مقالة منهجية

الإنتاج الآلي على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون كروية للطباعة الحيوية 3D

2.5K مشاهدات

DOI:

10.3791/63430

مارس 31, 2022

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف الإنتاج على نطاق واسع من الكرويات اللحمية / الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASC) باستخدام نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل الكروية. يمكن استخدام هذه الكروية ASC ككتل بناء لنهج الطباعة الحيوية 3D.

الملخص

الخلايا اللحمية / الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد المعترف بها كمصدر كلاسيكي للخلايا اللحمية / الجذعية الوسيطة. تم نشر العديد من الدراسات مع ASCs لنهج هندسة الأنسجة القائمة على السقالات ، والتي استكشفت بشكل رئيسي سلوك هذه الخلايا بعد بذرها على السقالات النشطة بيولوجيا. ومع ذلك ، تظهر مناهج خالية من السقالات لهندسة الأنسجة في المختبر وفي الجسم الحي ، وذلك أساسا باستخدام الكرويات ، للتغلب على قيود النهج القائمة على السقالات.

الكروية هي الأنسجة الدقيقة 3D التي شكلتها عملية التجميع الذاتي. يمكنهم محاكاة البنية والبيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل أفضل ، ويرجع ذلك أساسا إلى تكبير تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى خارج الخلية. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الكرويات بشكل رئيسي كنماذج للأمراض ، ودراسات فحص الأدوية ، ولبنات البناء للطباعة الحيوية 3D. ومع ذلك ، بالنسبة لنهج الطباعة الحيوية 3D ، فإن العديد من الكرويات ، المتجانسة في الحجم والشكل ، ضرورية للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة والأعضاء المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إنتاج الكرويات تلقائيا ، هناك فرصة ضئيلة للتلوث الميكروبيولوجي ، مما يزيد من قابلية تكرار الطريقة.

يعتبر الإنتاج الواسع النطاق للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل لبناء الأنسجة في المفاعلات الحيوية. ومع ذلك ، فإن عدد الدراسات التي استكشفت إنتاج ASC الكروي على نطاق واسع لا يزال نادرا ، إلى جانب عدد الدراسات التي استخدمت كرويات ASC ككتل بناء للطباعة الحيوية 3D. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى إظهار الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC باستخدام تقنية هيدروجيل غير لاصقة micromolded تنشر كرويات ASC ككتل بناء لأساليب الطباعة الحيوية 3D.

المقدمة

تعتبر الكرويات نهجا خاليا من السقالات في هندسة الأنسجة. ASCs قادرة على تشكيل كرويات من خلال عملية التجميع الذاتي. تزيد البنية الدقيقة ثلاثية الأبعاد للكروية من الإمكانات التجديدية ل ASCs ، بما في ذلك قدرة التمايز إلى سلالات متعددة1،2،3. تعمل هذه المجموعة البحثية مع كرويات ASC لهندسة الغضاريف والأنسجة العظمية4،5،6. الأهم من ذلك ، تعتبر الكرويات لبنات بناء في التصنيع الحيوي للأنسجة والأعضاء ، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على الاندماج.

يعتمد استخدام الكرويات لت....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم عزل ASCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا عن المتبرعين البشريين الأصحاء وحفظها بالتجميد كما هو موضح في14 وفقا للجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة كليمنتينو فراغا فيلهو ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، البرازيل (25818719.4.0000.5257). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.

1. التربسين من ASC أحادي الطبقة في الممر الثالث

  1. افتح مزرعة الأنسجة 175 سم2 قارورة تحتوي على الطبقة الأحادية من ASCs عند التقاء 80٪ وتخلص من supernatant.
  2. أضف 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، 0.01 M) واغسل الطبقة الأحا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن لنظام الماصة الأوتوماتيكي زرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من لوحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 972 كرويا في نهاية البروتوكول. باستخدام 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 3072 كرويا في نهاية البروتوكول. تم تحليل الكرويات ASC للتأكد من تجانس حجمها وشكلها. أظهرت كرويات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود قطرا متجانسا خلال فترة الاستزراع على النقيض من الكرويات ASC من micromolds مع 256 حالة ركود (الشكل 1C ، D

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعرض هذه الورقة الجيل الواسع النطاق من الكرويات ASC باستخدام نظام ماصة آلي. الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي إعداد البرنامج بدقة لضمان الحجم الصحيح لتعليق الخلايا وسرعتها ومسافة السحب عليها. تم تحديد المعلمات الموصوفة في البروتوكول بعد عدد من التجارب لتحسين توزيع تعليق خلية ASC في آبار ألواح 12 بئرا تحتوي على الهلاميات المائية المقولبة الدقيقة وغير الملتصقة. تم تقييم التحسين عن طريق قياس قطر وكروية الكرويات. تم استخدام مساحة وارتفاع الهلاميات المائية غير الملتصقة الدقيقة لحساب السرعة المثالية لتوزيع تعليق الخلية. إذا تم زرع .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر المعهد الوطني للمترولوجيا والجودة والتكنولوجيا (INMETRO ، RJ ، البرازيل) على استخدام مرافقه. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (Faperj) (قانون التمويل: E26/202.682/2018 و E-26/010.001771/2019 ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) (رمز التمويل: 307460/2019-3) ، ومكتب البحوث البحرية (ONR) (رمز التمويل: N62909-21-1-2091). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المركز الوطني للعلوم والتكنولوجيا حول الطب التجديدي - INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 بئر لوحة بلاستيكيةCorning3512
50 مل أنبوب الطرد المركزيCorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. حركةإيبندورف30015231
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)إنفيتروجين15576028
مصل بقري الجنين (FBS)جيبكو10082147
منخفض الجلوكوز Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)< / em>Gibco31600034
MicroTtissue 3D Petri Dish micro-mould spheroids - 16 × 16 صفيفسيجماZ764000
الأنسجة الدقيقة 3D Petri Dish الكرويات الدقيقة - 9 × 9 صفيفSigmaZ764019
محلول ملحي (PBS)Sigma806552
كلوريد الصوديوم (NaCl) قارورةالأنسجة SigmaS8776
Corning430720U
trypanLonza17-942E
trypsinجيبكو27250018
الاغاروز فائق النقاء16500100
زراعة

المراجع

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة