تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

Nadezhda Podoplelova; Polina Soloveva; Andrei Garzon Dasgupta; Aleksandra Filkova; Mikhail Panteleev

doi:10.3791/63459

Method Article

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

DOI:

10.3791/63459

⸱

April 6th, 2022

Nadezhda Podoplelova¹^,² , Polina Soloveva¹^,⁴ , Andrei Garzon Dasgupta¹^,²^,³ , Aleksandra Filkova¹^,² , Mikhail Panteleev¹^,²^,³^,⁴

¹Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, ²National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, ³Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, ⁴Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف مجموعة من الطرق لتوصيف تفاعل البروتينات مع أغشية الخلايا أو الحويصلات الدقيقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في جسم الإنسان ، تستمر معظم التفاعلات الفسيولوجية الرئيسية المشاركة في الاستجابة المناعية وتخثر الدم على أغشية الخلايا. الخطوة الأولى المهمة في أي تفاعل يعتمد على الغشاء هي ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية. تم تطوير نهج لدراسة تفاعل البروتين مع الأغشية الدهنية باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية وقياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بدراسة تفاعلات البروتين والأغشية باستخدام الخلايا الحية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الطبيعية أو الاصطناعية. ميزة هذه الطريقة هي بساطة وتوافر الكواشف والمعدات. في هذه الطريقة ، يتم تصنيف البروتينات باستخدام أصباغ الفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن استخدام كل من البروتينات ذاتية الصنع والمتاحة تجاريا ، والتي تحمل علامات الفلورسنت. بعد الاقتران مع صبغة الفلورسنت ، يتم تحضين البروتينات بمصدر للغشاء الفوسفوليبيد (الحويصلات الدقيقة أو الخلايا) ، ويتم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها لحساب الثوابت الحركية والتوازن K_d. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تقدير العدد التقريبي لمواقع ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية باستخدام حبات معايرة خاصة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفصل الأغشية الحيوية المحتويات الداخلية للخلايا الحيوانية والفضاء خارج الخلية. لاحظ أن الأغشية تحيط أيضا بالحويصلات الدقيقة التي تشكلت خلال دورة حياة الخلية والعضيات. يتكون غشاء الخلية في الغالب من الدهون والبروتينات. تؤدي البروتينات الغشائية وظائف الإشارات والهيكلية والنقل والمواد اللاصقة. ومع ذلك ، فإن الطبقة الثنائية الدهنية ضرورية أيضا للترابط بين الخلية الحيوانية والفضاء خارج الخلية. تقترح هذه الورقة طريقة لدراسة التفاعل المحيطي للبروتينات الخارجية مع الغشاء الدهني.

المثال الأكثر لفتا للنظر للتفاعلات التي تحدث على طبقة الغشاء الخارجي للخلية الحيوانية هو تفاعل تخثر الدم. من السمات المهمة لتخثر الدم أن جميع التفاعلات الرئيسية تستمر على الأغشية الفوسفاتية للخلايا والحويصلات الدقيقة الناشئة عن هذه الخلايا وليس في البلازما¹^،²^،³. تشمل التفاعلات المعتمدة على الغشاء عملية بدء التخثر (على أغشية الخلايا في البطانة السفلية ، أو البطانة الملتهبة ، أو الخلايا المناعية المنشطة ، بمشاركة عامل أنسجة) ، وجميع تفاعلات التنشيط المتتالي الرئيسي للعوامل التاسع والعاشر والبروثرومبين. تنشيط العامل الحادي عشر عن طريق الثرومبين (على أغشية الصفائح الدموية المنشطة ، كريات الدم الحمراء ، البروتينات الدهنية ، والحويصلات الدقيقة) ؛ ردود فعل مسار البروتين C ؛ تعطيل إنزيمات التخثر (على أغشية الخلايا البطانية بمشاركة العوامل المساعدة للثرومبومودولين ، مستقبلات البروتين البطاني C ، كبريتات الهيباران) ؛ وتفاعلات مسار الاتصال (على أغشية الصفائح الدموية وبعض الحويصلات الدقيقة بمشاركة عوامل مساعدة غير معروفة). وبالتالي ، من المستحيل التحقيق في تخثر الدم دون دراسة تفاعل بروتينات البلازما المختلفة مع غشاء خلايا الدم.

