب الكهربائية باستخدام الأجهزة القائمة على المغناطيسية. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتسجيلات مريحة وقوية للتيار الوصلة (Ij) بين بويضتين Xenopus متعارضتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GJs هي قنوات بين الخلايا قد تسمح بالتدفق الحالي وتبادل الجزيئات الخلوية الصغيرة بين الخلايا المجاورة. وهي موجودة في العديد من أنواع الخلايا وتؤدي وظائف فسيولوجية متنوعة. تتشكل GJs في الفقاريات بواسطة connexins ، في حين أن تلك الموجودة في اللافقاريات بواسطة innexins. يتكون كل GJ من قناتين نصفيتين متجاورين مع 6 أو 8 وحدات فرعية لكل نصف قناة ، اعتمادا على ما إذا كانت connexins أو innexins 1,2,3. لدى البشر 21 جينا كونيكسين4 ، في حين أن نماذج اللافقاريات الشائعة الاستخدام C. elegans و Drosophila melanogaster لديها 25 و 8 جينات innexin ، على التوالي 5,6. قد يزيد الربط البديل للنسخ الجينية من تنوع بروتينات GJ ، على الأقل بالنسبة ل innexins 7,8.

يمكن تقسيم GJs إلى ثلاث فئات بناء على التراكيب الجزيئية: متماثلة النمط ، غير متجانسة ، وغير متجانسة. يحتوي GJ المتجانس على جميع وحداته الفرعية متطابقة. يحتوي GJ غير المتجانس على قناتين متماثلتين ، لكن النصفين يتشكلان بواسطة بروتينين GJ مختلفين. يحتوي GJ غير المتجانس على قناة نصف متجانسة واحدة على الأقل. قد تمنح الاختلافات الجزيئية ل GJs خصائص فيزيائية حيوية متميزة مهمة لوظائفها الفسيولوجية. يتم تعديل الخصائص الفيزيائية الحيوية GJ أيضا بواسطة البروتينات التنظيمية9. لفهم كيفية أداء GJs لوظائفها الفسيولوجية ، من المهم معرفة تركيباتها الجزيئية وخصائصها الفيزيائية الحيوية وأدوار البروتينات التنظيمية في وظائفها.

غالبا ما تستخدم أنظمة التعبير غير المتجانسة لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية للقنوات الأيونية ، بما في ذلك GJs ، وتأثيرات البروتينات التنظيمية عليها. نظرا لأن أنظمة التعبير غير المتجانسة تسمح بالتعبير عن بروتينات محددة ، فهي عموما أكثر قابلية لتشريح وظائف البروتين من الأنسجة الأصلية حيث يمكن للبروتينات ذات الوظائف الزائدة أن تعقد التحليل ، ويمكن أن يكون تسجيل Ij غير قابل للتحقيق. لسوء الحظ ، فإن خطوط الخلايا الأكثر استخداما باستثناء خلية Neuro-2A غير مناسبة لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية GJ بسبب المضاعفات الناجمة عن الوصلات الذاتية. حتى الخلايا العصبية 2A ليست مناسبة دائما لهذا النوع من التحليل. على سبيل المثال ، لم نتمكن من اكتشاف أي Ij في خلايا Neuro-2A المنقولة مع innexins UNC-7 و UNC-9 إما في غياب أو وجود UNC-1 (غير منشور) ، وهو مطلوب لوظيفة UNC-9 GJs في C. elegans 9,10. من ناحية أخرى ، تعد بويضات Xenopus نظاما بديلا مفيدا للتحليلات الكهروفسيولوجية ل GJs. على الرغم من أنها تعبر عن بروتين GJ داخلي المنشأ ، connexin 38 (Cx38) 11 ، يمكن تجنب المضاعفات المحتملة بسهولة عن طريق حقن oligonucleotide12 مضاد للإحساس محدد. ومع ذلك ، فإن تحليلات GJs مع بويضات Xenopus تتطلب مشبك الجهد التفاضلي لخليتين متجاورين ، وهو أمر صعب تقنيا. تم الإبلاغ عن النجاحات المبكرة لمشبك الجهد المزدوج لبلاستونات الضفادع منذ حوالي 40 عاما13,14. منذ ذلك الحين ، استخدمت العديد من الدراسات هذه التقنية لتسجيل Ij في بويضات Xenopus المقترنة. ومع ذلك ، فقد تم إجراء جميع الدراسات السابقة بشكل أساسي إما باستخدام مكبرات صوت محلية الصنع12،15،16 أو مكبرات صوت تجارية مصممة للتسجيلات على البويضات الفردية (GeneClamp 500 ، AxoClamp 2A ، أو AxoClamp 2B ، Axon Instruments ، Union City ، CA) 8،17،18،19،20 . نظرا لأنه حتى مكبرات الصوت التجارية لا توفر تعليمات لمشبك جهد البويضة المزدوج ، فغالبا ما يكون من الصعب على المختبرات الكهروفسيولوجية الجديدة أو الأقل تطورا تنفيذ هذه التقنية.

