مقالة منهجية

تحديد كمية نقل الحديد عبر مشيمة الفأر في الجسم الحي باستخدام نظائر الحديد غير المشعة

DOI:

10.3791/63378

⸱

مايو 10, 2022

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة كيفية تحضير وإدارة الحديد النظيري غير المشع المرتبط بالترانسفيرين لدراسات نقل الحديد في حمل الفئران. كما تم وصف نهج قياس الحديد النظيري في مقصورات الجنين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحديد ضروري لصحة الأم والجنين أثناء الحمل ، مع ما يقرب من 1 غرام من الحديد اللازم في البشر للحفاظ على حمل صحي. يعتمد وقف الحديد الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة ، ويمكن أن تؤدي اضطرابات هذا النقل إلى نتائج سلبية للحمل. في الفئران ، اعتمد قياس تدفقات الحديد عبر المشيمة تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق. توفر نظائر الحديد المستقرة (57Fe و 58Fe) بديلا غير مشع للاستخدام في دراسات الحمل البشري.

في ظل الظروف الفسيولوجية، يكون الحديد المرتبط بالترانسفيرين هو الشكل السائد من الحديد الذي تمتصه المشيمة. وهكذا ، تم تحضير 58Fe-transferrin وحقنه عن طريق الوريد في السدود الحوامل لتقييم نقل الحديد المشيمي مباشرة وتجاوز امتصاص الحديد المعوي للأم كمتغير مربك. تم قياس كمية الحديد النظيري في الأنسجة الجنينية للمشيمة والفأر بواسطة قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS). يمكن أيضا استخدام هذه الطرق في أنظمة النماذج الحيوانية الأخرى لعلم وظائف الأعضاء أو المرض لتحديد ديناميكيات الحديد في الجسم الحي .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحديد أمر بالغ الأهمية لعمليات التمثيل الغذائي المختلفة ، بما في ذلك النمو والتنمية ، وإنتاج الطاقة ، ونقل الأكسجين1. الحفاظ على توازن الحديد هو عملية ديناميكية ومنسقة. يتم امتصاص الحديد من الطعام في الاثني عشر ونقله في جميع أنحاء الجسم في الدورة الدموية المرتبطة ببروتين نقل الحديد ترانسفيرين (Tf). يتم استخدامه من قبل كل خلية للعمليات الأنزيمية ، ودمجها في الهيموغلوبين في كريات الدم الحمراء الوليدة ، وإعادة تدويرها من كريات الدم الحمراء القديمة بواسطة البلاعم. يتم تخزين الحديد في الكبد عندما يكون زائدا ويفقد من الجسم من خلال النزيف أو تقشير الخلايا. كمية الحديد المتداولة هي نتيجة التوازن بين استهلاك وتوريد الحديد ، ويتم تنظيم هذا الأخير بإحكام بواسطة هرمون الكبد hepcidin (HAMP) ، المنظم المركزي لتوازن الحديد1. يعمل الهيبسيدين على الحد من التوافر البيولوجي للحديد في الدم عن طريق سد أو إحداث الوجود في كل مكان وتدهور فيروبورتين المصدر للحديد (FPN)2. يؤدي انخفاض FPN الوظيفي إلى انخفاض امتصاص الحديد الغذائي ، وعزل الحديد في الكبد ، وانخفاض إعادة تدوير الحديد من الضامة1.

يتم تنظيم Hepcidin من خلال حالة الحديد ، والالتهاب ، ومحرك الكريات الحمر ، والحمل (تمت مراجعته في 3). بالنظر إلى أن توازن الحديد ديناميكي للغاية ، فمن المهم فهم وقياس إجمالي تجمع الحديد وتوزيع الحديد ودورانه. اعتمدت الدراسات على الحيوانات تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق لقياس ديناميكيات الحديد. ومع ذلك ، في الدراسات الحديثة ، بما في ذلك الدراسة المقدمة هنا4 ، يتم استخدام نظائر الحديد غير المشعة والمستقرة (58Fe) لقياس نقل الحديد أثناء الحمل5،6،7،8،9. النظائر المستقرة هي أدوات قيمة لدراسة استقلاب المغذيات (تمت مراجعتها في 10). أظهر استخدام نظائر الحديد المستقرة في الدراسات البشرية أن أ) زيادة امتصاص الحديد في نهاية الحمل5،6 ، ب) نقل الحديد الغذائي إلى الجنين يعتمد على حالة الحديد الأم7 ، ج) يتم دمج حديد الهيم المبتلع من قبل الأم بسهولة أكبر من قبل الجنين من الحديد غير الهيم 8 ، و د) يرتبط نقل الحديد إلى الجنين سلبا بمستويات هيبسيدين الأم8 ، 9. قامت هذه التجارب بقياس نظائر الحديد في الأمصال أو دمجها في كرات الدم الحمراء. ومع ذلك ، فإن قياس الحديد المدمج في كرات الدم الحمراء وحده قد يقلل من امتصاص الحديد الحقيقي9. في الدراسة الحالية ، يتم قياس كل من حديد الهيم وغير الهيم في الأنسجة.

