مقالة منهجية

عزل النواة منخفضة الإدخال وتعدد الإرسال باستخدام الأجسام المضادة المشفرة للعقد الودية للفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

DOI:

10.3791/63397

⸱

مارس 23, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إعداد العينة المفصلة والمنخفضة المدخلات لتسلسل النواة الواحدة، بما في ذلك تشريح العقد العنقية والنجمية المتفوقة للفأر، وتفكك الخلايا، والحفظ بالتبريد، وعزل النواة، والترميز الشريطي للوسوم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي أمر بالغ الأهمية في التحكم في وظيفة القلب ، مثل معدل ضربات القلب وانقباض القلب ، وينقسم إلى فروع ودية وغير ودية. عادة ، هناك توازن بين هذين الفرعين للحفاظ على التوازن. ومع ذلك ، فإن حالات أمراض القلب مثل احتشاء عضلة القلب وفشل القلب وارتفاع ضغط الدم يمكن أن تحفز على إعادة تشكيل الخلايا المشاركة في تعصيب القلب ، والذي يرتبط بنتيجة سريرية ضارة.

على الرغم من وجود كميات هائلة من البيانات للبنية النسيجية ووظيفة الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي ، إلا أن بنيته البيولوجية الجزيئية في الصحة والمرض لا تزال غامضة في العديد من الجوانب. التقنيات الجديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) تبشر بالتوصيف الجيني للأنسجة بدقة خلية واحدة. ومع ذلك ، فإن الحجم الكبير نسبيا للخلايا العصبية قد يعيق الاستخدام الموحد لهذه التقنيات. هنا ، يستغل هذا البروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة القائم على القطيرات (snRNA-seq) ، وهي طريقة لتوصيف البنية البيولوجية للخلايا العصبية الودية القلبية في الصحة والمرض. تم إثبات نهج تدريجي لأداء snRNA-seq من عنق الرحم العلوي الثنائي (SCG) والعقد النجمية (StG) التي تم تشريحها من الفئران البالغة.

تتيح هذه الطريقة الحفاظ على العينات على المدى الطويل ، والحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي المناسبة عندما لا يمكن جمع عينات من أفراد / تجارب متعددة في وقت واحد خلال فترة زمنية قصيرة. يتيح الترميز الشريطي للنوى باستخدام علامات التصنيف oligos (HTOs) إزالة الإرسال المتعدد وتتبع العينات العقدية المميزة بعد التسلسل. كشفت التحليلات اللاحقة عن نجاح التقاط النوى للخلايا العصبية والدبقية الساتلية والبطانية للعقد الودية، كما تم التحقق من صحتها بواسطة snRNA-seq. باختصار ، يوفر هذا البروتوكول نهجا تدريجيا ل snRNA-seq من العقد القلبية الخارجية الودية ، وهي طريقة لديها القدرة على التطبيق على نطاق أوسع في دراسات تعصيب الأعضاء والأنسجة الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي اللاإرادي (ANS) هو جزء حاسم من الجهاز العصبي المحيطي الذي يحافظ على توازن الجسم ، بما في ذلك التكيف مع الظروف البيئية وعلم الأمراض1. وهي تشارك في تنظيم أنظمة الأعضاء المتعددة في جميع أنحاء الجسم مثل أنظمة القلب والأوعية الدموية والجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والغدد الصماء. ينقسم ANS إلى فروع متعاطفة ومتماسكة. فروع العمود الفقري للجهاز العصبي الودي المشبك في العقد من السلسلة الودية ، وتقع ثنائيا في وضع شبه الفقرية. العقد العنقية والصدرية الثنائية ، وخاصة StG ، هي مكونات مهمة تشارك في التعصيب الودي القلبي. في الحالات المرضية ، مثل نقص تروية القلب ، يمكن أن تحدث إعادة تشكيل الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى فرط الحركة الودي2. وقد ثبت إعادة تشكيل الخلايا العصبية في دراسات نسيجية متعددة في البشر والعديد من أنواع الحيوانات الأخرى3،4،5،6. لا يوجد حاليا توصيف بيولوجي مفصل لإعادة تشكيل الخلايا العصبية الناجمة عن نقص تروية القلب في العقد الودية القلبية ، ولم يتم تحديد الخصائص البيولوجية الأساسية لأنواع الخلايا العصبية المتخصصة أو الأنواع الفرعية داخل الجهاز العصبي الودي القلبي (SNS) بشكل كامل حتى الآن في الصحة والمرض7.