تم تطوير مضخم صوت تجاري واحد فقط لمشبك جهد البويضة المزدوج ، OC-725C من Warner Instruments (جدول المواد ، الشكل 1A). يمكن استخدام هذا المضخم إما في الوضع القياسي (للبويضات المفردة) أو وضع قياس التيار الجانبي العالي (للبويضات المفردة أو المزدوجة) اعتمادا على ما إذا كان هناك مقبسان في مسبار الجهد الخاص به متصلين (الشكل 1B ، C). ومع ذلك ، حتى دراستنا الأخيرة7 ، لم يكن هناك منشور واحد يصف استخدام هذا مكبر الصوت في وضع قياس التيار الجانبي العالي. على الرغم من أن مكبر الصوت قد تم استخدامه من قبل مختبر آخر لتسجيل البويضات المزدوجة ، إلا أنه تم استخدامه في الوضع القياسي بدلا من الوضع الجانبي العالي21,22. قد يكون هذا النقص في التقارير التي تستخدم مكبر الصوت في وضع القياس الحالي الجانبي العالي بسبب صعوبات فنية. لم نتمكن من الحصول على تسجيلات البويضات المزدوجة المستقرة باستخدام الوضع الجانبي العالي باتباع تعليمات من الشركة المصنعة. على مر السنين ، جربنا ثلاث طرق مختلفة لتسجيلات البويضات المزدوجة ، بما في ذلك استخدام اثنين من مكبرات الصوت OC-725C في وضع قياس التيار الجانبي العالي ، ومضخمي الصوت OC-725C في الوضع القياسي ، واثنين من مكبرات الصوت من شركة تصنيع أخرى. نجحنا في نهاية المطاف في الحصول على تسجيلات مستقرة فقط مع النهج الأول بعد تجربة وخطأ مكثفين. يصف هذا المنشور ويوضح الإجراءات التي نستخدمها للتعبير عن بروتينات GJ في بويضات Xenopus ، وتسجيل Ij باستخدام وضع قياس التيار الجانبي العالي ، وتحليل البيانات الكهروفسيولوجية باستخدام البرامج التجارية الشائعة. يمكن العثور على معلومات إضافية حول تقنية المشبك المزدوج الجهد في منشورات أخرى19,23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء العمليات الجراحية وفقا لبروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات في كلية الطب بجامعة كونيتيكت.

1. جراحة الضفدع وإعداد البويضات منزوعة الجريبات

  1. تخدير أنثى ضفدع أفريقي مخالب بالغ (Xenopus laevis) (جدول المواد) عن طريق الانغماس في محلول تريكاين بارد (مع الثلج) (~ 300 ملغ / لتر).
  2. انتظر (~ 15 دقيقة) حتى يظهر الضفدع استجابة قليلة أو معدومة للضغط على قدميه الشبكيتين. ضع الضفدع على طاولة العمليات مع بطنه متجها لأعلى.
  3. بعد شق طولي (طوله 8-10 مم) في منطقة أسفل البطن اليسرى أو اليمنى ، اسحب بلطف قطعة صغيرة من أنسجة المبيض بزوج من الملقط ، وقطع أنسجة المبيض بزوج من المقص الصغير.
  4. اغمري أنسجة المبيض الحرة على الفور في محلول ND96 الخالي من Ca 2+ (NaCl 99 mM ، KCl 2 mM ، MgCl2 1 mM ، HEPES 5 mM ، pH 7.5) داخل طبق Petri 60 مم.
  5. بعد إغلاق الشق عن طريق خيوط بسيطة متقطعة باستخدام خياطة حريرية 5-0 (جدول المواد) ، ضع الضفدع مرة أخرى في خزان مياه ضحلة للتعافي.
    ملاحظة: يتم إغلاق الشق في خطوتين: أولا طبقات الصفاق والعضلات، ثم طبقة الجلد. يخضع كل ضفدع ل 5 عمليات جراحية مع فاصل زمني لا يقل عن 4 أسابيع بين عمليتين جراحيتين متتاليتين.
  6. انقل أنسجة المبيض المعزولة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من محلول ND96 الخالي من Ca2 + مع 20 ملغ من الكولاجيناز (جدول المواد) و 20 ملغ من الهيالورونيداز (جدول المواد).
  7. هز الأنبوب على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تصبح جميع البويضات معزولة (انفرادية).
  8. بعد ذلك ، قم بنقل 30-50 بويضة إلى طبق بتري باستخدام ماصة باستور زجاجية وفحص البويضات بشكل متكرر تحت المجهر المجسم (أعلى قوة تكبير ≥25x) لتحديد ما إذا كانت منزوعة الجريبات.
    ملاحظة: يجب "قطع" ماصة باستور إلى فتحة طرف أوسع باستخدام ناسخ الماس (جدول المواد) وملتهبتها لتنعيم حافة القطع.
  9. بمجرد إزالة الجريبات بنسبة 70٪ -80٪ من البويضات ، قم بصب محلول الإنزيم عن طريق إمالة الأنبوب بلطف. اغسل البويضات 5 مرات عن طريق ملء الأنبوب بمحلول ND96 (NaCl 96 mM ، KCl 2 mM ، CaCl 2 1.8 mM ، MgCl2 1 mM ، HEPES 5 mM ، pH 7.5) وصب المحلول.
  10. بعد الغسيل النهائي ، انقل البويضات إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على محلول ND96. اختر وانقل البويضات الكبيرة وذات المظهر الصحي إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على محلول ND96 مكمل ببيروفات الصوديوم (2 ملليمتر) والبنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل) باستخدام ماصة باستور الزجاجية النظيفة.
    ملاحظة: "البويضات الكبيرة وذات المظهر الصحي" هي تلك الموجودة في المرحلتين الخامسة والسادسة التي لا تظهر أي علامة على الإفراط في الهضم بواسطة الإنزيمات.
  11. ضع طبق بتري الذي يحتوي على البويضات المنتقاة داخل غرفة بيئية (15-18 درجة مئوية).