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتوصيف تفاعل البروتينات مع الأغشية الدهنية للخلايا أو الحويصلات الدقيقة. تم اقتراح هذا النهج في البداية لدراسة تفاعل بلازما الدم مع الصفائح الدموية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية. علاوة على ذلك ، تتفاعل معظم البروتينات المدروسة مباشرة مع الدهون الفوسفاتية الغشائية سالبة الشحنة ، خاصة مع فوسفاتيديل سيرين ^4,5. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بروتينات يتم التفاعل مع الغشاء بوساطة مستقبلات خاصة⁶.

تتمثل إحدى القدرات المهمة لقياس التدفق الخلوي في التمييز بين الأربطة الحرة والمربوطة دون فصل إضافي. تسمح هذه الميزة في قياس الخلايا بدراسة ربط توازن الرباط عند نقطة النهاية وتساعد على إجراء قياسات حركية مستمرة. هذه التقنية غير متطورة ولا تتطلب إعداد عينة معقدة. يستخدم قياس التدفق الخلوي بنشاط لدراسة ديناميات التفاعل بين الببتيدات الفلورية والمستقبلات وبروتينات G في العدلات السليمة والقابلة للنفاذ إلى المنظفات⁷. هذا النهج قابل للتطبيق أيضا لاستكشاف التفاعلات بين البروتين والحمض النووي وحركية نشاط endonuclease في الوقت الحقيقي⁸. بمرور الوقت ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين عالية التقارب مع الحويصلات الدهنية النقية⁹ ، أو بشكل أعم ، مع بروتينات الغشاء المعبر عنها في نظام تعبير خلية Sf9 عالي الكفاءة¹⁰. كما تم وصف الطرق الكمية لتوصيف التفاعلات بين البروتين والجسيمات الشحمية باستخدام قياس التدفق الخلوي للبروتينات عبر الغشاء¹¹.

تستخدم هذه التقنية حبات معايرة ذاتية الصنع لتجنب استخدام الخرز المتوفر تجاريا⁷. كانت خرزات المعايرة المستخدمة سابقا⁷ تهدف إلى العمل مع الفلوريسين ، مما قيد بشكل كبير مجموعة متنوعة من روابط الفلورسنت التي يمكن الوصول إليها على البروتينات. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة طريقة جديدة للحصول على البيانات الحركية وتحليلها للحصول على دقة زمنية معقولة. على الرغم من وصف هذه الطريقة لحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية ، إلا أنه لا توجد قيود واضحة على قدرتها على التكيف مع الخلايا أو الحويصلات الطبيعية أو الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية ذات تركيبة دهنية مختلفة. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتقدير معلمات التفاعل (k_on ، k_off) والتوازن (K_d) وتسهل التوصيف الكمي لعدد مواقع ربط البروتين على الغشاء. لاحظ أن هذه التقنية توفر تقديرا تقريبيا لعدد مواقع الربط. مزايا هذه الطريقة هي بساطتها النسبية ، وإمكانية الوصول إليها ، وقدرتها على التكيف مع الخلايا الأصلية والحويصلات الدقيقة الطبيعية والاصطناعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. وضع العلامات على البروتين الفلورسنت

إعداد المواد
1. تحضير 1 M بيكربونات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 9.0، وتخزينها في 4 درجة مئوية، واستخدامها في غضون أسبوع واحد.
2. تحضير 1.5 M هيدروكسيلامين هيدروكلوريد العازل، الرقم الهيدروجيني 8.5، مباشرة قبل الاستخدام.
3. تحضير محلول 10 ملغم / مل من صبغة الفلورسنت (انظر جدول المواد) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
  ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل لمدة شهر عند -20 درجة مئوية في الظلام.
4. تحضير محاليل من الأجسام المضادة النقية أو البروتينات الأخرى في 1-10 ملغ / مل.
  ملاحظة: تجنب المخازن المؤقتة التي تحتوي على أيونات الأمونيوم أو الأمينات الأولية. استبدل المخازن المؤقتة التي تحتوي على تريس أو الجلسرين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق غسيل الكلى. لن يؤثر أزيد الصوديوم (≤3 ملليمتر) ولا الثيميروسال (≤1 ملليمتر) بشكل كبير على تفاعل الاقتران.
5. احتضان وسط ترشيح الجل (انظر جدول المواد) لتنقية البروتين في PBS بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو لمدة 2 ساعة عند 60 درجة مئوية. ضع وسط ترشيح الجل على أعمدة الدوران ذات الأغشية 0.2 ميكرومتر.
احسب كمية الصبغة التفاعلية التي سيتم استخدامها لكل تفاعل وفقا لتركيز البروتين المراد تصنيفه باستخدام Eq (1).