أثناء الحمل ، الحديد مطلوب لدعم توسيع حجم خلايا الدم الحمراء للأم ونقلها عبر المشيمة لدعم نمو الجنينوتطوره 11. يعتمد الوقف الحديدي الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة. خلال الحمل البشري12 والقورضا 4,13 ، تنخفض مستويات الهيبسيدين بشكل كبير ، مما يزيد من توافر الحديد في البلازما لنقله إلى الجنين.

تم وصف أساسيات نقل الحديد المشيمي في البداية في 1950s-70s باستخدام المتتبعات المشعة (59Fe و 55Fe). حددت هذه الدراسات أن نقل الحديد عبر المشيمة أحادي الاتجاه 14,15 وأن الترانسفيرين ثنائي الهديريك هو مصدر رئيسي للحديد للمشيمة والجنين 16,17. الفهم الحالي لنقل الحديد المشيمي أكثر اكتمالا ، على الرغم من أن بعض ناقلات الحديد الرئيسية والآليات التنظيمية لا تزال غير معروفة. كانت نماذج الماوس ضرورية لفهم تنظيم الحديد ونقله18 لأن الناقلات والآليات الرئيسية متشابهة بشكل ملحوظ. كل من المشيمة البشرية والفأر هي hemochorial ، أي أن دم الأم على اتصال مباشر مع مشيمية الجنين19. ومع ذلك ، هناك بعض الاختلافات الهيكلية الملحوظة.

الأرومة الغاذية المخلوية هي طبقة الخلايا المشيمة التي تفصل بين الدورة الدموية للأم والجنين وتنقل بنشاط الحديد والمواد المغذية الأخرى20. في البشر ، الأرومة المخلوية هي طبقة واحدة من الخلايا المنصهرة. في المقابل ، تتكون مشيمة الفأر من طبقتين من الأرومة الغاذية المخلوية21 ، Syn-I و Syn-II. ومع ذلك ، تسمح تقاطعات الفجوة في واجهة Syn-I و Syn-II بنشر العناصر الغذائية بين الطبقات22,23. وبالتالي ، تعمل هذه الطبقات كطبقة مخلوية واحدة مماثلة للأبلاست المخلوي الخلوي. تمت مراجعة أوجه التشابه والاختلاف الإضافية بين المشيمة البشرية والفأرية بواسطة Rossant و Cross21. يتم تشغيل نقل الحديد المشيمي عن طريق ربط الحديد-Tf من دم الأم إلى مستقبل الترانسفيرين (TfR1) الموضعي على الجانب القمي من الأرومة الغاذية المخلوية24. يؤدي هذا التفاعل إلى استيعاب الحديد-Tf / TfR1 عبر الالتداخل الخلوي بوساطة الكلثرين25. ثم يتم إطلاق الحديد من Tf في الإندوسومالحمضي 26 ، ويتم اختزاله إلى حديد حديدي بواسطة فيريراختزال غير محدد ، ويتم تصديره من الإندوسوم إلى السيتوبلازم بواسطة ناقل لم يتم تحديده بعد. كيف يتم مرافقة الحديد داخل الأرومة الغاذية المخلوية لا يزال يتعين وصفها. يتم نقل الحديد في نهاية المطاف إلى جانب الجنين بواسطة مصدر الحديد ، FPN ، الموضعي على السطح القاعدي أو المواجه للجنين من الأرومة المخلوية (تمت مراجعته في27).