2. تعبير بروتين GJ

  1. توليف الحمض النووي الريبي التكميلي (cRNA) لكونيكسين معين أو إنكسين في المختبر باستخدام مجموعة نسخ الحمض النووي الريبي (جدول المواد) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. عجل cRNA باستخدام طريقة كلوريد الليثيوم الموصوفة في دليل المستخدم لمجموعة نسخ الحمض النووي الريبي.
  3. اغسل الكريات بالإيثانول بنسبة 70٪ ، وقم بإذابتها في 20 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكليز ، وأضف 1 ميكرولتر من مثبط الريبونوكلياز (40 U ، جدول المواد).
  4. قياس تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال باستخدام مقياس الطيف الضوئي (جدول المواد).
  5. امزج cRNA مع أوليغو مضاد للإحساس Cx38 بحيث تكون التركيزات النهائية 200-1000 نانوغرام / ميكرولتر cRNA و 100 نانوغرام / ميكرولتر أوليغو.
    ملاحظة: تسلسل القلة هو 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′ ، والذي يتوافق مع النيوكليوتيدات من -5 إلى +25 في Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI الانضمام: NM_001088018)11. يتم الاحتفاظ بالأوليغو كمحلول مخزون (2.0 مجم / مل) قبل خلطه مع cRNA.
  6. تخلص من الجسيمات الموجودة في cRNA عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي دقيق (~ 16000 × جم) لمدة دقيقتين ، ونقل المادة الفائقة بالكامل بسرعة إلى أنبوب جديد عن طريق السحب (تجنب إزعاج الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق).
  7. قسم cRNA إلى أليكوتس (2.5 ميكرولتر / قارورة) ، وقم بتخزين الأليكوت في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  8. قم بإعداد طبق حقن البويضات عن طريق لصق قطعة صغيرة (~ 1 سم × 1 سم) من شبكة النايلون (جدول المواد) في الجزء السفلي من طبق بتري 35 مم باستخدام مادة لاصقة إيبوكسي سريعة العلاج.
    ملاحظة: طبق حقن البويضات قابل لإعادة الاستخدام. اغسله بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد كل استخدام.
  9. املأ طبق حقن البويضات في منتصف الطريق تقريبا بمحلول ND96 (مع تكملة البيروفات والبنسلين الستربتومايسين).
  10. ضع 25-30 بويضة في صفوف داخل طبق بتري.
  11. قم بإعداد ماصات زجاجية دقيقة لحقن البويضات باتباع الإرشادات الواردة في دليل المستخدم الخاص بحاقن النانولتر الآلي (جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام مشطوف القطب الكهربائي الدقيق (جدول المواد) في إنتاج ماصات دقيقة حادة للحقن تسبب الحد الأدنى من الضرر للبويضات.
  12. ردم ماصة حقن بزيت معدني خفيف الوزن ، وأدخلها في حامل الماصة الدقيقة للحاقن.
  13. انقل cRNA من أحد الأليكوتات المخزنة إلى السطح الداخلي لغطاء طبق بتري أو أسفله عن طريق السحب.
  14. قم بشفط قطرة cRNA في طرف الماصة الدقيقة عن طريق الضغط على زر FILL في وحدة تحكم الحاقن.
  15. حقن cRNA (~ 50 nL / oocyte) عن طريق الضغط على زر حقن .
    ملاحظة: قد يتم تعيين حجم الحقن بواسطة مفاتيح الغمس في وحدة تحكم الحاقن.
  16. انقل البويضات المحقونة إلى طبق بتري جديد يحتوي على محلول ND96 (مكمل بالبيروفات والبنسلين الستربتومايسين) ، واحتفظ بها داخل الغرفة البيئية (15-18 درجة مئوية) لمدة 1-3 أيام (اعتمادا على سرعة تعبير بروتين GJ ومستواه). استبدل المحلول يوميا عن طريق نقل البويضات إلى طبق بتري جديد.

