يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63413

⸱

مايو 24, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

تستخدم طريقة التصوير داخل الحيوية الموصوفة هنا الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين والتألق الداخلي من العامل الأيضي المساعد NAD (P) H إلى تقسيم بيئة مجهرية للورم غير المسمى بشكل غير جراحي إلى مقصورات الورم واللحمية والأوعية الدموية لإجراء تحليل متعمق للصور الحيوية 4D.

الملخص

تعد القدرة على تصور التفاعلات الفسيولوجية المعقدة والديناميكية بين العديد من أنواع الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل بيئة دقيقة حية للورم خطوة مهمة نحو فهم الآليات التي تنظم تطور الورم. في حين يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات التصوير داخل الحيوية الحالية ، إلا أنه لا يزال يمثل تحديا بسبب الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة والحاجة إلى السياق المكاني داخل الملاحظة التجريبية. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير سير عمل التصوير داخل الحيوية الذي يجمع بين تصوير الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين ، والتألق الداخلي من العامل المساعد الأيضي NAD (P) H ، والمجهر التصويري الفلوري مدى الحياة (FLIM) كوسيلة لتقسيم البيئة المجهرية للورم بشكل غير جراحي إلى المجالات الأساسية لعش الورم ، والسدى المحيط أو ECM ، والأوعية الدموية. يفصل هذا البروتوكول غير الجراحي العملية خطوة بخطوة التي تتراوح من الحصول على صور الفاصل الزمني لنماذج أورام الثدي إلى تحليل ما بعد المعالجة وتجزئة الصور. الميزة الأساسية لسير العمل هذا هي أنه يستغل التوقيعات الأيضية لوضع البيئة الدقيقة للورم الحي المتغيرة ديناميكيا في سياقها دون استخدام ملصقات الفلورسنت الخارجية ، مما يجعلها مفيدة لنماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض البشري والاستخدام السريري المستقبلي حيث لا يمكن تطبيق الفلوروفورات الخارجية بسهولة.

المقدمة

من المعروف أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) في البيئة الدقيقة للورم يتم ترسيبها ديناميكيا وإعادة تشكيلها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا لزيادة تسهيل تطور المرض1،2،3. توفر تعديلات المصفوفة هذه إشارات ميكانيكية وبيولوجية تغير سلوك الخلية وغالبا ما تؤدي إلى دورة مستمرة من إعادة تشكيل المصفوفة4. غالبا ما يتم إجراء التحقيق في التفاعل الديناميكي المتبادل بين الخلايا السرطانية والمصفوفة خارج الخلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية أو أنظمة الموائع الدقيقة. في حين أظهرت هذه النهج من القاعدة إلى القمة آليات إعادة تشكيل ECM 5,6,7 ، وزيادة الانتشار 8 ، والانتقال الظهاري إلى الوسيط 9,10,11,12 ، وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها 7,13,14,15,16 ، كان تركيزهم في المقام الأول على عدد قليل من أنواع الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا السرطانية أو الخلايا الليفية) ضمن مصفوفة 3D متجانسة مقارنة بتنوع وعدم تجانس التفاعلات الموجودة داخل الأنسجة الفسيولوجية. بالإضافة إلى الأنظمة المخبرية ، يمكن أن يوفر علم أنسجة الأورام خارج الجسم الحي أيضا بعض الأفكار حول تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM17. تتميز الكيمياء النسيجية المناعية بقدرتها على تحليل أنواع متعددة من الخلايا فيما يتعلق بالتكوين والبنية غير المتجانسين مكانيا ل ECM ، لكن نقاط النهاية الثابتة للأنسجة الثابتة لا تلتقط الطبيعة الديناميكية للتفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة. فتح التصوير داخل الحيوية الباب لاستجواب التفاعلات المتنوعة والديناميكية داخل السياق الفسيولوجي للبيئة الدقيقة للورم الأصلي.

قدرات التصوير داخل الورم الحيوي تتقدم بسرعة. وقد مكنت التحسينات في تصميم نوافذ التصوير والتقنيات الجراحية لزرع النوافذ من تصوير الورم الطولي على المدى الطويل في مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية (أي الورم الأولي والغدد الليمفاوية والمواقع النقيلية18،19،20). وعلاوة على ذلك، أصبحت قدرة الأجهزة البصرية على تصور البيانات وجمعها في أبعاد متعددة (أي كثافة التألق الطيفي المكاني ومدى الحياة)، وبدقة وسرعة عاليتين (معدل الفيديو) متاحة على نطاق واسع. توفر التكنولوجيا المحسنة فرصة لاستكشاف التغيرات السريعة في إشارات الخلايا وديناميكيات النمط الظاهري داخل بيئة فسيولوجية. وأخيرا ، فإن التوسع في الأدوات البصرية الجينية ومجموعة واسعة من تركيبات الفلورسنت الجينية تسمح بوضع علامات على أنواع معينة من الخلايا لالتقاط هجرة الخلايا في البيئة الدقيقة للورم أو تتبع سلالة الخلية أثناء التطور أو تطور المرض21,22. يوفر استخدام هذه الأدوات مع تقنية CRISPR / Cas9 للباحثين الفرصة لإنشاء نماذج حيوانية فريدة في الوقت المناسب.