لفهم كيفية تأثير التنظيم الفسيولوجي والمرضي ل TfR1 و FPN والهيبسيدين على نقل الحديد المشيمي ، تم استخدام نظائر الحديد المستقرة لتحديد كمية نقل الحديد من الدورة الدموية للأم إلى المشيمة والجنين في الجسم الحي4. تقدم هذه الورقة طرق تحضير وإعطاء ترانسفيرين الحديد النظيري للفئران الحوامل، ومعالجة الأنسجة من أجل ICP-MS، وحساب تركيزات الحديد في الأنسجة. يمكن تكييف استخدام نظائر الحديد المستقرة في الجسم الحي للتحقيق في تنظيم الحديد وتوزيعه في نماذج حيوانية مختلفة للتحقيق في تنظيم الحديد الفسيولوجي والمرضي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية والإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس.

1. إعداد 58Fe-TF

ملاحظة: يستخدم البروتوكول 58Fe; ومع ذلك ، يمكن استخدام بروتوكول مماثل ل 57Fe. يمكن استخدام أي من النظيرين والتخلص منهما كمادة كيميائية قياسية للحديد دون احتياطات إضافية.

  1. قم بإذابة 58 Fe في 12 N HCl عند 50 ميكرولتر من HCl / mg من 58Fe.
    1. أضف حمض الهيدروكلوريك إلى المعدن الموجود في القارورة الزجاجية التي يوفرها البائع ، واستبدل الغطاء بشكل غير محكم. لإذابة المكواة ، قم بتسخين محلول 58Fe / HCl إلى 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إذا لم يذوب بعد ، اترك المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان ليذوب.
      ملاحظة: محلول 58Fe / HCl المذاب لونه برتقالي مصفر.
      Fe3O4 (s) + 8HCl (aq) → Fe (II) Cl 2 (aq) + 2Fe (III) Cl 3 (aq) + 4H2 O
  2. أكسدة أي Fe(II)Cl2 متبق لتوليد محلول Fe(III)Cl3 .
    1. قم بتسخين محلول 58Fe / HCl إلى 60 درجة مئوية مع إزالة الغطاء لتسهيل الأكسدة.
    2. أضف 1 ميكرولتر من 35٪ H 2 O2لكل 50 ميكرولتر من محلول 58Fe / HCl لتسهيل الأكسدة بشكل أكبر.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. تحضير محلول كلوريد الحديديك (58Fe(III)Cl3).
    1. اترك محلول كلوريد الحديديك في الغطاء عند 60 درجة مئوية مع إزالة الغطاء لتبخير العينة.
      ملاحظة: قد يستغرق التبخر ما بين يوم وعدة أيام.
    2. أعد تكوين 58Fe(III)Cl 3 إلى 100 mM باستخدام H 2 O فائق النقاء، واحسب كمية H 2 O فائقة النقاء المطلوبة بناء على وزن المعدن الأولي المستخدم في الخطوة 1.1 (الوزن الجزيئي 58Fe(III)Cl3 هو 162.2).
  4. تحضير 58 Fe(III)-nitrilotriacetate (NTA) عن طريق احتضان 58Fe(III)Cl 3 مع NTA بنسبة مولار 1:5 في وجود 20 mM NaHCO3.
    1. تحضير 500 mM NTA في 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
    2. قم بإعداد 5x محلول تحميل ترانسفيرين (0.5 م HEPES ، درجة حموضة 7.5 ؛ 0.75 م كلوريد الصوديوم).
    3. تحضير 1 M NaHCO3 في H2O.
    4. إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، أضف 150 ميكرولتر من محلول 100 mM 58 Fe (III) Cl 3 (من الخطوة 1.3.2) ، و 150 ميكرولتر من 500 mM NTA المحضر في 1 N NaOH ، و 480 ميكرولتر من H2O عالي النقاء ، و 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الترانسفيرين 5x، و 20 ميكرولتر من محلول 1 M NaHCO3.
    5. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتحميل apo-Tf مع 58 Fe (III) -NTA لتشكيل 58Fe-Tf.
    ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من مكارثي وكوزمان28.
    1. قم بإذابة 500 مجم من apo-Tf في 4 مل من المخزن المؤقت لتحميل 1x Tf.
    2. إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل في الخطوة 1.4.4 الذي يحتوي على 1 مل من محلول 58Fe(III)-NTA، أضف 4 مل من محلول apo-Tf.
      ملاحظة: هذه نسبة مولار 3: 1 تبلغ 58Fe-NTA مع apo-Tf. كل Tf يحتوي على 2 مواقع ربط Fe ؛ تمت إضافة 58Fe-NTA الزائدة لضمان تحميل Tf بالكامل.
    3. للسماح بالتحميل الأقصى ل 58Fe-NTA على apo-Tf ، تحقق من أن المحلول عند الرقم الهيدروجيني 7.5 ، واضبط الرقم الهيدروجيني ، إذا لزم الأمر ، باستخدام NaHCO3 أو HCl.
    4. احتضان لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة 58Fe (III) -NTA الزائدة غير المنضمة و NTA التي تم إصدارها.
    1. انقل محلول 58Fe-Tf إلى عمود قطع الوزن الجزيئي (قطع 30 كيلو دالتون) وأجهزة الطرد المركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل العمود ب 10 مل من 1x مخزن مؤقت وجهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل والطرد المركزي ، وقم بإجراء غسل ملحي مع 10 مل من المحلول الملحي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. احسب تركيز 58Fe-Tf.
    ملاحظة: نظرا لإضافة 58Fe الزائدة في الخطوة 1.5.2 ، افترض أن كل الترانسفيرين ثنائي التوجيه. كما تم استخدام 500 ملغ من apo-Tf ، ~ 500 ملغ 58Fe-Tf تم إنتاجه في الخطوة 1.5.4.
    1. قم بقياس الحجم المستعاد من الطرد المركزي بعد غسل المحلول الملحي في الخطوة 1.6.2.
    2. قسم 500 مجم على الحجم المسترد لتحديد تركيز (ملغم / مل) من محلول 58Fe-Tf.
  8. تعقيم محلول 58Fe-Tf باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر ؛ يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    ملاحظة: تم استخدام محلول 58Fe-Tf بين 1 إلى 4 أسابيع بعد التحضير.