وقد فتحت التقنيات الجديدة، مثل scRNA-seq، بوابات للتوصيف الجيني للأنسجة الصغيرة على مستوى خلية واحدة 8,9. ومع ذلك ، فإن الحجم الكبير نسبيا للخلايا العصبية قد يعيق الاستخدام الأمثل لهذه التقنيات أحادية الخلية في البشر10. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تسلسل الخلية الواحدة إنتاجية عالية للخلايا لاستعادة عدد كاف من الخلايا بسبب الخسارة العالية في عملية التسلسل. قد يكون هذا تحديا عند دراسة الأنسجة الصغيرة التي يصعب التقاطها في جلسة واحدة وتتطلب عينات متعددة لإدخال خلايا مفردة كافية للتسلسل. تسمح تقنية snRNA-seq القائمة على القطيرات التي تم تطويرها مؤخرا (أي منصة 10x Chromium) بدراسة الاختلافات البيولوجية بين النوى المفردة11,12. snRNA-seq يحمل ميزة على scRNA-seq للخلايا الكبيرة (>30 ميكرومتر) ، والتي قد لا يتم التقاطها في حبة الجل في المستحلبات (GEMs) ، بالإضافة إلى تحسين التوافق مع التفكك الواسع النطاق و / أو الحفظ المطول13،14،15.

عدم التجانس ، وعدد الخلايا العصبية ، والخلايا الأخرى المخصب في SNS القلب هي جوانب مهمة لتوصيف ANS في الحالات الصحية والمرضية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعصيب الخاص بالعضو أو المنطقة من قبل كل عقدة متعاطفة يساهم في تعقيد SNS. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن العقد العنقية والنجمية والصدرية للسلسلة الودية تعصب مناطق مختلفة من القلب16. لذلك ، من الضروري إجراء تحليل أحادي النواة للخلايا العقدية المشتقة من العقد الفردية لدراسة بنيتها البيولوجية.

يسمح snRNA-seq القائم على القطيرات بتنميط التعبير على نطاق النسخ لمجموعة من آلاف الخلايا من عينات متعددة في وقت واحد بتكاليف أقل من منصات التسلسل القائمة على اللوحات. يمكن هذا النهج snRNA-seq القائم على القطيرات من أن يكون أكثر ملاءمة لتصنيف النمط الظاهري الخلوي وتحديد السكان الفرعيين الجدد للخلايا داخل SCG و StG. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يوفر نهجا مرحليا موجزا لتحديد وعزل وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة للعقد القلبية الخارجية الودية ، وهي طريقة لديها القدرة على التطبيق على نطاق واسع في دراسات توصيف العقد التي تعصب الأعضاء والأنسجة الأخرى ذات الصلة في الصحة والمرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول جميع الخطوات المطلوبة ل snRNA-seq من العقد العنقية الفئرانية و / أو عنق الرحم (النجمي). تم استخدام الفئران C57BL/6J من الإناث والذكور (15 أسبوعا ، n = 2 لكل جنس). تم استخدام ماوس Wnt1-Cre ؛ mT / mG إضافي لتصور العقد لأغراض التشريح17,18. تم إنشاء هذا الماوس الإضافي عن طريق تهجين فأر B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J وماوس B6.129(Cg)-GT(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليه لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة لايدن (رقم الترخيص AVD1160020185325 ، لايدن ، هولندا). راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بجميع المواد والمعدات والبرامج والحيوانات المستخدمة في البروتوكول.

1. التحضيرات

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في خزانة تدفق زراعة الخلايا.