في حين أن كل هذه التطورات تجعل التصوير داخل الحيوية طريقة قوية بشكل متزايد لاستكشاف التفاعلات الخلوية الديناميكية والفسيولوجية ، لا تزال هناك حاجة مهمة لتطوير استراتيجيات توفر سياقا مكانيا وزمنيا وهيكليا على مستوى الأنسجة لهذه التفاعلات البيولوجية. في الوقت الحالي ، تعوض العديد من دراسات التصوير داخل الحيوية عن نقص المعالم البصرية مثل الأوعية الدموية عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في الأوعية الدموية أو استخدام نماذج الفئران التي تعبر خارجيا عن بروتينات الفلورسنت لتحديد السمات الفيزيائية. تستخدم الأصباغ والركائز القابلة للحقن مثل ديكستران الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأوعية الدموية بنجاح في المجموعات الحيوية19 و 23 و 24. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، يتطلب الأمر تلاعبات إضافية بالماوس وتقتصر فائدته على التجارب قصيرة الأجل. بالنسبة للدراسات الطولية ، يمكن أن يكون ديكستران الفلورسنت مشكلة حيث نلاحظ تراكم الدكستران في الخلايا البلعمية أو الانتشار في الأنسجة المحيطة بمرور الوقت25. تم تقديم دمج البروتين الفلوري الخارجي في نموذج الفأر كبديل للديكستران الفلوري ولكنه يمثل قيودا خاصة به. لا يزال توافر وتنوع الفلوروفورات الخارجية داخل نماذج الفئران محدودا ومكلفا لإنشائه. بالإضافة إلى ذلك ، في نماذج محددة ، مثل نماذج PDX ، فإن التلاعب الجيني غير مرغوب فيه أو ممكن. وقد تبين أيضا أن وجود البروتينات الفلورية أو المضيئة الحيوية داخل الخلايا يتم التعرف عليها على أنها غريبة داخل الفأر ، وضمن نماذج الفئران المناعية ، وهذا يقلل من كمية الانبثاث بسبب استجابة الجهاز المناعي المضيف26,27. وأخيرا، غالبا ما تحتل البروتينات الفلورية الخارجية أو الأصباغ الفلورية المستخدمة في السياق المكاني أو لتقسيم البيانات اللاحقة نطاقات أولية من الطيف الضوئي يمكن استخدامها بطريقة أخرى للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية ذات الاهتمام.

يمثل استخدام الإشارة الجوهرية من ECM أو التألق الداخلي من الخلايا داخل الأنسجة وسيلة عالمية محتملة خالية من الملصقات لتقسيم البيانات داخل الحيوية لإجراء تحليل خلوي ومكاني أكثر تعمقا. لطالما استخدم الجيل التوافقي الثاني (SHG) لتصور ECM28. مع التطوير اللاحق لأدوات مهمة للمساعدة في توصيف تنظيم الألياف29،30،31 ، من الممكن توصيف سلوك الخلية بالنسبة لبنية ECM المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التألق الذاتي من المستقلب الداخلي ، NAD (P) H ، أداة أخرى خالية من الملصقات لتقسيم البيئة الدقيقة للورم في الجسم الحي. يتألق NAD(P)H بشكل مشرق في الخلايا السرطانية ويمكن استخدامه للتمييز بين حدود عش الورم المتنامي من السدى المحيط به21,32. وأخيرا ، فإن الأوعية الدموية هي بنية فسيولوجية مهمة في البيئة الدقيقة للورم وموقع التفاعلات الرئيسية الخاصة بنوع الخلية 33،34،35. تم استخدام إثارة خلايا الدم الحمراء (RBC) أو بلازما الدم لتصور الأوعية الدموية للورم ، وباستخدام إثارة اثنين أو ثلاثة فوتونات (2P ؛ 3P) ، تبين أن قياس معدلات تدفق الدم ممكن36. ومع ذلك ، في حين أن الأوعية الدموية الأكبر يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال توقيعات التألق الداخلية الخاصة بها ، فإن تحديد الأوعية الدموية الصغيرة الدقيقة والمتغيرة والأقل فلورسنت يتطلب المزيد من الخبرة. هذه الصعوبات المتأصلة تعيق تجزئة الصورة المثلى. لحسن الحظ ، يمكن أيضا قياس مصادر التألق الداخلي (أي خلايا الدم الحمراء وبلازما الدم) عن طريق التصوير الفلوري مدى الحياة37 ، والذي يستفيد من الخصائص الفيزيائية الضوئية الفريدة للأوعية الدموية ويمثل إضافة مفيدة إلى صندوق الأدوات المتنامي داخل الحيوية.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير عمل لتجزئة التصوير داخل الحيوية رباعي الأبعاد (4D) بشكل صريح باستخدام إشارات جوهرية مثل التألق الداخلي و SHG من الاستحواذ إلى التحليل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات الطولية من خلال نافذة تصوير الثدييات حيث قد لا يكون التألق الخارجي عمليا أو ممكنا ، كما هو الحال مع نماذج PDX. ومع ذلك ، فإن مبادئ التجزئة الموضحة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على المستخدمين داخل المناطق الحيوية الذين يحققون في بيولوجيا الورم أو تطور الأنسجة أو حتى فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية. ستسمح مجموعة أساليب التحليل المبلغ عنها للمستخدمين بالتمييز بين السلوك الخلوي بين مناطق تكوينات ألياف الكولاجين المحاذاة أو العشوائية ، ومقارنة أعداد أو سلوكيات الخلايا الموجودة في مناطق محددة من البيئة الدقيقة للورم ، وتعيين الأوعية الدموية إلى البيئة الدقيقة للورم باستخدام إشارة خالية من الملصقات أو جوهرية فقط. معا ، تخلق هذه الأساليب إطارا تشغيليا لزيادة عمق المعلومات المكتسبة من التصوير الحيوي 4D للغدة الثديية مع تقليل الحاجة إلى ملصقات خارجية إضافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ويسكونسن ماديسون. الرفاه وإدارة الألم في جميع التجارب على الحيوانات أمر بالغ الأهمية. وبالتالي ، يتم بذل كل جهد ممكن للتأكد من أن الحيوان مريح ويحظى برعاية جيدة في كل خطوة من خطوات الإجراء.