2. إعداد حمل الفأر الموقوت

  1. استخدم إناث الفئران التي يبلغ عمرها من 6 إلى 8 أسابيع. ضع الحيوانات على نظام غذائي منخفض الحديد (4 جزء في المليون من الحديد) أو تشاو القياسي (185 جزء في المليون من الحديد) لمدة 2 أسابيع قبل التزاوج والحفاظ على الحيوانات على الوجبات الغذائية المعنية طوال فترة الحمل.
  2. الخيار 01: تأكيد الحمل عن طريق زيادة الوزن في E7.5.
    1. إنشاء أقفاص تربية متعددة. لكل قفص ، والجمع بين 2 الإناث مع 1 الذكور بين عشية وضحاها. يعتبر اليوم التالي عندما يتم فصل الحيوانات اليوم الجنيني (E) 0.5. وزن الإناث في E7.5 لتحديد ما إذا كنت حاملا. تزاوج الذكور مرة أخرى مع الإناث التي لم تكتسب وزنا.
      ملاحظة: في WT C57BL / 6 ، تعد زيادة الوزن بمقدار 1 جم عند E7.5 مؤشرا جيدا على الحمل. تضمن هذه الطريقة حدوث الزرع في إطار زمني محدد مدته 16 ساعة ، مما يسمح بالعلاج المتزامن لجميع الحيوانات التي أصبحت حاملا خلال نفس فترة التزاوج.
  3. الخيار 02: تأكيد الحمل عن طريق فحص المكونات.
    1. الجمع بين 2 الإناث مع 1 ذكر وإجراء فحوصات المكونات اليومية لتحديد ما إذا كان الجماع قد حدث.
      ملاحظة: قد تؤدي هذه الطريقة إلى حالات حمل متداخلة ، ولا يضمن وجود سدادة الحمل.