3. الاقتران البويضات

  1. انقل عددا قليلا من البويضات المحقونة إلى طبق بتري 35 مم يحتوي على محلول ND96.
  2. استخدم اثنين من الملقط الناعم (جدول المواد) لتقشير غشاء الفيتيلين الشفاف الذي يلف البويضة بلطف.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري شحذ أطراف الملقط قبل الاستخدام الأول ومن وقت لآخر ، باستخدام قطعة من ورق الصنفرة الناعم (600 جريت).
  3. ضع 2 بويضات لكل بئر في غرفة اقتران البويضات (الشكل 1D) التي تحتوي على محلول ND96 (مكمل بالبيروفات والبنسلين-ستربتومايسين).
    ملاحظة: يتم بناء غرفة إقران البويضات عن طريق لصق قطعة صغيرة من Microwell Minitray (جدول المواد) في الجزء السفلي من طبق بتري 35 مم (جدول المواد) باستخدام لاصق إيبوكسي سريع العلاج. يتم قطع Minitray إلى قطع صغيرة باستخدام قاطع الأسلاك الساخنة (جدول المواد). تم وصف استخدام Minitray لإقران البويضات في الأصل من قبل الآخرين24. على الرغم من أن بروتين GJ قد يوزع بشكل غير منتظم في غشاء خلية البويضة اعتمادا على خصائص الشحنة لبقايا الأحماض الأمينية في مجالاته الخلوية25 ، إلا أن الاقتران العشوائي (دون تمييز بين القطبين الحيواني والنباتي للبويضة) يبدو كافيا بشكل عام.
  4. احتفظ بطبق بتري الذي يحتوي على البويضات المقترنة في RT على طاولة العزل لاستخدامها في التسجيلات الكهروفسيولوجية.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة الاقتران من بضع ساعات إلى يوم واحد. ممارسة مريحة هي إقران البويضات في وقت متأخر من بعد الظهر والتسجيل منها في اليوم التالي.

4. إعداد نظام الاستحواذ

  1. قم بتكوين اثنين من مضخمات مشبك البويضات OC-725C (جدول المواد) إلى وضع قياس التيار الجانبي العالي عن طريق ضبط مفتاح تراجع داخلي (الشكل 1B).
  2. قم بتأريض مكبرات الصوت عن طريق ربط مقابس الدائرة الأرضية أولا على الألواح الخلفية ثم الاتصال بقفص فاراداي وضوء الألياف المستخدم في إضاءة غرفة التسجيل.
  3. قم بتوصيل مكبرات الصوت بمحول إشارة تناظري إلى رقمي (جدول المواد)، وقم بتكوينها في وحدة Clampex الخاصة ببرنامج pClamp (جدول المواد) باتباع إرشادات من الشركة المصنعة للمضخم.
  4. اختبر نظام الاقتناء باستخدام خلية النموذج المزودة بمكبر الصوت.
    1. قم بتوصيل مسبار V DIFF والكابلات الحالية (I) بخلية النموذج ، وقم بتوصيل المقابس الحمراء والسوداء في مسبار V DIFF بمفتاح العبور المضمن ، وقم بتوصيل أي من ساقي الوصلة بأي من الدبوس في خلية النموذج ، وقم بتوصيل السلك الأرضي في خلية النموذج بالكابل من مقبس GROUNDS CIRCUIT الخاص بمكبر الصوت (الشكل 1E).
    2. قم بتصفية قطب الجهد الكهربائي (Vm) وقطب الحمام (Im) متر من مكبر الصوت عن طريق تدوير مقابض Vm OFFSET و Ve OFFSET ، على التوالي ، وقم بتبديل المشبك من OFF إلى سريع أو بطيء وقم بتحويل قرص GAIN في اتجاه عقارب الساعة إلى مستوى يسمح بمشبك الجهد المناسب (الشكل 1A). قد يكون مفتاح D.C. GAIN إما في وضع OUT أو IN.
    3. قم بتشغيل بروتوكول اكتساب بسيط يحتوي على بضع خطوات الجهد للتأكد من أن الجهد المعروض في عداد Vm يتغير وفقا لبروتوكول الاستحواذ وأن آثار الجهد والتيار يتم عرضها بشكل صحيح في Clampex.
      ملاحظة: يمكن اختبار مضخم صوت واحد فقط في كل مرة باستخدام هذا النهج.