1. توليد نافذة التصوير الثديي (MIW)

  1. لبناء نافذة التصوير الثديي ، قم بتصنيع حلقة 14 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ من الدرجة الجراحية.
  2. نظف إطار النافذة المصنوع آليا باستخدام محلول ساخن من منظف تنظيف بنسبة 5٪ ، واشطفه لمدة 10 دقائق تحت الماء منزوع الأيونات (DI) ، وانقع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، ثم جففه تحت مصباح حراري. قم بتعقيم إطار MIW المجفف وقم بتخزينه للاستخدام لاحقا.
  3. قم بإعداد زجاج غطاء MIW على النحو التالي: انقع زجاج الغطاء الدائري رقم 1.5 12 مم في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، وجففه تحت مصباح حراري ، ثم قم بتأمينه على إطار MIW المعدني باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate. علاج المادة اللاصقة بين عشية وضحاها.
  4. نظف MIW المجمع من المادة اللاصقة الزائدة باستخدام قطعة منقوعة من الأسيتون ، وقم بتنظيفها عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. اترك النافذة التي تم تنظيفها حتى تجف. تحضير MIW مقدما وتخزينه في طبق بتري معقم قبل الزرع الجراحي.

2. الزرع الجراحي ل MIW

  1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية وتعقيم الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل البدء في الجراحة لزرع النافذة.
  2. قم بإجراء عملية جراحية على سطح طاولة معقم باستخدام بطانية تدفئة مغطاة بحقل معقم. اضبط بطانية الاحترار بحيث تكون درجة الحرارة المقاسة أعلى الحقل المعقم 40 درجة مئوية.
  3. استخدم الإضاءة الباردة الإضافية للمساعدة في منع تجفيف الأنسجة. استخدم النظارات المكبرة لتسهيل العملية الجراحية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية التي تتكون من معطف مختبر معقم يستخدم مرة واحدة ، والأكمام الجراحية ، والقفازات ، وحماية العين ، وقناع الوجه على النحو الموصى به من قبل أفضل الممارسات الجراحية.
  4. تخدير الماوس باستخدام آلة تبخير التخدير مع إعداد الايزوفلوران من 2.0٪ ومعدل تدفق الأكسجين من 2.0 لتر / دقيقة. إدارة مسكن (10 مغ / كغ ميلوكسيكام) عن طريق الحقن تحت الجلد.
    ملاحظة: تقديم جرعات إضافية خلال أول 24 ساعة، ويفضل كل 8-12 ساعة لأول يومين بعد الجراحة.
  5. بمجرد تخديره (تأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم) ، ضع جل العين المرطب لمنع جفاف العينين. استخدم كريم مزيل الشعر لإزالة الفراء في موقع الجراحة (الغدة الثدييةالإربية 4) متبوعا بالشطف بشاش معقم منقوع بالماء.
  6. قم بإعداد الموقع الجراحي المزيل للشعر للجراحة عن طريق تعقيم سطح الجلد باستخدام 3 مقشرات بيتادين وإيثانول بالتناوب.
  7. لبدء الجراحة ، ارفع الجلد بلطف فوق الغدة الثديية الرابعة رقم 4 باستخدام الملقط. بمجرد سحب الجلد بعيدا عن جدار الجسم ، قم بإزالة قسم ~ 1 مم من الطبقة الجلدية عند طرف الملقط باستخدام مقص دقيق جراحي. في حالة حدوث نزيف ، ضع ضغطا لطيفا بشاش معقم حتى يتوقف النزيف.
    ملاحظة: بشكل عام، الأورام الكبيرة لديها قدرة أكبر على النزيف من الأورام الأصغر أو الأنسجة الطبيعية.
  8. افصل الغدة الثديية عن الطبقة الجلدية بحركات لطيفة للملقط عند الفتحة الجراحية لتجنب قطع الغدة الأساسية.
  9. قم بإنشاء شق 10 مم وحرر الغدة الثديية من الطبقة الجلدية في المحيط بحيث يمكن وضع الغرز دون اختراق الغدة الثديية. أضف PBS لتغطية الغدة / الورم المكشوف ومنع التجفيف.
  10. قم بإنشاء خيط خيط محفظة على طول محيط الفتحة باستخدام خياطة مضفرة بالحرير 5-0. أدخل حافة MIW بحيث تتفاعل الطبقة الجلدية مع الشق المتلقي ل MIW.
  11. قم بتمديد الظهارة بلطف على الجانب الآخر من MIW وادفع MIW المعدني إلى مكانه بحيث تقوم الطبقة الجلدية بإشراك الشق المتلقي بالكامل حول محيط MIW بأكمله. قم بربط سلسلة المحفظة بإحكام لسحب الطبقة الجلدية إلى الشق وربطها لتأمين MIW بالكامل.
  12. أضف مضادا حيويا موضعيا إلى الطبقة الجلدية في MIW ، وراقب الماوس باستمرار حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. ضع الفأر المزروع في MIW بشكل منفصل على فراش ناعم مع وضع كوخ صغير في القفص ، واسمح للفأر بالتعافي لمدة 48 ساعة قبل التصوير.