3. إدارة 58Fe-Tf عن طريق الوريد إلى الفئران الحوامل E17.5

  1. تحضير 58Fe-Tf من الخطوة 1.8 للحقن.
    1. تحضير محلول 58Fe-Tf عند 35 ملغم / مل في محلول ملحي ؛ حقن 100 ميكرولتر لكل ماوس.
    2. املأ حقنة الأنسولين ب 100 ميكرولتر من محلول 58Fe-Tf.
      ملاحظة: كل جرعة تحتوي على 3.5 ملغ من الإنسان58 Fe-Tf (5 ميكروغرام من 58Fe).
  2. تخدير الفأر الحامل باستخدام إيزوفلوران.
    1. استخدم منظم إيزوفلوران مع غرفة.
    2. استخدم الإعدادات التالية: 5٪ إيزوفلوران ، 2 لتر / مل من O 2 ،2 دقيقة.
    3. تأكد من تخدير الفأر من خلال البحث عن عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
    4. ضع مادة تشحيم العين على سطح العين وضع الماوس على وسادة التدفئة.
  3. حقن ببطء وبعناية محلول 58Fe-Tf في الجيب المداري الرجعي.
  4. السماح للفأر بالتعافي من التخدير ؛ لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
  5. ست ساعات بعد الحقن ، القتل الرحيم E17.5 الإناث الحوامل عن طريق جرعة زائدة من إيزوفلوران.
    1. إجراء ثقب في القلب لexsanguinate الفأر كشكل من أشكال القتل الرحيم الثانوي.
    2. دبوس القدمين لأسفل مع الإبر لتحقيق الاستقرار.
  6. جمع المشيمة وكبد الجنين.
    1. باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح ، قم بإزالة الرحم بعناية من الفأر الحامل. قطع وحدة المشيمة الجنينية المشيمة ، والتي تتكون من جنين واحد ومشيمة في الكيس الأمنيوسي محاط بجزء من الرحم.
    2. قطع بعناية من خلال الرحم والكيس الأمنيوسي دون إزعاج الجنين والمشيمة.
    3. قشر الكيس الأمنيوسي وإزالة الجنين والمشيمة.
    4. قطع الحبل السري.
    5. امسح الجنين والمشيمة بمهمة نظيفة لإزالة السائل الأمنيوسي الزائد.
    6. سجل أوزان المشيمة بأكملها.
    7. اقطعي كل مشيمة إلى نصفين بشفرة حلاقة ، ضعي كل نصف في أنبوب سعة 2.0 مل ، وجمديها في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: نظرا لأن 58 Fe لا يتطلب احتياطات مناولة خاصة والتخلص ، يمكن استخدام نصف المشيمة لقياس 58Fe والنصف الآخر لأي تحليلات أخرى ، بما في ذلك القياس الكمي لمستقبلات الترانسفيرين (TFR1) وتعبير الفيروبورتين (FPN) عن طريق النشاف الغربي و qPCR.
    8. لجمع كبد الجنين ، ضحي بالجنين: استخدم شفرة حلاقة لقطع رأس الجنين بسرعة.
      ملاحظة: في E17.5 ، يجب القتل الرحيم لجميع الأجنة في الرحم بشكل فردي ، حتى لو لم يتم استخدامها في الدراسة.
    9. ثبت الجنين لتحقيق الاستقرار ، وترك البطن مكشوفا.
    10. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق صغير حيث تم توصيل الحبل السري ، وأدخل أحد طرفي مقص التشريح في الشق ، وقم بإجراء قطع مستوى متوسط باتجاه المستوى الإكليلي حوالي 1/4 بوصة. بعد ذلك ، قم بإجراء جروح مستعرضة لفضح كبد الجنين.
    11. استخدم ملقط لإزالة كبد الجنين.
    12. سجل أوزان كبد الجنين كله.
    13. ضع كبد الجنين بالكامل في أنابيب سعة 2 مل وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جزء فقط من كبد الجنين لقياس 58Fe إذا كانت هناك حاجة إلى تحليلات إضافية. يسمح استخدام أنابيب سعة 2.0 مل بتجانس الأنسجة بشكل أفضل من الأنابيب سعة 1.5 مل.
  7. قم بتخزين المناديل إلى أجل غير مسمى عند -80 درجة مئوية.