5. تسجيل Ij بين البويضات المقترنة

  1. إنشاء بروتوكولات اكتساب لتسجيل Ij في برنامج pClamp .
    ملاحظة: إنشاء بروتوكولي اقتناء. في أحدها ، يتم استخدام مكبر الصوت # 1 لإنتاج سلسلة من خطوات جهد الغشاء (V m) (على سبيل المثال ، -150 إلى +90 mV على فترات 10-mV) ، في حين يتم استخدام مكبر الصوت # 2 للحفاظ على ثابت V m (على سبيل المثال ، -30 mV). في البروتوكول الآخر ، يتم استخدام مكبر الصوت # 2 لإنتاج خطوات V m ، في حين يتم استخدام مكبر الصوت # 1 للحفاظ على Vm الثابت. يجب تطبيق خطوات Vm الإيجابية والسلبية بدلا من ذلك (على سبيل المثال ، -150 ، +90 ، -140 ، +80 ......) ، والتي يمكن برمجتها في Clampex باستخدام ميزة قائمة المستخدمين في بروتوكول الاستحواذ.
  2. إعداد مرحلة التسجيل
    1. أسقط طبق بتري واحد يحتوي على بويضات مقترنة في وعاء طبق بتري في منصة التسجيل (الشكل 2A)
    2. اختر زوجا من البويضات وقم بتدوير طبق بتري إذا لزم الأمر بحيث تكون البويضتان في الاتجاه الأيسر والأيمن ، وقفل المرحلة في موضعها بواسطة قاعدتها المغناطيسية.
    3. قم بإصلاح الحوامل المغناطيسية التي تحمل مجسات التيار والجهد في المواقع المناسبة على طاولة العزل.
      ملاحظة: تأكد من أن مجسات التيار والجهد من أحد مكبرات الصوت موجودة على الجانب الأيسر، في حين أن تلك الموجودة من مضخم الصوت الآخر موجودة على الجانب الأيمن، وأن مسبار الجهد يقع أمام مسبار التيار على كل جانب (الشكل 2B، C).
  3. إعداد القطب المرجعي
    1. ضع قطبا كهربائيا مرجعيا (جدول المواد) بالقرب من حافة طبق بتري باتجاه جانب المستخدم (الشكل 2 ب، ج).
    2. قم بتوصيل القطب المرجعي بالمقبس الأسود (Circuit Ground) في واحد فقط من مسبارين VDIFF .
  4. إعداد أقطاب VDIFF الكهربائية
    1. اسحب زوجا من الماصات الزجاجية الدقيقة ، واقطع قليلا من الطرف باستخدام ناسخ الماس (جدول المواد) ، وقم بتنعيم حافة الطرف عن طريق تلميع النار.
      ملاحظة: يجب أن تكون مقاومة الطرف أقل من 150 كيلو أوم (تقاس باستخدام ND96 في الماصة). عادة ما يتم استخدام الماصات الدقيقة ذات مقاومة الطرف من 20-150 kΩ.
    2. امسك الماصة الدقيقة فوق لهب موقد الكحول لثنيها إلى زاوية ناعمة (~ 130 درجة) في موضع على بعد 1 سم تقريبا من الطرف.
      ملاحظة: الماصات الدقيقة المصنعة قابلة لإعادة الاستخدام. شطفها بالماء بعد كل استخدام.
    3. ردم الماصة الزجاجية بالكامل بمحلول ND96 ، وأدخلها في حامل قطب كهربائي دقيق معبأ مسبقا (مع ND96) (جدول المواد ، الشكل 2D) ، وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء في النظام.
    4. أدخل الدبوس مقاس 2 مم لحامل القطب الكهربائي الدقيق في المقبس مقاس 2 مم لسلك توصيل قطب VDIFF (الشكل 2D).
