يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطبيقات تدخل الحمض النووي الريبي في الصرصور الأمريكي

2.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63380

⸱

ديسمبر 17, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, Institute of Insect Science and Technology & School of Life Sciences, South China Normal University, 2Guangmeiyuan R&D Center, Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, South China Normal University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية خطوة بخطوة لتقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana.

الملخص

الصراصير ، وهي آفة صحية ، هي أنواع أساسية في الدراسات التنموية والمتحولة للحشرات بسبب سهولة تغذيتها وخصائصها نصف الأيضية. جنبا إلى جنب مع تسلسل الجينوم المشروح جيدا ، جعلت هذه المزايا الصرصور الأمريكي ، Periplaneta americana ، نموذجا مهما للحشرات نصف الأيضية. نظرا لمحدودية النقص في استراتيجية الضربة القاضية ، يصبح الضربة القاضية الجينية الفعالة القائمة على تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تقنية لا غنى عنها في أبحاث الجينات الوظيفية ل P. americana. يصف هذا البروتوكول تقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana. يتضمن البروتوكول (1) اختيار P. americana في مراحل النمو المناسبة ، (2) التحضير لإعداد الحقن ، (3) حقن dsRNA ، و (4) اكتشاف كفاءة ضربة قاضية للجينات. RNAi هو أداة وراثية عكسية قوية في P. americana. غالبية أنسجة P. americana حساسة ل dsRNA خارج الخلية. تسمح بساطته للباحثين بالحصول بسرعة على أنماط ظاهرية مختلة وظيفيا تحت حقن واحدة أو عدة حقن dsRNA مستهدفة ، مما يمكن الباحثين من استخدام P. americana بشكل أفضل للدراسات التنموية والمتحولة.

المقدمة

يصبح تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وهو آلية محفوظة تطوريا ، تدريجيا أداة جينية عكسية أساسية لمنع التعبير الجيني في العديد من الكائنات الحية1 ، منذ أن طور أندرو فاير وكريغ ميلو2 استراتيجية صمت الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA). يتم شق dsRNA إلى شظايا من 21-23 نيوكليوتيدات ، الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) ، بواسطة إنزيم Dicer في الخلايا لتنشيط مسار RNAi. ثم يتم دمج siRNAs في مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، والذي يقترن بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف ، ويسبب انقسام الحمض النووي الريبي المرسال ، ويؤدي في النهاية إلى فقدان وظيفة الجينات3،4،5. من بين أنواع الحشرات ، تم الإبلاغ عن العديد من تجارب RNAi الجهازية حتى الآن في الكثير من أوامر الحشرات ، مثل Orthoptera و Isoptera و Hemiptera و Coleoptera و Neuroptera و Diptera و Hymenoptera و Lepidoptera و Blattodea 5,6,7,8.

الصراصير (Blattaria) هي عائلة حشرات أساسية في الدراسات التنموية والمتحولة مع دورات نموها السريع ، وقدرتها القوية على التكيف مع البيئة ، واللدونة التنموية العالية9. قبل اكتشاف أن الحمض النووي الريبي كان متوافقا مع الصراصير ، ركزت الأبحاث السابقة فقط على الوقاية من الصراصير ومكافحتها بسبب ندرة تقنيات التلاعب الجيني في الصراصير. جعلت البنية الفريدة ل cockroach ootheca من الصعب إجراء عملية الضربة القاضية الجينية القائمة على حقن الأجنة باستخدام نظام CRISPR-Cas9. إلى جانب ذلك ، تظهر معظم الأنسجة في الصراصير (مثل P. americana) استجابة RNAi جهازية قوية ، مما يسمح بالتوليد السريع للأنماط الظاهرية المختلة وظيفيا عن طريق حقن واحد أو أكثر يستهدف dsRNAs 9,10,11. جعلت هذه الميزات RNAi تقنية لا غنى عنها في البحوث الوظيفية الجينية في P. americana.

على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن استخدام الحمض النووي الريبي في أبحاث الجينات الوظيفية في P. americana ، إلا أنه لم يتوفر وصف مفصل أو خطوة بخطوة. يقدم هذا التقرير إرشادات تشغيلية خطوة بخطوة ل RNAi في P. americana ، وهو مفيد لدراسة وظيفة الجينات في الصراصير الأخرى. علاوة على ذلك ، لا يقتصر هذا الدليل على Blattodea ويمكن تطبيقه على العديد من الحشرات الأخرى مع تعديلات طفيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم توفير خط P. americana في البداية من قبل الدكتور Huiling Hao. تم الحفاظ على هذا النوع مع زواج الأقارب لمدة 30 عاما9.