4. معالجة الأنسجة لتحليل الحديد الكمي بواسطة ICP-MS

  1. معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية الحديد غير الهيم.
    1. إذابة نصفي المشيمة وكبد الجنين الكامل ، ووزن نصفي المشيمة (انظر الخطوة 3.6.12 لتسجيل أوزان كبد الجنين).
    2. أضف 400 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين (0.53 N HCl ، 5.3٪ TCA).
    3. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الكهربائي.
    4. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    5. تبريد العينات في الماء درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    6. افتح الأغطية لتحرير الضغط ، ثم أغلق الأنابيب مرة أخرى.
    7. جهاز طرد مركزي بسرعة 17000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحطام أنسجة الحبيبات.
    8. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد مسمى.
    9. إرسال عينات لتحليل ICP-MS.
  2. معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية حديد الهيم.
    ملاحظة: بعد استخراج الحديد غير الهيم في الخطوة 1 ، يكون الحديد المتبقي في الحبيبات هو في الغالب الهيم.
    1. سجل وزن كل حبيبة من الخطوة 4.1.7.
    2. هضم الكريات في 10 مل من 70٪ HNO3 المركزة مع 1 مل من 30٪ H 2 O2
      ملاحظة: التشاور مع مركز أو مركز ICP-MS لتحسين حجم HNO3 لدراسات محددة ؛ سيعتمد الحجم جزئيا على وزن العينة.
    3. سخني العينات إلى 200 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. أرسل العينات لتحليل ICP-MS.
      ملاحظة: إذا لم يكن التمييز بين مصادر الحديد الهيم وغير الهيم مطلوبا وتم قياس الحديد الكلي فقط ، فيمكن هضم الأنسجة الكاملة في HNO3 كخطوة أولى.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: قدمت البيانات المستمدة من برنامج المقارنات الدولية MS على شكل تركيزات 56Fe و 58Fe في نانوغرام / مل أو ملغم ، جزء في البليون (الجدول 1). 56 الحديد هو نظير الحديد الأكثر وفرة في الطبيعة ، ويعكس قياسه تراكم الحديد في المشيمة / الجنين طوال فترة الحمل ، بينما يعكس قياس 58Fe الحديد الذي تم نقله خلال 6 ساعات بعد الحقن.

  1. اطرح الوفرة الطبيعية ل 58 Fe (0.28٪ من إجمالي Fe) من قيم 58Fe المقاسة.
  2. احسب إجمالي nonheme 58Fe.
    1. احسب إجمالي الحديد غير الهيم للكبد الجنيني (ng) بضرب تركيز الحديد (ng / mL) المحسوب في الخطوة 5.1 بالحجم (mL) أثناء المعالجة الأولية في الخطوة 4.1.2 لتقدير إجمالي 58Fe.
    2. احسب كمية الحديد في المشيمة بأكملها بأخذ الوزن الكلي للمشيمة المقاسة في الخطوة 3.6.6 وقسمتها على وزن المشيمة المعالجة في الخطوة 4.1.1. اضرب هذه القيمة في إجمالي الحديد غير الهيم (ng) المحسوب في الخطوة 5.2.1 للحصول على إجمالي محتوى nonheme 58Fe للمشيمة.
  3. حساب مجموع الهيم 58الحديد.
    1. احسب إجمالي الهيم 58Fe بضرب تركيز الحديد (ng / mg) المحسوب في الخطوة 5.1 بوزن الحبيبات (بالملغم) المقاس في الخطوة 4.2.1.
    2. بعد ذلك, قسم الوزن الإجمالي للمشيمة المقاسة في الخطوة 3.5.1 على وزن حبيبات المشيمة المقاسة في الخطوة 4.2.1. اضرب هذه القيمة في إجمالي حديد الهيم (ng) المحسوب في الخطوة 5.3.1 للحصول على إجمالي محتوى الهيم 58Fe للمشيمة.
  4. اجمع قيم nonheme و heme 58Fe المحسوبة لتحديد إجمالي محتوى الحديد لكل نسيج.