  1. نظف الملقط والمقص عن طريق غمر الأدوات في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة.
  2. تحضير وسط العقدة يتكون من وسط عصبي قاعدي مكمل ب B-27 plus (1x) ، L-glutamine (2 mM) ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. قم بتسخين وسط العقدة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير محلول الهضم: 0.25٪ Trypsin-EDTA (1: 1) و 1400 U / mL الكولاجيناز من النوع 2 المذاب في وسط العقدة.
  4. قم بإعداد مخزن مؤقت جديد وبارد (4 درجات مئوية) لغسل الخلايا (0.4٪ ألبومين مصل البقر [BSA]) ومخزن مؤقت للتحلل (10 mM Tris-HCl و 10 mM NaCl و 3 mM MgCl2 و 0.1٪ منظف غير أيوني ، 40 U / mL RNAse في ماء خال من النوكليز) لعزل النواة.
  5. تحضير المخزن المؤقت لغسل النواة (1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] مع 2.0٪ BSA ومثبط RNase 0.2U / μL).
  6. تحضير مخزن ST العازل للتلطيخ (ST-SB) (10 mM Tris-HCl ، 146 mM NaCl ، 21 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl 2 ،2٪ BSA ، 0.02٪ Tween-20 في الماء الخالي من النوكليز).

2. تشريح العقد العنقية العليا للفأر البالغ (SCG)

  1. القتل الرحيم للفئران وإبقائها على الجليد.
    ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم قتل ما مجموعه 4 فئران C57BL6 / J عن طريق الاختناق CO2 . بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأيزوفلوران متبوعا بالتفريغ عندما تحتاج كمية كبيرة من الدم إلى جمعها لأغراض الدراسة الأخرى.
  2. قم بإصلاح الماوس على لوحة تشريح بدبابيس وقم بإخماده بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل تشتت الفراء (الحلاقة ليست ضرورية).
  3. تحت المجهر المجسم، افتح جلد منطقة الرقبة عن طريق إجراء قطع خط الوسط بالمقص، وحرك الغدد تحت الفك السفلي جانبا، وأزل العضلة القصية لكشف وتحديد موقع الشريان السباتي المشترك وتشعبه (الشكل 1A، B، انظر السهم).
  4. تشريح تشعب الشريان السباتي الأيمن والأيسر والأنسجة المرتبطة به. انقل كل قطعة من الأنسجة المشوهة إلى طبق بتري منفصل بحجم 3.5 سم يحتوي على PBS بارد.
  5. ابحث عن SCG المرفق بالتشعب السباتي. قم بتنظيف SCG بشكل أكبر عن طريق إزالة الشريان والأنسجة الأخرى المرفقة في طبق بتري (الشكل 1E).

3. تشريح العقد النجمية للفأر البالغ (StG)

  1. لتشريح StG ، قم بعمل قطع خط الوسط في البطن ، يليه فتح الحجاب الحاجز والجدار الصدري البطني.
  2. إزالة القلب والرئتين لفضح الصدر الظهري. ابحث عن اليسار واليمين StG الأمامي الجانبي للعضلة القولونية الطويلة (MCL) على مستوى الضلع الأول (الشكل 1C ، D ، المشار إليه بخطوط متقطعة).
  3. تشريح كل من اليسار واليمين StG مع ملقط ونقلها بشكل منفصل إلى أطباق بتري 3.5 سم تحتوي على PBS الباردة (الشكل 1F).
    ​

4. عزل الخلايا العقدية للفئران والحفاظ عليها بالتبريد

ويرد في الشكل 2 موجز للخطوات من 4 إلى 6.