1. تفريخ وتغذية P. americana

  1. جمع oothecae الطازجة (مباشرة بعد وضع البيض) من P. americana وحضانتها في الحاضنة المظلمة عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60 ٪ لمدة 25 يوما تقريبا. ثم قم بزيادة درجة الحرارة والرطوبة إلى 30 درجة مئوية و 75٪ قبل 3 أيام من الفقس.
  2. استخدم غربالا بفتحة 4 مم لفصل الحوريات الفقس عن oothecae.
  3. احتفظ بالحوريات في حاويات أسطوانية (قطرها 12 سم وارتفاعها 10 سم) في الظلام عند 28 درجة مئوية ، رطوبة 70٪. قم بتنظيف الحافة الداخلية للحاويات بالفازلين لمنع الصراصير من الهروب. توفير الغذاء والماء والمأوى للفئران (صواني البيض). انتبه إلى نشاط الحوريات ونظف البراز والحطام بانتظام.

2. اختيار الحوريات في instar السليم

  1. استخدم أنبوبا زجاجيا لاختيار P. americana الطازج (أبيض في لون الجسم). احتفظ بها في حاويات جديدة وانتظر المرحلة الصحيحة للعلاج.
    ملاحظة: بعد ~ 19 يوما في ظل ظروف التغذية المذكورة أعلاه ، ستكون الحوريات في 3rd instars متاحة للحقن. لون الصراصير المنصهرة حديثا أبيض ، ويتم توضيح النجوم من خلال أوقات طرح الريش.

3. إعداد الجزء المستهدف مع المروجين T7

  1. باستخدام cDNA من P. americana كقالب ، قم بتصميم الاشعال المقترنة لأداء PCR للحصول على 300-800 bp DNA جزء من الجين المستهدف9. ثم قم باستنساخ جزء PCR إلى متجه pTOPO (انظر جدول المواد) للتسلسل.
  2. باستخدام الحمض النووي للجزء المستهدف كقالب ، قم بتوليف زوج جديد من الاشعال مع تسلسل المروج T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') في المحطات الطرفية 5 'وإجراء جولة أخرى من PCR للحصول على الجزء المستهدف مع المروجين T7 على كل جانب9.

4. نسخ وتوليف dsRNA في المختبر

  1. أضف 10 ميكرولتر من T7 2X Buffer ، و 2 ميكرولتر من Enzyme Mix ، و T7 Express (انظر جدول المواد) ، و 2 ميكروغرام من منتج PCR (تم الحصول عليه في الخطوة 3.2) في نظام التفاعل وأضف الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر مع ddH2O. اخلط بلطف رأسا على عقب يدويا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. تمييع محلول RNase A (4 ميكروغرام / ميكرولتر) مع ddH2O بنسبة 1:200. ثم أضف 1 ميكرولتر من DNase الخالي من RQ1 RNase (1 U / μL) و 1 ميكرولتر من محلول RNase A المخفف إلى النظام (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الآن، حجم نظام واحد هو 22 ميكرولتر.
  3. تحضن في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 10٪ من الحجم الكلي (عند إجراء تفاعلات N في وقت واحد ، يكون الحجم الإجمالي N × 22 ميكرولتر) من خلات الصوديوم وثلاثة أحجام من الحجم الكلي للأيزوبروبانول.
  4. اخلطي بلطف رأسا على عقب يدويا، وضعيه على الجليد لمدة 5 دقائق، وجهاز الطرد المركزي على حرارة 13000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام ماصة ، واغسل البقايا بالإيثانول بنسبة 75٪ (مع 25٪ من الماء المعالج بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) ، ثم جهاز طرد مركزي عند 13000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. إزالة supernatant مرة أخرى. جفف الكريات في الهواء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم ~ 100 ميكرولتر من ماء DEPC لإذابة dsRNA ، ثم قم بتخفيف dsRNA إلى 2 ميكروغرام / ميكرولتر النهائي.
    ملاحظة: يمكن تخزين DSRNA عند -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.

5. تحميل حل dsRNA في حقنة

  1. قم بإعداد البرنامج في مضخة الحقن الدقيقة (انظر جدول المواد) مقدما لضمان اتساق حجم كل حقنة. قبل استخدام المحقنة ، قم بتنظيف المحقنة عن طريق ملئها بماء DEPC 8-10 مرات.
  2. قم بتثبيت حقنة 10 ميكرولتر على مضخة الحقن الدقيقة ، وابدأ تشغيل المضخة ، واملأ المحقنة ب 10 ميكرولتر من محلول dsRNA (المعد في الخطوة 4.6). حقن 1 ميكرولتر من dsRNA في حورية 3rd instar (انظر الخطوة 2) وتأكد من أنها لا تتسرب إلى الجسم.