3. تحديد المواقع والحفاظ على الماوس على مرحلة المجهر للتصوير

  1. قم بإعداد غرفة التدفئة على مسرح المجهر. استخدم نظام الهواء القسري مضبوطا على 30 درجة مئوية أو أي نظام آخر مماثل. استخدم سخان موضوعي لتجنب الانجراف في التركيز البؤري z. اسمح للنظام بالوصول إلى التوازن لمدة 1 ساعة على الأقل قبل التصوير.
    ملاحظة: الفئران المخردة غير قادرة على الحفاظ على درجة حرارة جسمها بشكل صحيح ، وبالتالي ، من الضروري أن يكون لديك بيئة ساخنة لأي عمليات اكتساب بفاصل زمني . يساعد السخان الموضوعي على مكافحة آثار التمدد الحراري ، وهي ظاهرة تسبب الانجراف في التركيز البؤري z حيث تصل العدسة الموضوعية والأنسجة التي يتم تصويرها إلى التوازن الحراري.
  2. بمجرد استقرار غرفة التسخين على المجهر عند 30 درجة مئوية ، قم بتخدير الماوس المتلقي باستخدام إعدادات آلة التخدير بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران ومعدل تدفق الأكسجين من 2 لتر / دقيقة.
  3. بعد تخدير الماوس (مؤكدا عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم) ، قم بتنظيف الجزء الخارجي من زجاج MIW باستخدام قضيب قطني ومنظف زجاجي ، وأضف مرهم العين لمنع التجفيف ، وأدخل قسطرة وريد الذيل إذا لزم الأمر.
  4. للحفاظ على الترطيب المناسب ، قم بإعطاء حقنة أولية من 0.5 مل PBS تحت الجلد أو 100 ميكرولتر من خلال قسطرة الوريد الذيلي. كرر كل 2 ساعة طوال مدة جلسة التصوير.
  5. بمجرد إعداد الماوس بشكل صحيح ، قم بإعداد المجهر للتصوير. لتقليل التبخر أثناء قياسات الفاصل الزمني، استخدم هلام مائي بدلا من الماء لوسائط الغمر. يجب أن يتم ذلك قبل وضع الماوس على المسرح. يرجى الاطلاع على جدول المواد للحصول على تفاصيل المكونات البصرية.
  6. ضع الماوس على مرحلة المجهر ، وقم بتركيب خرطوم الأيزوفلوران واضغط على طوق MIW في فتحة استقبال 14 مم في إدراج المرحلة لتحقيق الاستقرار في الصور. ضع مجال التصوير في بؤرة التركيز باستخدام مناظير المجهر واستخدم إضاءة الحقل الساطع لمراقبة الأوعية الدموية مع تدفق الدم.
  7. تحقق من استقرار مجال الرؤية. في حالة وجود قطع أثرية لحركة التنفس ، ضع ضغطا لطيفا على الجانب الخلفي من الغدة باستخدام كتلة رغوة صغيرة وقطعة تشبه السينكريتور من الشريط اللاصق. بعد تطبيق الضغط، تحقق من الحفاظ على تدفق الدم في جميع أنحاء مجال الرؤية.
  8. اضبط مستويات الأيزوفلوران بشكل دوري بزيادات بنسبة 0.25٪ أثناء جلسة التصوير للحفاظ على مستوى مناسب من التخدير عن طريق حساب التنفس الحيواني يدويا.
  9. الحفاظ على معدل 36-40 تنفس في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لتحسين طول عمر الحيوان والتصوير البصري. يمكن أن تؤدي معدلات التنفس المنخفضة إلى عدم نجاة الماوس من التجربة ، في حين أن معدلات التنفس التي تزيد عن 60 دورة في الدقيقة قد تؤدي إلى ضعف التخدير ، مما قد يزيد من التنفس والحركة في بيانات الصورة.

4. إعداد للتصوير داخل الحيوية 4D ، القائم على الكثافة ، الخالي من الملصقات لسلوك الخلية الديناميكي

  1. بمجرد تخدير الماوس ووضعه بشكل آمن على مرحلة المجهر المقلوب ، ابدأ في تحديد المناطق ذات الاهتمام.
  2. باستخدام مصدر ضوء موجه إلى MIW ، استخدم مناظير المجهر لتحديد المناطق المحتملة للتحقيق. أضف واحفظ مواضع x و y في البرنامج للعودة إلى هذه المواضع.
    ملاحظة: لن تكون التفاصيل الدقيقة للورم مرئية بسهولة مع هذا النوع من الإضاءة. والهدف ببساطة هو تحديد المناطق لإجراء مزيد من التحقيقات. ينصب التركيز على رؤية الأوعية الدموية وتدفق الدم.
  3. بعد حفظ عدة مواضع في البرنامج ، قم بمعاينة مجالات العرض المختارة باستخدام إثارة 890 نانومتر ومكعب مرشح FAD / SHG. استخدم الحد الأقصى لوقت الإقامة البالغ 4 ميكروثانية مع طاقة أقل وإعداد PMT مرتفع. الهدف هو معاينة مجالات الرؤية دون تعريض الأنسجة لضوء الليزر المفرط.
  4. بمجرد تعيين مستويات الطاقة المناسبة، قم بإعداد مكدسات z. لاحظ ظهور ألياف الكولاجين الوفيرة (SHG) عند 20-50 ميكرومتر تحت السطح الزجاجي ل MIW. سيصبح الكولاجين أقل انتشارا حيث ينقسم المجهر أعمق في الورم (الشكل 1B). تكشف الفراغات في SHG عن موقع كتل الورم.
  5. اضبط شريحة z العلوية ، أسفل طبقة الخلايا الانفرادية حيث تظهر ألياف الكولاجين الأولى عند ~ 50-100 ميكرومتر. اضبط شريحة z السفلية على ~ 250 ميكرومتر ، حيث تتلاشى الألياف وتهيمن الإشارة الضعيفة. كرر ذلك لجميع مواضع x-y المحفوظة.
  6. بمجرد تعيين نطاق z-stack ، قم بزيادة وقت الإقامة (حتى 8 ميكروثانية) وتحسين إعدادات الطاقة والكاشف. قم بتحسين مستويات الطاقة حسب الحاجة لإثارة الأنسجة لكل تجربة. استخدام قوى تصل إلى 90 ميجاوات عند 750 نانومتر أو 70 ميجاوات عند 890 نانومتر عند الفتحة الخلفية للهدف ضمن نطاق مقبول.
    ملاحظة: سيؤثر عمق التصوير ومقدار التشتت داخل الأنسجة والخصائص الموضوعية وحساسية الكاشف بشكل كبير على مقدار الطاقة اللازمة للحصول على صورة.
  7. اضبط الفترات الزمنية وفقا للأهداف التجريبية. ابدأ بفترات زمنية مدتها 10 دقائق بين نقاط التجميع لمعظم أفلام الهجرة داخل المناطق الحيوية.
  8. على الرغم من أن الإثارة 2P لطيفة على الخلايا والأنسجة ، كن مدركا لعلامات السمية الضوئية ، مثل تبييض الخلايا أو التألق الذاتي المتزايد بسرعة ، والتبييض الضوئي المفرط. قلل من طاقة الليزر أو قم بزيادة فترات الفاصل الزمني كما تشير الظروف.

5. التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) من NAD (P) H

  1. مع الحفاظ على مواضع x-y من عمليات الاستحواذ على الفاصل الزمني ، قم بإعداد المجهر لجمع مكدس FLIM. أدخل مرشحا 440/80 في حامل مرشح أمام كاشف GaAsP ، واضبط جهد كاشف GaAsP على 800 في البرنامج. أطفئ أضواء الغرفة عندما تكون أجهزة الكشف قيد التشغيل.
  2. في البرنامج ، قم بالتبديل من تصوير الكثافة المستند إلى الجلفانومتر إلى وضع تصوير FLIM.
  3. لغرض تحديد الأوعية الدموية وإخفائها، اضبط الدقة على 512 × 512 بكسل. لجمع معلومات التمثيل الغذائي التكميلية، اضبط الدقة على 256 × 256 بكسل لزيادة الدقة الزمنية للتوقيع مدى الحياة. اضبط وقت الإقامة على 4 ميكروثانية واضبط الليزر على 750 نانومتر.
  4. ابدأ معاينة المسح الضوئي وابدأ في ضبط طاقة الليزر. اضبط طاقة الليزر حتى تكون قراءة أداة تمييز الكسر الثابت (CFD) بين 1 × 105 و 1 × 106. لا تتجاوز 1 × 106 لأن هذا سيؤدي إلى تراكم الفوتون والنتائج الإجمالية السيئة.
  5. بمجرد تعيين مستوى الطاقة ، اضبط وقت التكامل بين 90 ثانية و 120 ثانية وابدأ مجموعة FLIM. سوف يكتسب الفوتونات من مجال الرؤية للوقت المخصص.
  6. اختياري: بعد إجراء جميع المجموعات اللازمة وإزالة الماوس من المسرح ، قم بجمع وظيفة استجابة الأداة (IRF). قم بقياس IRF عن طريق تصوير سطح بلورات اليوريا المتاحة تجاريا في طبق زجاجي القاع بنفس المعلمات وإعداده المستخدم لتصوير الأنسجة.
    ملاحظة: حسابات IRF لأي تأخير أو انعكاسات بسبب الإعداد الإلكتروني أو البصري. يتم تعقيد IRF في جميع عمليات الاستحواذ على FLIM ، ويمكن أن يؤدي فك ارتباطه بالبيانات إلى تحسين دقة منحنيات اضمحلال التألق المحسوبة. مع ذلك ، يمكن ل IRFs المحسوبة في كثير من الأحيان تكرار جودة منحنيات الاضمحلال الفلورية بشكل معقول من IRF المقاسة. من الممارسات الجيدة قياس IRF حتى يتم تحديد أن IRF المحسوب سينتج عنه نوبات مكافئة من منحنيات الاضمحلال ويقارب بشكل كاف النتائج من IRF المقاسة.