  1. انقل بعناية جميع SCG و StG الفردية لفصل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام الملقط.
    ملاحظة: لا تستخدم أطراف الماصة لنقل العقد لأن العقد عرضة للالتصاق بجدار أطراف الماصة البلاستيكية.
  2. أضف 500 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضنه في حمام مائي يهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تسهيل عملية الهضم وإطلاق الخلايا فيما بعد في محلول الكولاجيناز من النوع 2.
  3. قم بإعداد أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط العقدة لكل عينة. اسمح للعقد بالاستقرار في الجزء السفلي من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جمع supernatant ، الذي يحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا العقدية ، ونقل supernatant إلى أنابيب 15 مل المعدة ، ووضع علامة على كل أنبوب. بدلا من ذلك ، لتوفير بعض الوقت ، قم بشفط التربسين-EDTA الخارق دون جمع حيث يمكن اكتشاف عدد قليل جدا من الخلايا المنفصلة فيه.
    ملاحظة: يمكن ترك كمية صغيرة من محلول التربسين-EDTA (~ 10-30 ميكرولتر) في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لتجنب إزالة العقد. تجنب السحب في هذه الخطوة لأنه قد يتلف العقد ويؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلايا العقدية بعد ذلك.
  4. أضف 500 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع 2 إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضنه في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 35-40 دقيقة. حاول إعادة تعليق العقدة بعد 35 دقيقة ؛ إذا كانت العقدة لا تزال سليمة ولا تنفصل ، فقم بإطالة وقت الحضانة أو زيادة تركيز محلول الكولاجيناز من النوع 2 حسب الضرورة.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة اعتمادا على حجم العقدة.
  5. أعد تعليق العقد في محلول الكولاجيناز عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 10 مرات أو حتى لا يتم اكتشاف كتل الأنسجة.
  6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل المستخدم سابقا والذي يحتوي على وسط زراعة العقد وتعليق التربسين-EDTA من نفس العقدة. قم بتدوير تعليق الخلية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح لمدة 10 دقائق و 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص بعناية من الخلية الفائقة.
    ملاحظة: نظرا لأن الخلايا العقدية منفصلة عن عقدة واحدة ، فقد تكون حبيبات الخلايا صغيرة جدا بحيث لا يمكن اكتشافها بالعين. يمكن ترك كمية صغيرة من supernatant في الأنبوب لتجنب الإزالة العرضية لحبيبات الخلية.
  7. أعد تعليق الخلايا العقدية في 270 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني (FBS ، السموم الداخلية المنخفضة) وانقل كل تعليق خلية FBS إلى 1 مل من الكريوفيال.
  8. لحساب الخلايا ، امزج 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا العقدية مع 5 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ وقم بتحميل الخليط في مقياس دمية. عد إجمالي أعداد الخلايا الحية تحت المجهر.
    ملاحظة: عادة ما تكون صلاحية الخلية (عدد الخلايا الحية / إجمالي عدد الخلايا = قابلية البقاء) أعلى من 90٪ باستخدام بروتوكول التفكك هذا. عادة ما يقع عدد الخلايا الحية لعقدة واحدة (إما SCG أو StG) ضمن نطاق 9000-60000 خلية عندما يتم عزل العقدة من فأر يتراوح عمره بين 12 و 16 أسبوعا.
  9. أضف 30 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى كل تعليق خلية FBS في الكريوفيالات ، واخلطها جيدا ، وانقل الكريوفيات إلى حاوية تجميد الخلية ، والتي يتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الحاوية المحملة بالتبريد عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وانقل الحاويات المبردة إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي للحفاظ عليها لفترة طويلة قبل التسلسل.

5. عزل النواة

ملاحظة: تم استخدام SCG الأيسر والأيمن المعزول من أربعة فئران (في المجموع 8 عينات) كمثال في عزل النواة التالية وإعداد التسلسل. احتفظ بكل شيء على الجليد أثناء الإجراء بأكمله. بسبب عدم رؤية كريات النواة الصغيرة ، يوصى بشدة باستخدام جهاز طرد مركزي مع دلاء متأرجحة لتسهيل إزالة supernatant طوال الإجراء بأكمله.