    5. قم بتثبيت المقبس مقاس 2 مم على مشبك مغناطيسي (الشكل 2D) ، ووجه طرف قطب VDIFF نحو إحدى البويضتين (الشكل 2E).
      ملاحظة: اضبط موضع وزاوية المشبك بحيث يكون طرف القطب الكهربائي قريبا جدا من البويضة
    6. أدخل الدبوس مقاس 1 مم لسلك توصيل القطب الكهربائي V DIFF في المقبس الأحمر (V DIFF Input) في مسبار V DIFF على نفس الجانب.
    7. قم بإعداد وتوصيل قطب VDIFF للبويضة الأخرى ومكبر الصوت باتباع إجراءات مماثلة.
      ملاحظة: يظهر في الشكل 2E منظر عن قرب لزوج من البويضات وجميع الأقطاب الكهربائية.
  5. إعداد أقطاب التيار والجهد الكهربائي
    1. قم بإعداد أقطاب الجهد والتيار من الشعيرات الدموية الزجاجية ، وردمها (حوالي منتصف الطريق) بمحلول KCl (KCl 3.0 M ، EGTA 10 mM ، HEPES 10 mM ، pH 7.4 مع KOH) ، وأدخلها في حاملات الأقطاب الكهربائية المتوفرة مع مكبرات الصوت.
      ملاحظة: يجب أن يكون للأقطاب الكهربائية مقاومة ~ 1 MΩ. يمكن الحصول على أقطاب كهربائية مناسبة من نوع من الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار (جدول المواد) باستخدام مجموعة محددة من معلمات السحب (الجدول 1). يمكن لهذه النصائح اختراق غشاء خلية البويضة بسهولة دون الحاجة إلى الضغط على Vm أو زر Ve BUZZ على مكبر الصوت.
    2. قم بخفض الأقطاب الكهربائية في محلول الحمام ، وقم بتصفية عدادات Vm و Im عن طريق تحويل أقراص Vm OFFSET و Ve OFFSET وتحقق من مقاومة القطب الكهربائي عن طريق الضغط على Vm Electrode Test و Ve Electrode Test.
    3. أدخل أقطاب التيار والجهد في البويضات ، ولاحظ إمكانات الغشاء السالبة (عادة -20 إلى -50 mV).
      ملاحظة: يجب أن يعرض عدادات Vm و Im لنفس مكبر الصوت قيمتين متطابقتين أو متشابهتين جدا.
  6. الحصول على البيانات
    1. في قسم المشبك من مكبر الصوت ، تأكد من أن D.C. GAIN في وضع IN ، وأدر مقبض GAIN في اتجاه عقارب الساعة إلى مستوى يسمح بمشبك الجهد المناسب (عادة ثلث إلى نصف النطاق الكامل) ، وقم بتشغيل مفتاح المشبك من OFF إلى FAST.
      ملاحظة: عند تشغيل المشبك ، سيعرض عدادات Vm و Im الجهد القابض وتيار الإمساك ، على التوالي. على الرغم من أن تيار الإمساك قد يختلف إلى حد ما اعتمادا على ظروف البويضات ، إلا أنه يكون صغيرا ومستقرا بشكل عام عند عقد Vm (على سبيل المثال ، -30 mV).
    2. تشغيل بروتوكول استحواذ.
      ملاحظة: سيتم عرض أربعة آثار على الشاشة. تشير آثار الجهد والتيار من أحد مكبرات الصوت إلى خطوات Vm المطبقة على البويضة #1 والتيار اللازم لإنتاج خطوات Vm ، في حين تشير تلك الموجودة في مكبر الصوت الآخر إلى ثابت Vm (-30 mV) للبويضة # 2 ، والتيار الذي تم حقنه للحفاظ على هذا Vm الثابت. يمثل التيار الذي يتم حقنه في البويضة رقم 2 Ij.