6. تحليل صور NADH مدى الحياة

  1. افتح برنامج FLIM واستورد صورة عمر NAD(P)H من مجموعة البيانات. لمزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام البرنامج بشكل صحيح ، يرجى الرجوع إلى كتيبات عمر الفلورسنت (انظر جدول المواد).
  2. للبدء ، حدد معلمات النموذج في البرنامج. في شريط القوائم، انقر فوق خيارات > النموذج. حدد المربعات التالية: الإعدادات > الاضمحلال متعدد الأس، وطريقة الملاءمة > MLE، ومربع > الربط المكاني، وذروة > العتبة، وحدد إصلاح التحول قبل حساب الصورة.
  3. في شريط القوائم، انقر فوق اللون > A1٪ من القائمة المنسدلة. على الجانب الأيمن من النافذة ، حدده على أنه مناسب من ثلاثة مكونات. اضبط حجم سلة المهملات > 3.
  4. اضبط > العتبة ~ 10. أعد تقييم دقة العتبة بعد حساب مصفوفة الاضمحلال لأول مرة.
  5. إصلاح τ1 إلى 200 ps. هذا يمثل العمر القصير لخلايا الدم الحمراء. حاول العثور على القيمة التي تتطابق بشكل أفضل مع بقع متعددة في الأوعية الدموية الأكبر ، والتي يمكن رؤيتها في صورة الكثافة. إصلاح τ2 إلى 1200 ps. هذا يمثل العمر الطويل لخلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: القيم المحددة هي مجرد نقطة بداية. ستحتاج القيم إلى تحسينها لإبراز الأوعية الدموية أكثر. في معظم الحالات ، ولكن ليس دائما ، ستنخفض هذه القيم.
  6. ضمن حساب في شريط القائمة، حدد مصفوفة الاضمحلال. سيؤدي ذلك إلى توليد صور أولية لمدة1٪ مع وجود قيم عالية للأوعية الدموية. استخدم المؤشر (الشعيرات المتقاطعة) للتمرير فوق الأوعية الدموية. بشكل منهجي وواحد في كل مرة ، قم بتعويم ( قم بإلغاء تحديد مربع الإصلاح) τ1 و τ2. سجل هذه القيم لأنها ستساعد في تحسين المعلمات الثابتة.
    ملاحظة: الهدف ليس بالضرورة الحصول على القيم الأكثر دقة في الصورة ، ولكن بالأحرى زيادة التفاوت بين الأوعية الدموية والأنسجة إلى أقصى حد دون تقليل المساحة المحددة على أنها الأوعية الدموية بشكل كبير.
  7. بمجرد تحديد المعلمات المناسبة ل τ1 و τ2 ، في شريط القوائم ، حدد حساب > معالجة الدفعات. تأكد من أن معظم الإعدادات متشابهة بين شرائح z.
  8. تأكد من التحقق من عدم وجود إعداد واحد مختلف تماما عن الآخرين. إذا كان الأمر كذلك، فاضبط التحول أولا وحاول مرة أخرى. إذا استمرت المشكلة، فقم بالرفض باستخدام معلمات جديدة. يمكن أن يكون التحول غير الصحيح سببا كبيرا للضوضاء في النوبات ويمكن أن يزيد من قيم A1٪ في مناطق الورم المجاورة.
  9. في علامة تبويب القائمة، احفظ الملفات ثم قم بتصدير ملفاتA 1٪. قم بتحميل هذه الملفات في ImageJ للإخفاء والتجزئة.

7. تجزئة صورة الأوعية الدموية

  1. افتح ImageJ وقم باستيراد صورة A1٪ كصورة نصية. كرر ذلك لجميع الصور داخل المكدس.
  2. مع فتح جميع الصور A1٪، حدد Image > Stack > Z-Project. استخدم عرض الكثافة القصوى واحفظ الصور. راجع البيانات التكميلية 1 للحصول على صورة تمثيلية.
  3. انتقل إلى المكونات الإضافية > التجزئة. حدد المكون الإضافي لتجزئة WEKA القابل للتدريب 38.
  4. بمجرد فتح نافذة WEKA ، استخدم الإعدادات الافتراضية وابدأ في تدريب البرنامج عن طريق إنشاء فئتين وخطوط تتبع فوق الأوعية الدموية (مناطق A 1٪ عالية) وغير الأوعية الدموية (مناطق منخفضة A1٪).
  5. استمر في إضافة آثار جديدة إلى الفئتين حتى يحدد البرنامج باستمرار المناطق العالية A1٪ من الأوعية الدموية مع القضاء على أي مناطق أعلى من ضوضاء الخلفية. انظر النموذج التكميلي للاطلاع على نموذج المصنف التمثيلي.
  6. بمجرد إنتاج الصورة المصنفة ، انقر فوق Image > Type > 8 Bit. عتبة الصورة وإنشاء قناع. إذا كانت الصورة المتقاربة لا تزال بحاجة إلى مزيد من التنظيف، فاستخدم وظيفة تحليل الجسيمات .
  7. اضبط الحجم والدائرية حتى يتم استبعاد أي مناطق أصغر ودائرية من الصورة العتبية. يتم الحصول على قناع نظيف مع الأوعية الدموية فقط وخلفية قليلة جدا.
  8. انقر فوق تحرير > التحديد > إنشاء تحديد. انقل التحديد إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار.
  9. تكرار الصورة المصنفة. انتقل إلى معالجة > ثنائي. لتوسيع القناع وتحديد المسافة من الأوعية الدموية التي سيتم تضمينها في تجزئة الصورة، حدد توسيع. كرر ذلك حتى يتوسع القناع إلى النطاق المطلوب. سجل منطقة الاهتمام هذه (ROI) في مدير عائد الاستثمار.
    ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تحديد كمية أو سلوك داخل مكان معين من الأوعية الدموية (على سبيل المثال، عدد الخلايا الموجودة داخل X ميكرومتر من الأوعية الدموية). يتم تحديد مقدار التمدد المطلوب بالكامل من خلال السؤال العلمي.
  10. لتحديد عدد الخلايا داخل المناطق المقيدة، حدد النافذة (صورة/قناة) ذات أهمية. يمكن أن يكون هذا أي نافذة تشترك في نفس مجال الرؤية مثل قناع الأوعية الدموية. قم بتطبيق كل من عائد الاستثمار باستخدام وظيفة XOR من القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: ستقوم هذه العملية بقياس العناصر ضمن المسافة المطلوبة من الأوعية الدموية ، باستثناء الأوعية الدموية نفسها. يمكن بعد ذلك استخدام نهج عائد الاستثمار المشترك هذا لقياس العديد من المعلمات ، مثل الكثافة أو رقم الخلية أو الترحيل.