  1. تحضير أنابيب 15 مل مع مصفاة (30 ميكرومتر) في الأعلى وشطف المصفاة مع 1 مل من وسط العقدة.
  2. أخرج الكريوفيات من النيتروجين السائل وقم بإذابتها على الفور في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. عندما يتم ترك حبيبة صغيرة من الجليد في المبرد ، خذ الكريوفيالات من الحمام المائي.
  3. استعادة الخلايا العقدية عن طريق إسقاط 1 مل من وسط العقدة في كل تبريد أثناء الاهتزاز بعناية باليد. اختياري: لتقييم استرداد الخلية، امزج تعليق الخلية بعد الاسترداد وأخرج 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا لحساب الخلايا الحية، كما هو موضح في الخطوة 4.8.
  4. قم بتحميل كل تعليق خلية عقدي على مصفاة منفصلة (يتم إعدادها في الخطوة 5.1) وشطف كل مصفاة ب 4-5 مل من وسط العقدة.
  5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلايا المتوترة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، وقم بإزالة المادة الفائقة بعناية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.
  6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق منخفض الربط DNA/RNA 0.5 مل.
  7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة 45 ميكرولتر من السوبرناتانت دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات الخلية.
  9. أضف 45 ميكرولتر من Lysis Buffer المبرد وقم بماصته بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
  10. احتضان الخلايا لمدة 8 دقائق على الجليد.
  11. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النواة الباردة إلى كل أنبوب. لا تختلط.
  12. جهاز طرد مركزي لتعليق النواة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  13. إزالة 95 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النواة.
  14. أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النواة المبردة إلى الكرية. اختياري: خذ 5 ميكرولتر من تعليق النواة ، واخلطها مع 5 ميكرولتر من 0.4٪ من أزرق التربان للعد ، وتحقق من جودة النوى تحت المجهر باستخدام مقياس الدم.
  15. جهاز طرد مركزي لتعليق النواة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. قم بإزالة السوبرناتانت دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات النواة.

6. الترميز الشريطي للنواة مع أوليجوس هاشتاغ (HTOs) وتعدد الإرسال

ملاحظة: تم تعديل خطوات تلطيخ HTO وتحسينها لوضع العلامات النووية على كميات منخفضة جدا من النوى (العقدية) وفقا للتطبيق السابق في الأنسجة القشرية بواسطة Gaublomme et al.15.