حيث_صبغة V هي حجم محلول مخزون الصبغة ؛ C pr و V pr و MW_pr هو تركيز البروتين وحجمه ووزنه المولي. _صبغة MW هي الوزن المولي للصبغة. 100 هو عامل تحويل الوحدة. MR هي النسبة المولية للصبغة إلى البروتين في خليط التفاعل.
ملاحظة: يوصى باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي التالي لتفاعلات وضع العلامات على IgG: MR = 40 إذا كان الجسم المضاد عند 1-3 ملغم / مل أو MR = 30 إذا كان الجسم المضاد عند 4-10 ملغ / مل. بالنسبة لعوامل التخثر ، عادة ما يتم استخدام MR = 5.
تفاعل الاقتران
1. في أنبوب التفاعل ، امزج محلول البروتين مع حجم أقل 10 مرات من محلول بيكربونات 1 M.
2. أضف الكمية المطلوبة من صبغة الفلورسنت (انظر الخطوة 1.2) مع التحريك المستمر.
3. احتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة تقريبا ، محميا من الضوء مع التحريك المستمر.
4. لكل 200 ميكرولتر من محلول البروتين ، أضف 5 ميكرولتر من 1.5 م هيدروكسي لامين هيدروكلوريد.
5. احتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، محميا من الضوء مع التحريك المستمر.
قم بإعداد عمود الدوران.
1. أضف 500 ميكرولتر من وسط ترشيح الجل لتنقية البروتين إلى عمود. قم بطرد العمود لمدة 3 دقائق عند 1000 × جم.
2. تخلص من المخزن المؤقت من أنبوب التجميع. إذا لم يكن العمود ممتلئا ، فأضف المزيد من وسط ترشيح الهلام ، وقم بالطرد المركزي للعمود لمدة 3 دقائق عند 1000 × جم. كرر هذه الخطوة حتى يمتلئ العمود.
تنقيه
1. الطرد المركزي لخليط التفاعل (من الخطوة 1.3.5) لمدة 5 دقائق عند 17000 × غرام وإزالة الراسب.
2. انقل السوبرناتانت إلى عمود الدوران باستخدام وسط ترشيح الهلام. اسمح للمحلول بالامتصاص في سرير الجل.
3. استخدم أنبوب تجميع فارغ لعمود الدوران وقم بطرده مركزيا لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم. بعد الطرد المركزي ، اجمع البروتين المسمى من أنبوب التجميع.
تحديد درجة وضع العلامات
1. صحيح لمساهمة الصبغة في الامتصاص عند A 280 عن طريق قياس امتصاص الصبغة الحرة عند 280 نانومتر (A ₂₈₀) والحد _الأقصى λ للصبغة (A_max) (انظر Eq (2)).
  (2)
2. قم بقياس امتصاص مقترن صبغة البروتين عند 280 نانومتر (A ₂₈₀) والحد _الأقصى λ للصبغة (A_max) واحسب تأقلم البروتين باستخدام Eq (3).
  (3)
  حيث ε_M هو معامل الانقراض المولي للبروتين عند 280 نانومتر. d هو طول المسار البصري أثناء قياس الامتصاص ؛ CF هو مساهمة الصبغة في الامتصاص عند A₂₈₀ (الخطوة 1.6.1).
3. احسب درجة وضع العلامات (DOL) باستخدام Eq (4).
  (4)
  حيث ε_M _صبغة هي معامل الانقراض المولي للصبغة عند λ_max nm. d هو طول المسار البصري أثناء قياس الامتصاص ؛ _بروتين C هو تركيز البروتين (الخطوة 1.6.2).