8. تجزئة صورة عش الورم

  1. افتح صورة NADH إما من مسح ضوئي عالي الدقة أو مجموعة FLIM في ImageJ.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك على شرائح z الفردية أو المكدسات الكاملة أو تطبيقه على إسقاطات z لبضع شرائح.
  2. انتقل إلى المكونات الإضافية > التجزئة. حدد المكون الإضافي لتجزئة WEKA القابل للتدريب.
  3. بمجرد فتح نافذة WEKA ، استخدم الإعدادات الافتراضية وابدأ في تدريب البرنامج في فئتين من المناطق العالية NADH والمناطق المنخفضة NADH. سيكون للمناطق العالية من NADH نمط ملحوظ جدا من الخلايا ذات النوى وسيتعرف البرنامج عليها بسهولة.
  4. استمر في التبديل ذهابا وإيابا مع التراكب لتحسين الخوارزمية بتدريب إضافي حتى تتعرف على جميع مناطق الورم كما تحددها العين والمعرفة المسبقة بمورفولوجيا الورم. هذه عملية تكرارية.
  5. بمجرد أن تتعرف الخوارزمية على جميع مناطق الورم ، حدد الزر إنشاء نتيجة . سيؤدي ذلك إلى إنتاج صورة جديدة. كرر هذه الصورة.
  6. حدد أول صورة مكررة وقم بتحويلها إلى صورة 8 بت عن طريق تحديد صورة > نوع > 8 بت. عتبة هذه الصورة لإنشاء قناع ثنائي. ثم قم بإنشاء تحديد ونقله إلى مدير عائد الاستثمار. ستحدد عائد الاستثمار هذا السدى.
  7. حدد الثانية من الصورة المكررة وقم بتحويلها إلى صورة 8 بت. عكس هذه الصورة عن طريق تحديد صورة > تحرير > عكس، ثم قم بتحديد هذه الصورة لإنشاء قناع ثنائي. مرة أخرى إنشاء تحديد ونقله إلى مدير عائد الاستثمار. سيحدد عائد الاستثمار هذا عش الورم.

9. تجزئة الصورة حسب تنظيم الألياف أو محاذاتها

  1. للبدء ، افتح صور SHG ، وقم بإعداد أي إسقاط z ، وقم بتقييم الحاجة إلى أي معالجة مسبقة. للحصول على نتائج جيدة، يلزم الحصول على صور عالية الجودة مع ألياف يمكن تمييزها وضوضاء منخفضة.
  2. اختياري: للمعالجة المسبقة في ImageJ لزيادة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) لقناة SHG، اطرح الخلفية باستخدام طرح الكرة المتدحرجة. بالنسبة لمعظم التطبيقات، استخدم طرح الكرة المتدحرجة بين 20 بكسل و50 بكسل. ثم قم بتنعيم الصورة وحفظها.
  3. افتح المكون الإضافي OrientationJ وقم بتعيين معلمات المعالجة. في نافذة OrientationJ، حدد حجم نافذة الموتر المحلي. للحصول على صورة 20x لكثافة الألياف هذه، اضبط 10 بكسل على 15 بكسل كنقطة بداية.
  4. حدد Cubic Spline كنموذج تدرج وحدد مربع مسح اللون. تعريف مسح الألوان. قم بتعيين كل من الصبغة والتشبع كتماسك ، ثم حدد السطوع كصورة أصلية ، اضغط على تشغيل.
  5. ملف الإخراج الخاص بالمكون الإضافي هو خريطة ألوان RGB. اضبط قيمة نافذة الموتر المحلية حتى يتم تمييز المناطق المحاذاة ، كما تحددها العين ، بشكل صحيح بألوان زرقاء وأرجوانية.
  6. بمجرد أن تصبح صورة الإخراج مرضية ، افصل صورة RGB هذه إلى 3 قنوات. حدد صورة > لون > قناة مقسمة.
  7. لتحسين مظهر المناطق المحاذاة لغرض الإخفاء، استخدم حاسبة الصور عن طريق تحديد عملية > حاسبة الصور. باستخدام عامل التشغيل هذا، اطرح الصورة الخضراء من الصورة الزرقاء. للحصول على قناع أكثر تقييدا، اطرح الصورة الخضراء من الصورة الحمراء. بالنسبة للمناطق العشوائية، اطرح القناة الزرقاء من القناة الخضراء.
  8. عتبة الصورة الناتجة باستخدام خوارزمية اللحظات . في معظم الحالات ، لا ينبغي أن يحتاج هذا إلى مزيد من التعديلات. ومع ذلك ، اضبط إذا لزم الأمر. سيؤدي ذلك إلى إنتاج صورة ثنائية.
  9. بمجرد إنشاء الصورة الثنائية ، املأ الثقوب عن طريق تحديد Process > Binary > Fill Holes بين الألياف وتقريب حدود القناع باستخدام مرشح وسيط. مرشح متوسط من 10 هو نقطة انطلاق جيدة ، قم بضبطه لجعل البيانات مناسبة تماما. افحص القناع يدويا بحثا عن اتفاق وقم بإزالة أي عائد استثمار خاطئ.
  10. بمجرد أن يصبح القناع مرضيا، قم بإنشاء تحديد عن طريق تحديد تحرير > > إنشاء تحديد. نقل هذا التحديد إلى مدير عائد الاستثمار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تركيب MIW والتخطيط التجريبي الأساسي هي الخطوات الأولى في هذه العملية. هذا التصميم والبروتوكول الخاص ب MIW أكثر قابلية للدراسات الطولية19 وقد تم استخدامه بنجاح مع كل من المجاهر المستقيمة والمقلوبة. في هذه الحالة ، تم استخدام المجهر المقلوب لأنه أدى إلى استقرار صورة أكبر للغدة الثديية مع عدد أقل من القطع الأثرية التي تتنفس. في الشكل 1A ، نقدم أبعاد MIW الصلبة ونظرة عامة رسومية لعملية الزرع.