6. تحليل البيانات

  1. التحليل باستخدام Clampfit.
    1. افتح ملف abf مسجل في وحدة Clampfit النمطية ل pClamp.
    2. استخدم المؤشرين 1 و2 لإرفاق جزء من خط الأساس قبل آثار I j.
    3. انقر على أيقونة ضبط خط الأساس لإخراج نافذة خط الأساس. حدد طرح متوسط المؤشرات 1..2 للطريقة، وتأكد من تحديد كافة الإشارات المرئية وجميع الآثار المرئية لتحديد التتبع.
    4. عند النقر فوق موافق ، يتم إغلاق نافذة خط الأساس ، وتتقارب خطوط الأساس لجميع آثار التيار والجهد عند مستوى الصفر. لاحظ أن خطوات الجهد تتغير إلى مستويات جديدة تساوي الجهد الأصلي مطروحا منه الجهد القابض (على سبيل المثال، -30 mV).
    5. لرسم العلاقة I j و V j باستخدام الحالة الثابتة I j ، قم بإرفاق جزء مرغوب فيه من آثار I j التي تمثل الحالة الثابتة I j مع المؤشرين 1 و 2 ، ضع المؤشر 3 في أي مكان داخل النافذة الزمنية لخطوات الجهد.
    6. انتقل إلى تحليل / رسم بياني سريع / I-V لفتح نافذة I-V .
    7. ضمن X-Axis (الجهد)، حدد المؤشر 3 من الإشارة، وحدد إشارة خطوة الجهد (على سبيل المثال، الجهد 1) في القائمة المنسدلة، وحدد المربع عكس.
      ملاحظة: يتم تحديد المربع المقلوب لتحويل V m إلى قيم مكافئة ل V j ، والتي يتم تعريفها على أنها V m من البويضة # 2-V m من البويضة #1.
    8. ضمن المحور Y (الحالي)، حدد مصدر إشارة Ij (على سبيل المثال، الحالي 0) من القائمة المنسدلة بجوار الإشارة، وحدد المنطقة كمؤشرات 1..2 من القائمة المنسدلة، وحدد المتوسط.
      ملاحظة: لرسم علاقات الذروة I j وV j، يجب أن يرفق المؤشران 1 و2 مقطع آثار I j الذي يحتوي على الذروة I j في الخطوة 6.1.5 وحدد الذروة (بدلا من المتوسط) في الخطوة 6.1.8.
    9. ضمن خيار الوجهة ، حدد إما استبدال أو إلحاق.
    10. عند النقر فوق موافق في نافذة I-V ، يتم عرض علاقة I j - V j على الشاشة ، ويمكن العثور على قيم I j و V j المقابلة بالنقر فوق نافذة / نتيجة.
  2. رسم وملاءمة علاقة G j-Vj في OriginPro (جدول المواد)
    1. انسخ العمودين اللذين يحتويان على قيم Vj وIj من نافذة النتائج في Clampfit (الخطوة 6.1.10) إلى مصنف جديد في الأصل. تأكد من أن قيمتي V j وIj ضمن العمودين X وY، على التوالي.
    2. أضف أربعة أعمدة جديدة في المصنف بالنقر فوق عمود/إضافة أعمدة جديدة.
    3. قم بتسمية العمود الجديد الأول باسم G j، وقم بتعبئته عن طريق إدخال المعادلة "العمود I j/العمود V j * 1000" في نافذة تعيين قيم العمود، وقم بإنشاء مخطط مبعثر لعلاقة G j-V j.
      ملاحظة: الضرب في 1000 (اختياري) هو لتجنب إزعاج التعامل مع أعداد صغيرة جدا في الخطوات اللاحقة.
    4. قم بملاءمة نقاط بيانات G j فوق نطاقات Vj السالبة والموجبة بشكل مستقل مع دالة Boltzmann. احسب G j عند V j = 0 mV عن طريق إدخال قيم G jmax و G jmin و A و V0 من التركيب في معادلة بولتزمان ، والتي يمكن القيام بها في جدول بيانات. سيتم استخدام G j الذي تم الحصول عليه على هذا النحو ك Gjmax في الخطوة التالية.
      ملاحظة: المعادلة التي تناسب دالة بولتزمان هي: G j = (G jmax-G jmin)/{1 + exp[A(V j-V 0)]} + G jmin، حيث V 0 هو V j الذي يكون فيه التوصيل نصف الحد الأقصى، G jmax هو التوصيل الأقصى، G jmin هو V j-insensitive التوصيل المتبقي23. لإجراء التركيب ، أضف أولا معادلة Boltzmann كدالة تركيب جديدة في OriginPro ، ثم حدد هذه الوظيفة للتركيب. أدخل قيم البذور التقريبية ل Gjmax وGjmin وV0 وA قبل تنفيذ وظيفة التركيب. تأكد من عدم تثبيت المعلمة Gjmax لهذا التركيب.
    5. قم بتسمية العمودين الجديدين الثاني والثالث باسم nGj-L و nGj-R ("n" ل "عادي") ، وقم بتعبئتهما عن طريق قسمة عمود G j على قيم G jmax المشتقة من منحنيات G j - V j اليسرى واليمنى ، على التوالي (الخطوة 6.2.4).
    6. قم بتسمية العمود الرابع الجديد باسم nGj-LR ، وقم بتعبئته عن طريق نسخ القيم من نطاقات Vj السالبة والموجبة لعمودي nGj-L و nGj-R ، على التوالي.
    7. قم بإنشاء مخطط مبعثر ل nGj-LR على V j ، وقم بملاءمة نقاط البيانات فوق نطاقات V j السلبية والموجبة مع دالة Boltzmann بشكل مستقل. تأكد من تثبيت معلمة Gjmax عند 1.0 للتركيب.