2. إعداد الحويصلات الفوسفاتية

تحضير وتخزين خليط الدهون
1. الجمع بين الدهون في النسبة المناسبة (فوسفاتيديل سيرين / فوسفاتيديل كولين بنسبة 20 مول٪ إلى 80 مول٪).
2. جفف خليط الدهون بعد التجفيد أو التبخر وخزنه تحت جو خامل في أمبولات زجاجية.
إنتاج أفلام الدهون
1. افتح الأمبولة ، وأعد تعليق خليط الدهون بكمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من الكلوروفورم.
  ملاحظة: لا تستخدم الكثير من الكلوروفورم لأنه لا يتبخر تماما.
2. أضف DiIC16 (3) في الإيثانول عند 0.2 مول٪. انقل خليط الدهون إلى قارورة مستديرة القاع. انشر الخليط بشكل رقيق على جانبي القارورة عن طريق تدويرها. جفف مزيج الدهون لمدة 30 دقيقة تحت تيار الأرجون.
ترطيب خليط الدهون
1. أضف عازلا مائيا دافئا بشكل مناسب (~ 55 درجة مئوية) (HEPES 20 mM ، NaCl 140 mM ، pH 7.4) في حجم يتوافق مع تركيز الدهون المتوقع إلى القارورة مع فيلم الدهون. احتضني الخليط مع الدوامة عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للترطيب الكامل.
2. وضع أنبوب العينة في الفريزر أو منظم الحرارة الدافئ لجعل تعليق الدهون يخضع ل 3-5 دورات تجميد وإذابة.
تشكيل الحويصلات الدهنية عن طريق البثق
1. قم بإعداد الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتسخين جميع مكونات الطارد إلى درجة حرارة انتقال الطور لخليط الدهون.
2. املأ إحدى محاقن الطارد بخليط الدهون المائي. انتظر لمدة 5-10 دقائق حتى تتوازن درجة حرارة تعليق الدهون مع درجة حرارة الطارد.
3. بثق خليط الدهون من خلال الغشاء 10 مرات على الأقل. بالنسبة للبثق النهائي ، ضع تعليق الدهون في المحقنة البديلة وابحث عن تغيير في المظهر من غامض قليلا إلى محلول واضح.
4. تخزين الخليط الناتج من الحويصلات الدهنية في 4 درجات مئوية ، ويفضل أن يكون ذلك في جو خامل من الأرجون أو النيتروجين ، لمدة 3-4 أيام. لا تجمد.

3. عزل الصفائح الدموية عن الدم الكامل

جمع الدم الكامل من المتبرعين الأصحاء في أنابيب تحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم.
أضف البروستاجلاندين E1 (PGE1) (1 ميكرومتر) و apyrase (0.1 U / mL) إلى الدم ، متبوعا بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 100 × جم لمدة 8 دقائق.
بعد الطرد المركزي ، خذ البلازما الغنية بالصفائح الدموية وأضف محلول سترات الصوديوم (106 mM ، الرقم الهيدروجيني 5.5) إلى نسبة البلازما / السترات من 3: 1. الطرد المركزي للبلازما في درجة حرارة الغرفة عند 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت ل Tyrode بدون BSA (20 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 0.4 mM NaH 2 PO 4 ، 2.5 mM CaCl ₂ ، 5 mM glucose ، pH_7.4). تنقية الصفائح الدموية من بروتينات البلازما عن طريق كروماتوغرافيا هلام على وسط ترشيح الجل لتنقية الصفائح الدموية (انظر جدول المواد).

4. الكشف عن البروتين - تفاعل الدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي

تجارب الربط الحركي
1. تمييع الحويصلات الفوسفاتية (من الخطوة 2.4.4) في المخزن المؤقت ل Tyrode (20 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 0.4 mM NaH 2 PO 4 ، 2.5mM CaCl₂ ، 5 mM glucose ، 0.5٪ BSA ، pH _7.4) إلى تركيز 1 μM والحجم الإجمالي 250 μL.
2. امزج عامل التخثر المسمى بالفلورسنت X (fX-fd) من الخطوة 1 بتركيز 500 نانومتر مع الحويصلات الفوسفاتية من الخطوة 4.1.1 بنسبة 1:1 (تركيز الحويصلة النهائي 0.5 ميكرومتر ، تركيز fX-fd هو 250 نانومتر من fX) إلى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر.
3. حقن على الفور 500 ميكرولتر من التعليق المختلط (~ 20 دقيقة للتحليل بمعدل تدفق منخفض) في مقياس التدفق الخلوي. استخدم معدل تدفق منخفض وتأكد من أن عتبة القناة FL2 (exсitation 488 nm ، مرشح الانبعاثات 585/42 nm) هي كقيمة 200. قم بقياس متوسط التألق في القناة FL4 (exсitation 633 nm ، مرشح الانبعاثات 660/20) لصبغة التألق من جدول المواد.
  ملاحظة: اختر مقياس خلوي بدون جهاز أخذ عينات تلقائي. سيؤدي ذلك إلى تسريع عملية حقن العينة في خلية القياس.
4. عندما يتم تحقيق تشبع الارتباط (لا توجد زيادة كبيرة في التألق في غضون 5 دقائق) ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ، وراقب التفكك حتى يتم الوصول إلى التألق الأساسي (التفكك الكامل) أو حتى يتم الوصول إلى هضبة (لا يوجد انخفاض كبير في التألق في غضون 5 دقائق).
  ملاحظة: كعنصر تحكم، أضف 10 ميكرومتر EDTA وراقب الانفصال الكامل لمدة 5 دقائق.
تجارب ربط التوازن
ملاحظة: استخدم المنحنى الحركي للربط لتحديد وقت الوصول إلى التشبع. وقت التشبع ل fX-fd والحويصلات الاصطناعية هو 20 دقيقة.
1. احتضان حويصلات فوسفوليبيد اصطناعية (5 ميكرومتر) لفحص الربط بتركيزات مختلفة من fX-fd (من 0 إلى 1000 نانومتر) في مخزن Tyrode المؤقت لمدة 20 دقيقة.
2. قم بتخفيف كل عينة من الخطوة 4.2.1 × 20x إلى حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. قم على الفور بتحليل العينة المخففة عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 30 ثانية. استخدم الإعدادات من الخطوة 4.1.3.
  ملاحظة: كعنصر تحكم للربط غير المحدد ، استخدم عينات مماثلة مع EDTA (10 ميكرومتر) واحتضنها لمدة 5 دقائق.

5. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

تصدير التجارب بتنسيق FSC من برنامج الحصول على بيانات القياس الخلوي إلى برنامج قياس الخلايا لتحليل البيانات (انظر جدول المواد). اختر ملف | | التصدير ملفات FCS. افتح FSC الملفات في برنامج مقياس الخلايا لتحليل البيانات عن طريق تحديد الملفات الموجودة على الكمبيوتر وسحبها إلى مساحة عمل البرنامج.
لبوابة الحويصلات الدقيقة ، حدد منطقة الحويصلات الدقيقة عن طريق تألق الصبغة المحبة للدهون DiIC₁₆ (3). استخدم أوامر القائمة أو زر الرسم في ورقة العمل لإنشاء SSC مخطط نقطي من FL2 (صبغ DilC₁₆(3)) في إحداثيات السجل. اختر زر البوابة المستطيلة لرسم منطقة بوابة بحيث لا يتم تضمين الأحداث من عينة بدون حويصلات في هذه المنطقة (الشكل 1B,C).
تحليل التجارب الحركية.
1. إنشاء مخطط نقطي باستخدام إحداثيات التألق (FL4) بمرور الوقت لمنطقة الحويصلات (انقر نقرا مزدوجا في منطقة الحويصلات في الخطوة 5.2)
2. تصدير البيانات المتعلقة بالتغيير في التألق بمرور الوقت بتنسيق csv. اختر عينة | انقر بزر الماوس الأيمن فوق | | التصدير اختر FL4 والوقت في المعلمات | حدد الدليل لحفظ | حدد تنسيق CSV | التصدير.
3. افتح ملف CSV في أي برنامج إحصائي (انظر جدول المواد). احسب متوسطا متحركا بسيطا للتألق والوقت لكل 1000 حدث.
4. تقريب رسم بياني لاعتماد المتوسط المتحرك البسيط للتألق على الوقت تحت افتراض الاعتماد الأسي (تحليل > التركيب >ملاءمة المنحنى غير الخطي) واستخدام هذا لحساب ثابت الارتباط الحركي باستخدام Eq (5).
  (5)
  حيث [X^B] هو تركيز العامل المرتبط في كل لحظة زمنية (وحدات يحددها المستخدم) وفقا للمتوسط المتحرك البسيط من الخطوة 5.3.3 ؛ [X] هو تركيز العامل المضاف. [X] الحد الأقصى هو _{الحد الأقصى} لتركيز العامل المقيد. k هو ثابت الارتباط. ر هو الوقت.
5. كرر نفس مجموعة الإجراءات (5.3.1-5.3.4) لحساب ثابت التفكك الحركي باستخدام Eq (6).
  (6)
  حيث [X^B] هو تركيز العامل المحدد في كل لحظة من الزمن؛ [X]₀ هو تركيز العامل المحدد في اللحظة الأولى من الزمن. k هو ثابت الانفصال. ر هو الوقت.
فحص ربط التوازن
1. أوجد متوسط تألق fX-fd في منطقة الحويصلات لكل تركيز محدد من fX-fd.
2. تقريب اعتماد تألق العامل المرتبط من تركيز العامل المضاف في افتراض الربط البسيط في موقع واحد. احسب متوسط معلمات الربط باستخدام Eq (7) من ثلاثة تكرارات مستقلة كحد أدنى.
  (7)
  حيث [X^B] هو تركيز العامل المقيد؛ [X] هو تركيز العامل المضاف. n^x هو العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ؛ K_dهو ثابت التفكك الظاهر.

