يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية خطوة بخطوة لتقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيقات تدخل الحمض النووي الريبي في الصرصور الأمريكي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الصراصير ، وهي آفة صحية ، هي أنواع أساسية في الدراسات التنموية والمتحولة للحشرات بسبب سهولة تغذيتها وخصائصها نصف الأيضية. جنبا إلى جنب مع تسلسل الجينوم المشروح جيدا ، جعلت هذه المزايا الصرصور الأمريكي ، Periplaneta americana ، نموذجا مهما للحشرات نصف الأيضية. نظرا لمحدودية النقص في استراتيجية الضربة القاضية ، يصبح الضربة القاضية الجينية الفعالة القائمة على تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تقنية لا غنى عنها في أبحاث الجينات الوظيفية ل P. americana. يصف هذا البروتوكول تقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana. يتضمن البروتوكول (1) اختيار P. americana في مراحل النمو المناسبة ، (2) التحضير لإعداد الحقن ، (3) حقن dsRNA ، و (4) اكتشاف كفاءة ضربة قاضية للجينات. RNAi هو أداة وراثية عكسية قوية في P. americana. غالبية أنسجة P. americana حساسة ل dsRNA خارج الخلية. تسمح بساطته للباحثين بالحصول بسرعة على أنماط ظاهرية مختلة وظيفيا تحت حقن واحدة أو عدة حقن dsRNA مستهدفة ، مما يمكن الباحثين من استخدام P. americana بشكل أفضل للدراسات التنموية والمتحولة.
المقدمة
يصبح تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وهو آلية محفوظة تطوريا ، تدريجيا أداة جينية عكسية أساسية لمنع التعبير الجيني في العديد من الكائنات الحية1 ، منذ أن طور أندرو فاير وكريغ ميلو2 استراتيجية صمت الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA). يتم شق dsRNA إلى شظايا من 21-23 نيوكليوتيدات ، الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) ، بواسطة إنزيم Dicer في الخلايا لتنشيط مسار RNAi. ثم يتم دمج siRNAs في مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، والذي يقترن بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف ، ويسبب انقسام الحمض النووي الريبي المرسال ، ويؤدي في النهاية إلى فقدان وظيفة الجينات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم توفير خط P. americana في البداية من قبل الدكتور Huiling Hao. تم الحفاظ على هذا النوع مع زواج الأقارب لمدة 30 عاما9.
1. تفريخ وتغذية P. americana
- جمع oothecae الطازجة (مباشرة بعد وضع البيض) من P. americana وحضانتها في الحاضنة المظلمة عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60 ٪ لمدة 25 يوما تقريبا. ثم قم بزيادة درجة الحرارة والرطوبة إلى 30 درجة مئوية و 75٪ قبل 3 أيام من الفقس.
- استخدم غربالا بفتحة 4 مم لفصل الحوريات الفقس عن oothecae.
- احتفظ بالحوريات في حاويات أسطوانية (قطرها 12 سم وارتفاعها 10 سم) في الظلام عند 28 درجة مئوية ، رطوبة 70٪. قم بتنظيف الحافة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1 حقنة ناجحة. يجب وضع حقنة الحقن المجهري ذات إبرة قطرها الصغير أفقيا على الداعم (الشكل 1A). يتم إدخال الإبرة عبر الفجوة بين اثنين من سوميت البطن أفقيا ضد البشرة (الشكل 1B). تأكد من أن السائل يذهب إلى بطن P. americana. الزاوية شديدة الانحدار للإبرة ستلحق الضرر بالأعضاء الداخلية (الشكل 1C) ، والحقن غير السليم يؤدي إلى تسرب محلول dsRNA خارج البطن (الشكل 1D<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصف هذا التقرير استراتيجية منهجية خطوة بخطوة للحمض النووي الريبي في P. americana. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيقه أيضا على الصراصير الأخرى (Blattella germanica ، على سبيل المثال) والعديد من الحشرات الأخرى ذات التغييرات الطفيفة. ومع ذلك ، فإن كفاءة إسكات الجينات في RNAi ليست دائما عالية بما فيه الكفاية ، مع عيب واضح مقارنة باستراتيجية الضربة القاضية الجينية13. قد يتداخل التأثير المتبقي التالي لمستوى الجينات مع الأنماط الظاهرية الحقيقية. لضمان نجاح علاج الحمض النووي الريبي ، يجب ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 32070500 31620103917 31330072 31572325 إلى C.R. ، Sh.L.) ، من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (المنحة رقم 2021B1515020044 و 2020A1515011267 إلى C.R.) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (رقم المنحة 2019B090905003 و 2019A0102006) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (المنحة رقم 202102020110) ، من قبل برنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272 إلى Sh.L.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 & micro; L Syr (26 ثانية / 51/2) | هاميلتون | PN: 80300 | |
| حاضنة | مصنع أدوات نينغبو جيانغنان | RXZ-380A-LED | للصراصير تفقيس |
| وتغذية مضخة الحقن الدقيقة | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | طقم |
| استنساخ pTOPO-Blunt | Aidlab Biotechnology | CV16 | لأنظمة |
| PCR الكمية في الوقت الحقيقي | Bio-Rad | CFX Connect | لتحليل qRT-PCR |
| نظام T7 RiboMAX Express RNAi | System Promega | P1700 | لتخليق dsRNA ، والذي يحتوي على محلول Rnase A (4 & mu ؛ ز /&مو; L) ، أسيتات الصوديوم ، 3.0 متر (درجة الحموضة 5.2) ، مزيج الإنزيم ، T7 Express ، ماء خال من النوكلياز ، Express T7 2x Buffer ، RQ1 RNase |
| Free DNase Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | لتضخيم الحمض النووي |
المراجع
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