6. حقن dsRNA إلى P. أمريكانا

  1. تخدير الصراصير مع زيادة تركيز CO2 في حاوية حتى لا تتحرك الصراصير بعد الآن ، ثم المضي قدما على الفور في الحقن.
  2. التقط الصرصور بلطف باستخدام ملاقط ، وقم بتوصيل الصرصور نحو الإبرة باليد. بعد ذلك ، أدخل الإبرة عبر الفجوة بين اثنين من سوميت البطن أفقيا ضد البشرة. حول إدراج العمق ، كلما كان ذلك ضحلا ، كان ذلك أفضل.
  3. ثم ، حقن محلول dsRNA في الصرصور. أخيرا ، اسحب طرف الإبرة. تأكد من أن طرف الإبرة أقرب ما يمكن إلى البشرة لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية.
    ملاحظة: يجب أن يتم الحقن تحت مجهر تشريح.
  4. ضع الصراصير المحقونة في حاويات الفحص الحيوي النظيفة. انتظر حوالي 10-20 دقيقة للسماح لهم بالتعافي من تأثيرات CO2. قم بتسمية الحاويات بتاريخ الحقن ونوع وجرعة dsRNA وعمر P. americana.
  5. ضع الصراصير المحقونة في بيئة مظلمة عند 28 درجة مئوية ، رطوبة 70٪ ، ووفر الماء والأعلاف والمأوى ، ولاحظ التغيرات المحتملة في النمط الظاهري للصراصير بانتظام.

7. تأكيد الضربة القاضية وتحليل النمط الظاهري

  1. تقييم كفاءة الحمض النووي الريبي باستخدام أي تقنيات بيولوجية جزيئية متاحة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) والنشاف الغربي. للحصول على تفاصيل qRT-PCR وإجراءات النشاف الغربية، راجع المراجع1،12.
  2. لمراقبة وتحليل الأنماط الظاهرية المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، استخدم المجهر المناسب للحيوانات الحية.
    ملاحظة: قد يؤثر الحمض النووي الريبي على المورفولوجيا والسلوك وطرح الريش وتجديد الأطراف والأنشطة الفسيولوجية الأخرى للصراصير. يتم حساب التردد المحدد للنمط الظاهري وفقا لظروف محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 حقنة ناجحة. يجب وضع حقنة الحقن المجهري ذات إبرة قطرها الصغير أفقيا على الداعم (الشكل 1A). يتم إدخال الإبرة عبر الفجوة بين اثنين من سوميت البطن أفقيا ضد البشرة (الشكل 1B). تأكد من أن السائل يذهب إلى بطن P. americana. الزاوية شديدة الانحدار للإبرة ستلحق الضرر بالأعضاء الداخلية (الشكل 1C) ، والحقن غير السليم يؤدي إلى تسرب محلول dsRNA خارج البطن (الشكل 1D<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصف هذا التقرير استراتيجية منهجية خطوة بخطوة للحمض النووي الريبي في P. americana. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيقه أيضا على الصراصير الأخرى (Blattella germanica ، على سبيل المثال) والعديد من الحشرات الأخرى ذات التغييرات الطفيفة. ومع ذلك ، فإن كفاءة إسكات الجينات في RNAi ليست دائما عالية بما فيه الكفاية ، مع عيب واضح مقارنة باستراتيجية الضربة القاضية الجينية13. قد يتداخل التأثير المتبقي التالي لمستوى الجينات مع الأنماط الظاهرية الحقيقية. لضمان نجاح علاج الحمض النووي الريبي ، يجب ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 32070500 31620103917 31330072 31572325 إلى C.R. ، Sh.L.) ، من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (المنحة رقم 2021B1515020044 و 2020A1515011267 إلى C.R.) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (رقم المنحة 2019B090905003 و 2019A0102006) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (المنحة رقم 202102020110) ، من قبل برنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272 إلى Sh.L.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
701 N 10 & micro; L Syr (26 ثانية / 51/2)هاميلتونPN: 80300
حاضنةمصنع أدوات نينغبو جيانغنانRXZ-380A-LEDللصراصير تفقيس
وتغذية مضخة الحقن الدقيقةAlcott BiotechnologyALC-IP600طقم
استنساخ pTOPO-BluntAidlab BiotechnologyCV16لأنظمة
PCR الكمية في الوقت الحقيقيBio-RadCFX Connectلتحليل qRT-PCR
نظام T7 RiboMAX Express RNAiSystem PromegaP1700لتخليق dsRNA ، والذي يحتوي على محلول Rnase A (4 & mu ؛ ز /&مو; L) ، أسيتات الصوديوم ، 3.0 متر (درجة الحموضة 5.2) ، مزيج الإنزيم ، T7 Express ، ماء خال من النوكلياز ، Express T7 2x Buffer ، RQ1 RNase
Free DNase Thermal CyclersBio-RadS1000لتضخيم الحمض النووي
حقن

المراجع

  1. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
  4. Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
  5. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  6. French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
  7. Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
  8. Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
  9. Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
  10. Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
  11. Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
  12. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
  13. Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
  14. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  15. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
  16. Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
  17. Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
  18. Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
  19. Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
  20. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
  21. Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تطبيقات تدخل الحمض النووي الريبي في الصرصور الأمريكي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.