  1. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت ST-SB إلى حبيبات النواة ، وقم بماصة بلطف 8-10 مرات حتى يتم إنعاش النوى بالكامل.
  2. أضف 5 ميكرولتر من كاشف حجب Fc لكل 50 ميكرولتر من مزيج ST-SB / nuclei واحتضنه لمدة 10 دقائق على الجليد.
  3. أضف 1 ميكرولتر (0.5 ميكروغرام) من الأجسام المضادة أحادية النواة لكل أنبوب من مزيج ST-SB/nuclei واحتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: يؤدي وقت الحضانة الأقصر إلى انخفاض كفاءة وضع علامات التصنيف ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية.
  4. أضف 100 ميكرولتر من ST-SB إلى كل أنبوب. لا تختلط.
  5. جهاز الطرد المركزي لتعليق النواة لمدة 5 دقائق ، 600 × جم عند 4 درجات مئوية.
  6. إزالة 145 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النواة.
  7. كرر الخطوتين 6.4 و6.5. قم بإزالة السوبرناتانت قدر الإمكان دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات النواة.
  8. أعد تعليق حبيبات النواة في 50 ميكرولتر من ST-SB ، واخلط النوى برفق.
  9. خذ 5 ميكرولتر من تعليق النواة واخلطها مع 5 ميكرولتر من 0.4٪ من التربان الأزرق لحساب النوى تحت المجهر. انظر الشكل 3A للحصول على صورة تمثيلية للنوى الممزوجة باللون الأزرق التريبان والمحملة في مقياس الدم.
  10. جهاز الطرد المركزي لتعليق النواة لمدة 5 دقائق عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية.
  11. أعد تعليق النوى في ST-SB لتحقيق تركيز نواة مستهدف يتراوح بين 1000 و 3000 نواة / ميكرولتر لكل عينة وفقا لعدد النواة المقابلة.
  12. تجميع العينات لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا.
    ملاحظة: على سبيل المثال، في هذه التجربة، تم تجميع 8 عينات بالتساوي لتحقيق ما مجموعه 25000 نواة للانتقال فورا إلى 10x Genomics Chromium و snRNA-seq بعد ذلك. يقع عدد النواة عادة في نطاق 6000-40000 خلية عندما يتم عزل العقدة من فأر يتراوح عمره بين 12 و 16 أسبوعا. يمكن التقاط حوالي نصف إجمالي النوى المحملة فقط بواسطة snRNA-seq القائم على القطيرات. على سبيل المثال، تم إعداد خليط من 25000 نواة لضمان التقاط 10000 نواة، وهو أمر ضروري لمزيد من إعداد المكتبة وتسلسلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل مراقبة الجودة لإعداد مكتبة cDNA أحادية النواة و snRNA-seq
تصف النتائج التمثيلية نتائج تسلسل 10000 نواة تم التقاطها في تجمع واحد مع مكتبة 25000 قراءة / نواة للتعبير الجيني ومكتبة وسم 5000 قراءة / نواة. يوضح الشكل 3B نتائج مراقبة الجودة ل1st strand cDNA ، ومكتبة التعبير الجيني (GEX) ، ومكتبة HTO ، والتي تم فحصها باستخدام Bioanalyzer. ومن المتوقع أن تكون الحمض النووي الريبوزي المشتق من HTO أصغر من 180 نقطة أساس، في حين أن الحمض النووي الريبي المشتق من الحمض ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل يركز على i) تشريح العقد الودية العنقية والنجمية الفائقة للفئران البالغة ، ii) عزل الخلايا العقدية والحفاظ عليها بالتبريد ، iii) عزل النواة ، و iv) ترميز النواة الشريطية مع وضع علامات HTO لأغراض الإرسال المتعدد و snRNA-seq.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن بسهولة الحصول على الخلايا العقدية الودية عن طريق فصل العقد الفردية باستخدام التربسين والكولاجيناز الشائع الاستخدام. كما يتم تحقيق الحفاظ على الخلايا العقدية المعزولة على المدى الطويل بسهولة عن طريق تجميد الخلايا في F...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كلويت (قسم علم الوراثة البشرية، LUMC، لايدن، هولندا) على مساعدتها في التصميم التجريبي والمناقشات المفيدة. نشكر إميل جي دي ماير (قسم علم الوراثة البشرية ، LUMC ، لايدن ، هولندا) للمساعدة في عزل الحمض النووي الريبي أحادي النواة وإعداد المكتبة للتسلسل. هذا العمل مدعوم من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO) [016.196.346 إلى M.R.M.J.].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مواد كيميائية وكواشف < / قوي > 0.25
٪ تريبسين - EDTAثيرمو فيشر 25200056
العلمي 0.4٪ صبغة تريبان زرقاءبيوراد 1450021
مضاد حيوي مضاد للفطرياتجيبكو15240096
B-27جيبكوA3582801
الكولاجيناز نوع 2LS004176 ورثينجتوناستخدام 1,400 وحدة / مل
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش67685
الإيثانول المطلق & ge. 99.5٪VWRVWRC83813.360
مصل بقري للجنين (سموم داخلية منخفضة)BiowestS1810-500
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal mediumGibco21103049