مجال الرؤية النموذجي داخل ورم الثدي MMTV-PyMT

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التصوير داخل الحيوية 4D هو أداة قوية للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية الديناميكية داخل السياق المكاني والزمني للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. توفر هذه المخطوطة إطارا تشغيليا أساسيا وقابلا للتكيف لتقسيم تفاعلات الخلايا الديناميكية داخل كتلة الورم أو السدى المجاورة أو على مقربة من شبكة الأوعية الدموية باستخدام إشارات داخلية فقط من الجيل التوافقي الثاني أو التألق الذاتي NAD(P)H. يوفر هذا البروتوكول طريقة شاملة خطوة بخطوة من زرع نافذة التصوير إلى الحصول على الصور وتحليلها وتقسيمها. نعتقد أن هذه التقنية ستساهم في إطار التحليل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن ينوه بمنح NCI R01 CA216248 و CA206458 و CA179556 لتمويل هذا العمل. نود أيضا أن نشيد بالدكتور كيفن إليسيري ومجموعة التصوير الخاصة به على خبرتهم التقنية في التطوير المبكر لبرنامجنا الحيوي. كما نشكر الدكتور بن كوكس والأعضاء الآخرين في مجموعة Eliceiri Fabrication Group في معهد Morgridge للأبحاث على تصميمهم التقني الأساسي خلال المراحل المبكرة من MIW. ساعدت الدكتورة إلين دوبسون في إجراء محادثات مفيدة حول أداة تجزئة WEKA القابلة للتدريب على ImageJ. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكتورة ميليسا سكالا والدكتورة أليكسا باريس هيتون على استخدام المجهر في الوقت المناسب. وأخيرا، نود أن نشكر الدكتورة بريجيت رابي، D.V.M، على جميع المناقشات المدروسة والنصائح حول التعامل مع الماوس والعناية به.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 1.5 زجاج غطاء دائري 12 ممWarner Instruments# 64-0712MIW البناء
حقنة 1.0 مل لحقن SQحقنة BD309659
20x الهدفZeiss421452-988غمر الماء
إبرة 27G لحقن SQإبرةCovidien1188827012
40x الهدفنيكونMRD77410الغمر في الماء
5-0 خياطة مضفرة منالحرير خياطة EthiconK870لزرع MIW
جل الدموع الاصطناعيةAkornNDC 59399-162-35بيتادين جل
العين ، 5٪جراحة فيشر العلميةNC1558063مطهر
من القطنفيشر Scientific23-400-101
لاصق سيانواكريليتLoctite1365882MIW بناء
دكسترين الفلورسنتSigmaT1287-50mgالملصقات الوريدية
لملقطالدموية Mckesson.comMiltex   # 18-782غير القابل للصدأ ، 4 بوصة ،
أنبوب المضاعف الضوئي GaAsPالمنحني Hamamatsu   ؛
بطانية التدفئةCARA 72 وسادة التدفئة  038056000729قابلة للاختيار في درجة الحرارة
منزلية بنيت
كتيب الفلورسنت مدى الحياةبيكر وهيكلhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
قاعدة مجهر مقلوبنيكون
إيزوفلورانأكورنNDC 59399-106-01التخدير
Liqui-NoxFisher علمي16-000-125MIW تنظيف
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10مسكن
Micro HoseScientific Commodities INC.  رأس مسح ضوئي متعدد الفوتون BB31695-PE / 1
Bruker Ultima IIMultiphoton ومنصة التصوير
مرشح NADH FLIMChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826كريم مزيل الشعر
سخان موضوعيTokai HitSTRG-WELSX-SET
SHG / FAD FILTERChroma320740ET450 / منظف الزجاج اللامع 40m-2P
منظف زجاجB00814ME24 Amazon.comللوحة
عد الفوتون MIW SPC-150المزروعة بيكر وهيكل
ضوء جراحيFAJB06XV1VQVZضوء معقوفة LED مغناطيسي
مقص جراحيدقيق Excelta366غير القابل للصدأ ، 3 بوصة
مرهم مضاد حيوي ثلاثيActavis فارماNDC 0472-0179-34
قسطرة تلفزيونإبرة BD30G مخصصة:قسطرة 305106 لحقن التلفزيون
اثنين من فلتر الفوتونChroma320282ET585 / 65m-2P
ليزر ثنائي الفوتونمتماسك charmeleonبالليزر متعدد الفوتون قابل للضبط
ParkerPKR-03-02جل الغمر في الماء
اليوريا بلوراتSigmaU5128-5Gاختياري: FLIM IRF
محلول قضيب الأوعية غرفة تسخين مضاد حيوي جل الموجات فوق الصوتية

المراجع

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120(2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173(2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490(2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715(2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007(2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125(2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086(2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787(2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850(2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171(2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

NADPH
نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.