figure-protocol-1
الشكل 1: ملخص مرئي للخطوات في البروتوكول. (أ) تحضير 58مادة Fe-transferrin. (ب) إعطاء 58Fe-transferrin. ج: جمع الأنسجة وتخزينها. (د) معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية الأنواع المعدنية بواسطة ICP-MS. الاختصارات: Fe = حديد. NTA = حمض النيتريلوتريسيتيك. Tf = ترانسفيرين ؛ PPS = محلول ترسيب البروتين ؛ سوب = طاف ؛ TCA = حمض ثلاثي كلورو الخليك ؛ ICP-MS = مطياف كتلة البلازما المقترن بالحث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت دراسة سابقة باستخدام نظائر الحديد المستقرة لقياس انتقال الحديد أن نقص الحديد الأمومي أدى إلى انخفاض تنظيم مصدر الحديد المشيمة ، FPN4. FPN هو المصدر الوحيد المعروف للحديد في الثدييات ، ويؤدي غياب FPN أثناء التطور إلى موت الجنين قبل E9.529. لتحديد ما إذا كان الانخفاض الملحوظ في تعبير FPN يترجم وظيفيا إلى انخفاض نقل الحديد المشيمي ، تم حقن 58Fe-Tf عن طريق الوريد في السدود الحوامل ، وتم تحديد الحديد في المشيمة والجنين في وجود نقص الحديد الأمومي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحديد مهم للعديد من العمليات البيولوجية ، وحركته وتوزيعه داخل الجسم ديناميكي للغاية ومنظم. توفر نظائر الحديد المستقرة بديلا ثابتا ومناسبا للنظائر المشعة لتقييم ديناميات توازن الحديد. الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي تتبع جميع أوزان الأنسجة وأحجامها. الحديد عنصر وبالتالي لا يمكن تصنيعه أو تكسيره. وبالتالي ، إذا تم تسجيل جميع الأوزان والأحجام بعناية ، فيمكن حساب كل الحديد داخل النظام عن طريق الحساب. كما هو موضح ، يمكن استخدام هذه الطريقة للتمييز بين مصادر الحديد الهيم وغير الهيم. ومع ذلك ، إذا لم يكن هذا التمييز بين أشكال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EN هو مؤسس علمي مشارك ل Intrinsic LifeSciences و Silarus Pharma ومستشار ل Protagonist و Vifor و RallyBio و Ionis و Shield Therapeutics و Disc Medicine. VS تعلن عدم وجود تعارضات.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون باستخدام مرفق ICP-MS داخل مركز UC للآثار البيئية لتكنولوجيا النانو في CNSI في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس لمساعدتهم في تحسين البروتوكول لقياسات 58Fe. تم دعم الدراسة من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) (K01DK127004 ، إلى VS) والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) (R01HD096863 ، إلى EN).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
58Fe-الحديدالمعادن تتبع العلوم الدوليةFe-58
Amicon ultra-15 مرشح الطرد المركزي ، 30 كيلو دالتون قطعMillipore SigmaUFC903024
أنابيب الطرد المركزي ، 15 ملفيشر Scientific14-959-49B
أنابيب الطرد المركزي ، 50 ملMillipore SigmaCLS430829
الطرد المركزي ، Sorvall Legend Micro 17 Micro الطرد المركزي
، Sorvall Legend RT
المهام الدقيقةFisher Scientific06-666
النظام الغذائي: نقص الحديد (4 جزء في المليون من الحديدEnvigo TekladTD.80396
النظام الغذائي: طعام قياسي (185 جزء في المليون من الحديد)PicoLab5053
مقص تشريح بحافةقطع 30 ممVWR25870-002
ملقط 4-1 / 2 بوصةطول McKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
Homogenizer ، Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf)Celliance4452-01لم يعد متاحا ، بديل: Millipore 616419
حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك)من فيشر ScientificA144S-500
(H2< / sub>O2< / sub>) ، محلول 35٪ بالوزن في الماءCole-ParmerEW-88216-36
محاقن الأنسولين ، BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
IsofluraneVETone502017
Isoflurane VaporizorSummit Anesthesia Solutions
كتلة حرارية معدنيةفيشر Scientific
مع غطاء لولبي مسطحVWR16466-064
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل منخفضة الاحتفاظفيشر ساينتفيك02-681-320
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2.0 مل منخفضةفيشر ساينتفيك02-681-321
وحدة تصفية حقنة Millex-GP ، 0.22 وميكرو ؛ م ، بولي إيثر سلفون ، 33 مم ، معقم بجاماميليبور سيجماSLGP033RS
حمض النتريلوتري أسيتيك (NTA)سيجما72560-100 جم
إبرة 25 جم × 5/8 بوصة الاستخدام العام تحت الجلدفيشر Scientific14-826AA
، بلاستيك pH5.0-9.0فيشر ساينتفيك13-640-519
شفرات حلاقة 0.22 ممVWR55411-050
مقياس (ز)مقياس Mettler ToledoPB1502-S
(ملغ)Mettler ToledoBalance XS204
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)SigmaS5761-500G
كلوريد الصوديوم (NaCl)فيشر ScientificS671-3
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)فيشرScientificSS266-1
حقنة معقمة ، طرف انزلاق (1 مل)فيشر ساينتفيك309659
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA)فيشر ساينتفيكA322-500<
قوي>برنامج < / قوي>
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat
جهاز الطرد المركزي Fisher Scientific 75002432 مساحات ) بيروكسيد الهيدروجين أنبوب الطرد المركزي الصغير الاحتفاظ شرائح الأس الهيدروجيني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ICP MS

مقالات ذات صلة