مصل الأبقار الألبومين 10٪Sigma-AldrichA1595-50MLعازلة غسيل الخلايا
DPBS (Ca2 + < / sup> ، Mg < sup> 2 + < / sup> مجانا)Gibco14190-169محلول غسيل الخلايا
محلول كلوريد المغنيسيوم ، 1 MSigma-AldrichM1028عازلة تحلل النواة
Nonidet P40 بديل (منظف غير أيوني)Sigma-Aldrich74385عازلة تحلل النواة
خالية من النوكليز (غير معالج ب DEPC)InvitrogenAM9937Nucleus Lysis Buffer
حامي مثبط RNase ، 40 U/µ ؛ LSigma-Aldrich3335399001محلول محلول كلوريد الصوديوم عازلة لتحلل النواة
، 5 MSigma-Aldrich59222Cمحلول تحلل النواة
Trizma Hydrochloride ، 1 م ، درجة الحموضة 7.4Sigma-AldrichT2194عازلة تحلل النواة
الألبومين الأبقار المصل البقري 10٪Sigma-AldrichA1595-50MLغسيل النواة
DPBS (Ca2 + < / sup> ، Mg< sup>2 + < / sup> مجانا)Gibco14190-169Nucleus
wash Protector RNase Inhibitor ، 40 U/µ ؛ LSigma-Aldrich3335399001Nucleus Wash
Bovine Serum Albumin 10٪Sigma-AldrichA1595-50MLST محلول تلطيخ (ST-SB)
محلول كلوريد الكالسيوم ، 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST Staining Buffer (ST-SB)
كلوريد المغنيسيوم ، 1 MSigma-AldrichM1028ST مخزن مؤقت للتلوين (ST-SB)
ماء خال من النوكليز (وليس DEPC معالج)InvitrogenAM9937ST (ST-SB)
محلول كلوريد الصوديوم ، 5MSigma-Aldrich59222CST Staining Buffer (ST-SB) محلول
Trizma Hydrochloride ، 1M ، درجة الحموضة 7.4Sigma-AldrichT2194ST المخزن المؤقت للتلوين (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST (ST-SB)
TotalSeq-A0451 البروتينات المعقدة المضادة للمسام النووية هاشتاج 1 الأجسام المضادةBiolegend682205الهاشتاج الجسم المضاد
TotalSeq-A0452 البروتينات المعقدة للمسام النووية المضادة الهاشتاج 2 الأجسام المضادةBiolegend682207الهاشتاج الجسم المضاد
TotalSeq-A0453 البروتينات المعقدة المسام النووية المضادة الهاشتاج 3 الأجسام المضادةBiolegend682209الهاشتاج الأجسام
المضادةTotalSeq-A0461 البروتينات المعقدة المضادة للنواة الهاشتاج 11 الأجسام المضادةBiolegend682225الأجسام المضادة
TotalSeq-A0462 البروتينات المعقدة المسام النووية المضادة الهاشتاج 12 الأجسام المضادةBiolegend682227الأجسام المضادة Hashtag الجسم المضاد
TotalSeq-A0463 البروتينات المعقدة للمسام النووية الهاشتاج 13 الأجسام المضادةBiolegend682229الهاشتاج الأجسام
المضادةTotalSeq-A0464 البروتينات المعقدة المضادة للمسام النووية هاشتاج 14 الأجسام المضادةBiolegend682231الأجسام المضادة
TotalSeq-A0465 البروتينات المعقدة للمسام النووية المضادة الهاشتاج 15 الأجسام المضادةBiolegend682233الهاشتاج الجسم المضاد
TruStain FcX (الإنساني)Biolegend422302حجب مستقبلات
FC <قوي > والمواد الاستهلاكية < قوي>
لامع ساطع  مقياس الدمMerckZ359629-1EA
جهاز طرد مركزي 5702 / R A-4-38Eppendorf  ؛ EP022629905
تجميد الخلية CoolCell LXCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 مل أنبوب EppendorfEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ملEppendorf30121872
Falcon 35 مم غير معالج TC طبقبتري Corning351008
فالكون 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر10773501
ملقط دومون # 5أدوات العلومالدقيقة 11252-40
مقص ناعم مقوىأدوات العلوم الدقيقة14091-09
  مقلاة ثلج مستطيلة 4 لتر برتقاليةكورنينجCLS432106-1EA
Leica MS5مجهرلايكا
مقص موريا MC50أدوات العلوم الدقيقة15370-50
مقص زنبركي نويزأدوات العلوم الدقيقة15012-12
أوليمبوس CK2 ULWCDأوليمبوسمجهر
P10جيلسونF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
مرشحات الفصل (30 & micro; م)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
حمام مائي يهتزGFL1083
لوحة السيليكونالمطاط BV3530لوحة
تشريح <قوية > البرامج والحزم < / قوي >
خلية الحارسV4.0.0
R برمجةV4.1.1
R سوديوV1.3.1073
سوراتV4.0
tydiverseV1.3.1
<قوي>
B6. Cg-Tg (Wnt1-cre) 2Sor / J ماوسمختبر جاكسونJAX الأسهم # 022501
B6.129 (Cg) -GT (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) ماوس Luo / Jمخزون مختبر جاكسونJAX # 007576
C57BL / 6J الفئرانتشارلز ريفر
<قوي>رمز لتحليل البيانات < قوي>
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE
محلول محلول محلول تلطيخ حل حاوية العلمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Single Nucleus RNA SequencingNucleus IsolationBarcoded AntibodiesMouse Sympathetic GangliaCardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

مقالات ذات صلة