    8. احتفظ بسجلات لنتائج التركيب (على سبيل المثال، الرسم البياني المركب وقيم Gjmin وV0 وA ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UNC-7 و UNC-9 هما innexins من C. elegans. في حين أن UNC-9 يحتوي على شكل متساوي واحد فقط ، فإن UNC-7 لديه أشكال متساوية متعددة تختلف بشكل رئيسي في الطول وتسلسل الأحماض الأمينية للمحطات الأمينية 7,8. قد تشكل هذه الإنكسين GJs متجانسة وكذلك غير متجانسة (من UNC-7 و UNC-9) عند التعبير عنها في بويضات Xenopus 7,8. ويبين الشكل 3 آثار الممثل الأولJ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدو أن تحسين النظام ضروري لتجارب مشبك الجهد المزدوج للبويضة. بدونها ، يمكن أن تكون التسجيلات غير مستقرة للغاية ، وقد تضطر مكبرات الصوت إلى حقن كمية زائدة من التيار للوصول إلى Vm المستهدف ، مما يؤدي إلى تلف البويضات وفشل التسجيل. هناك عدة عوامل حاسمة للحصول على تسجيلات مستقرة للبويضة المزدوجة باستخدام طريقة قياس التيار الجانبي العالي. أولا ، يجب أن يكون للأقطاب الكهربائية الحالية والجهد مقاومة مناسبة (~ 1 MΩ) ، ويجب أن يكون حاملوها نظيفين. ثانيا ، يجب أن يكون للأقطاب الكهربائية VDIFF مقاومة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر هاينغ زان ، وتشيان جي على مشاركتهم في المرحلة الأولية من التطوير التقني ، وكيرانماي فيدانتهام للمساعدة في الأرقام ، والدكتور كاميلو بيراكيا على المشورة بشأن غرفة إقران البويضات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حامل مغناطيسي جسر أجار ALAللأدوات العلميةMPSALT-Hأكثر استقرارا من مشبك أنبوب Narishige نظرا لقاعدته المغناطيسية الأكبر ولكنه يتطلب تعديلا لتجميع مقبس أنثى 2 مم.
حاقن نانو لتر أوتوماتيكيشركة دروموند العلمية ، برومول ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةحاقن نانو لتر آلي Nanoject II
كولاجيناز ، النوع الثانيGibco-USA ، لانجلي ، حسنا ، الولايات المتحدة الأمريكية17101-015
Diamond Scriber، هاتفيلد ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية62108-ST
مسبار الجهد التفاضليWarner Instruments ، Hamden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية7255DI
الجزيئية لمحول الإشارات التناظرية إلى الرقمية، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةDigidata 1440A
Dumont # 5 TweezersWorld Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية500341
الشعيرات الدموية الزجاجيةDrummond Scientific Company ، Broomall ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية3-000-203-G / X
الأسلاك الساخنةAmazon.comProxxon 37080البديل هو هرقل 8500 DHWT ، الذي يحتوي على دواسة تحكم في القدم.
Hyaluronidase ، النوع I-SMilliporeSigma ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةH3506
قاعدة حامل مغناطيسيKanetec USA Corp. ، Bensenville ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةMB-L-45
Microelectrode BevelerSutter Instrument ، Novاتو ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةBV-10
حامل القطب الكهربائيالدقيق العالمي للأدوات الدقيقة ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةMEH1S15
مجتذب ماصات دقيقةأداة سوتر ، نوفاتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةP-97
mMESSAGE mMACHINETM T3Invitrogen-FisherScientificAM1348
Nunc MicroWell MiniTrayNalge Nunc International ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية438733شركة توريد مكونات شبكة النايلون Microwell
Minitray ، سبارتا ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةU-CMN-1000
مضخم البويضات المشبكوارنر الأدوات ، ، Hamden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكيةOriginPro
OriginLab Corporation ، نورثهامبتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية2020b
pClampMolecular Devices ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 10
من الأدوات الدقيقة العالمية للقطب المرجعي، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةDRIREF-2SHالمواصفات: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (مثبط الريبونوكلياز)Invitrogen-FisherScientific10777-019
خياطة الحرير 5-0Covidien ، نورث هافن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكيةVS890
مقياس الطيف الضوئي NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
رقيق الجدار الزجاجي Capallariesأدوات الدقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةTW150F-4
أنبوب المشبكNarishige International USA ، Amityville ، NY ، USACAT-1جاهز للاستخدام ولكن موضعه عرضة للتحول بسبب القاعدة المغناطيسية الصغيرة.
Xenopus laevis< / em>Xenopus Express ، بروكسفيل ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةIMP-XL-FM
علوم المجهر الإلكتروني الأجهزة قاطع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331(2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16(2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة