Method Article

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات من αβ-tubulin heterodimers التي تنظم في هياكل متميزة في الخلايا. غالبا ما تحتوي المعماريات والشبكات القائمة على الأنابيب الدقيقة على مجموعات فرعية من صفائف الأنابيب الدقيقة التي تختلف في خصائصها الديناميكية. على سبيل المثال ، في تقسيم الخلايا ، تتعايش حزم مستقرة من الأنابيب الدقيقة المتقاطعة على مقربة من الأنابيب الدقيقة الديناميكية غير المترابطة. تمكن دراسات إعادة التشكيل في المختبر القائمة على TIRF المجهري من التصور المتزامن لديناميكيات هذه المصفوفات المختلفة من الأنابيب الدقيقة. في هذا الفحص ، يتم تجميع غرفة التصوير باستخدام الأنابيب الدقيقة المجمدة على السطح ، والتي إما موجودة كخيوط مفردة أو منظمة في حزم متقاطعة. يسمح إدخال التوبولين والنيوكليوتيدات ومنظمات البروتين بالتصور المباشر للبروتينات المرتبطة والخصائص الديناميكية للأنابيب الدقيقة المفردة والمتشابكة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة التغييرات التي تحدث عندما يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة المفردة الديناميكية في حزم في الوقت الفعلي. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تقييم منهجي لنشاط البروتينات الفردية وتوطينها ، بالإضافة إلى التأثيرات التآزرية لمنظمات البروتين على مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات حيوية تشكل سقالات هيكلية ضرورية لعمليات خلوية متعددة ، تتراوح من النقل داخل الخلايا وتحديد مواقع العضيات إلى انقسام الخلايا واستطالتها. لتنفيذ هذه الوظائف المتنوعة ، يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة الفردية في صفائف بحجم ميكرون ، مثل المغزل الانقسامي ، والمحاور الهدبية ، والحزم العصبية ، والمصفوفات بين الأطوار ، والمصفوفات القشرية النباتية. ومن الزخارف المعمارية المنتشرة في كل مكان الموجودة في هذه الهياكل مجموعة من الأنابيب الدقيقة المتشابكة على طول أطوالها1. ومن السمات المثيرة للاهتمام للعديد من الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة التعايش بين الأنابيب الدقيقة المجمعة والأنابيب الدقيقة المفردة غير المتقاطعة في مكان قريب.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف على النحو المبين في الجدول 1 والجدول 2. أثناء التجربة ، احتفظ بجميع الحلول على الجليد ، ما لم يذكر خلاف ذلك.
حلمكوناتمدة التخزين الموصى بهاتلاحظ
5X BRB80400 مللي متر K-الأنابيب، 5 ملليمتر MgCl2، 5 ملليمتر EGTA، الرقم الهيدروجيني 6.8 مع KOH، تصفية التعقيم
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء التجربة الموصوفة أعلاه باستخدام أنابيب دقيقة بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 647 نانومتر ، وأنابيب دقيقة غير بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر ، ومزيج توبولين قابل للذوبان يحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر. تم ربط الأنابيب الدقيقة بواسطة بروتين الربط المتقاطع PRC1 (المسمى GFP). بعد إنشاء حزم مثبتة على السطح وأنابيب دقيقة واحدة (الخطوة 5.11) ، تم تركيب غرفة التصوير على هدف زيت TIRF 100X 1.49 NA وعرضها في قنوات التألق 560 نانومتر و 647 نانومتر. تم تحديد الأنابيب الدقيقة المفردة من خلال إشارة التألق الخاصة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسع التجربة الموصوفة هنا بشكل كبير نطاق وتعقيد اختبارات إعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة التقليدية ، والتي يتم إجراؤها تقليديا على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيف. يوفر الفحص الحالي طريقة لتحديد ومقارنة نشاط MAP التنظيمي في وقت واحد على مجموعتين سكانيتين ، وهما الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم المتشابكة. علاوة على ذلك ، يسمح هذا الفحص بفحص نوعين من الحزم: تلك التي يتم تشكيلها مسبقا من البذور المستقرة قبل بدء الديناميكيات ، وتلك التي يتم تشكيلها حديثا عندما يلتقي طرفان متناميان ببعضهما البعض ويتشابكان (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم 1DP2GM126894-01) ، وبأموال من صناديق بيو الخيرية ومؤسسة عائلة سميث إلى R.S. يشكر المؤلفون الدكتور شو جيانغ على مساهمته في تطوير وتحسين البروتوكولات.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-هيدروكسي-2،5،7،8-حمض رباعي ميثيل كرومان-2-كربوكسيل (ترولوكس)سيجما ألدريتش238813
1،4-بيبرازينيدايتثانيسولفونيك حمض (الأنابيب)سيجما ألدريتشP6757
18x18 مم # 1.5 غطاء علوم المجهر الإلكتروني63787
2-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm # 1.5 coverslipsعلوم المجهر الإلكتروني63793
405/488/560/647 نانومتر ليزر رباعي النطاق ChromaTRF89901-NK
AcetoneSigma Aldrich320110
Adenosine 5'-triphosphate ثنائي الفوسفات هيدرات ملح الصوديوم (ATP)سيجما ألدريتشA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® بروتين ملزم للبيوتين (المجسات الجزيئية ®)Thermo Fischer ScientificA2666
سونيكاتور الحمام: برانسون 2800 منظفبرانسونCPX2800H
بيكمان كولتر أنابيب بولي كربونات سميكوول ، 11 × 34 ممبيكمان كولتر   ؛343778
بيكمان كولتر أنابيب بولي كربونات سميكوول ، 8 × 34 ممبيكمان كولتر   ؛343776
البيوتين-PEG-SVA، MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتش2905
كاتالازسيجما ألدريتشC40
كورنينج LSE ميني جهاز طرد مركزي دقيق ، AC100-240VCorning6670
مناديل مبللة للمهام الحساسةKimtech34120
Dithiothreitol (DTT)GoldBioDTT10
مرشح الانبعاثChromaET610 / 75m
الإيثانول (200-برهان)Decon Labs2705
حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA)Sigma Aldrich3777
Glucose OxidaseSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanosine 5'-ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدرات (GTP)منظفSigma AldrichG8877
Hellmanex III  زيت الغمر Z805939
ألدريتش ، النوع Aفيشر سينتيفيك77010
كابا كازينسيجما ألدريتشC0406
لانولينفيشر ScientificS25376
تنظيف الأنسجةThorLabsMC-5
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)سيجما ألدريتشM9272
ميثيل السليلوزسيجما ألدريتشM0512
ميكروفوج 16 جهاز طرد مركزي منضدةبيكمان كولتر   ؛شرائح مجهر A46474
، زجاج أبيض ماسي ، 25 × 75 مم ، 90 درجة ؛ حواف أرضية, أبيض بلوريبلوري علمي1380-50 واط
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ ماكس-إكس بي منضدية الطرد المركزي الفائقBeckman-Coulter 393315
بارافينفيشر ScientificP31-500
PELCO Reverse (الإغلاق الذاتي) ، ملاقط دقيقةتيد بيلا5377-NM
Petrolatum ،Fisher Scientific18-605-050
، 115VHarrick PlasmaPDC-001
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)Sigma Aldrich221473
بيكربونات الصوديومSigma AldrichS6014
السكروزSigma AldrichS7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat BathUSA Scientific2510-1101
Thermal-Lok Block ل 1.5 و 2.0 مل أنابيبالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2520-0000
الحرارية العلمية والتجارة ؛ بيرس & تجارة; كسر السندات & التجارة ؛ حل TCEP ، درجة حموضة محايدة ؛ 500 ملي مترثيرمو فيشر العلميPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 هدف الزيتنيكونCFI Apochromat TIRF 100XC زيت
TIRF مجهرنيكونكسوف Ti
TLA 120.1 الدواربيكمان كولتر  362224
TLA 120.2 الدوارBeckman-Coulter بروتين توبولين 357656
(نقي >99٪):الهيكل الخلويT240
بروتين توبولين (البيوتين):الهيكل الخلويT333P
بروتين توبولين (الفلورسنت HiLyte 647):الهيكل الخلويTL670M
بروتين التوبولين (X-rhodamine): الهيكل الخلوي لدماغ البقرTL620M
VECTABOND® كاشف ، قسم النسيج التصاقناقلات BiolabsSP-1800-7
VWR & reg ؛ حاضنة بالحجم الشخصي ، 120 فولت ، 50/60 هرتز ، 0.6 أمبيرVWR97025-630
سيجما منظف البلازما White لدماغ الخنزير لدماغ الخنازير لدماغ الخنزير

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

Related Articles