6. تحويل كثافة التألق إلى متوسط عدد مواقع الربط

إعداد الخرز معايرة.
1. احتضان الصفائح الدموية المصفاة بالهلام (انظر الخطوة 3.3) باستخدام A23187 (10 ميكرومتر) في وجود CaCl 2 (_2.5 mM) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. أضف إلى الصفائح الدموية المنشطة تركيزات مختلفة من fX-fd (0 إلى 1000 نانومتر). أضف 2٪ v / v الفورمالديهايد واحتضن لمدة 1 ساعة. أوقف التفاعل عن طريق احتضان الصفائح الدموية ب 3 M glycine و 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. تنقية الخليط من الصبغة غير المتفاعلة. قم بالطرد المركزي للصفائح الدموية لمدة 5 دقائق عند 400 × جم ، وقم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في مخزن Tyrode العازل (الذي يحتوي على 0.5٪ BSA).
  ملاحظة: كرر الخطوة 6.1.3 ثلاث مرات.
قم بقياس مستوى التألق لخرز المعايرة في كل عينة أولا باستخدام مقياس الطيف الفلوري (لصبغة الفلورسنت من جدول المواد ، الإثارة 633 نانومتر ، الانبعاثات 670 نانومتر) ثم باستخدام مقياس التدفق الخلوي (في القناة FL4: الإثارة 633 نانومتر ، مرشح الانبعاثات 660/20). باستخدام عداد خلايا، حدد عدد الخرز في كل عينة.
قم بتحويل شدة التألق لكل عينة خرزة إلى تركيز صبغة الفلورسنت القابلة للذوبان باستخدام مقياس الطيف الفلوري. أعد حساب تركيز صبغة الفلورسنت لعدد جزيئات الفلوروفور باستخدام Eq (8).
(8)
حيث N_x هو عدد جزيئات الفلوروفور. C هو تركيز صبغة الفلورسنت. N_A هو ثابت أفوغادرو. N_A = 6.02214076×10²³ مول ^-1.
قم بإنشاء رسم بياني للاعتماد على متوسط تألق الخرز في مقياس التدفق الخلوي (الخطوة 6.2) على عدد جزيئات الفلوروفور (انظر الخطوة 6.3) لكل عينة باستخدام أي برنامج إحصائي (انظر جدول المواد). تقريب هذا الاعتماد حسب تناسب الخط (تحليل | | التركيب تناسب الخطية). من التقريب في Eq (9) ، احسب عامل التحويل لمتوسط التألق إلى مواقع الربط.
(9)
حيث MF هو متوسط تألق الخرز عن طريق قياس التدفق الخلوي ؛ Nx هو عدد جزيئات الفلوروفور لكل حبة. يمثل CF عامل تحويل متوسط التألق إلى مواقع الربط. يتم الحصول على CF و b من نتائج تركيب الرسم البياني بالتناسب الخطي.
احسب العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية باستخدام Eq (10).
(10)
حيث nx هو العدد الظاهر لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية ؛ MF هو متوسط التألق للحويصلات ذات الأهمية عن طريق قياس التدفق الخلوي. CF و b هما عاملان تحويلان من Eq (8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم طريقة قياس التدفق الخلوي الموصوفة هنا لتوصيف ارتباط بروتينات تخثر البلازما بالصفائح الدموية المنشطة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحويصلات الفوسفاتية PS: PC 20: 80 كنظام نموذجي. تركز هذه الورقة بشكل أساسي على الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية كمثال. يجب اختيار معلمات مقياس الخلايا ، على وجه الخصوص ، جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) والتعويض لكل جهاز محدد ، وموضوع الدراسة (الخلايا ، الحويصلات الدقيقة الاصطناعية أو الطبيعية) ، والأصباغ المستخدمة. يوضح الشكل 1B ، C مثالا على...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تكييف الطريقة المقترحة للتوصيف التقريبي لتفاعل البروتينات مع أغشية الدهون الفوسفاتية من مصادر وتركيبات مختلفة. يعترف قياس التدفق الخلوي الكمي الموصوف هنا برنين البلازمون السطحي (SPR) في العديد من المعلمات. على وجه الخصوص ، لديها حساسية أقل ودقة زمنية وتتطلب وضع علامات الفلورسنت على البروتينات. يمكن أن يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير في التشكيل وفقدان النشاط للعديد من البروتينات وبالتالي يتطلب تحكما دقيقا. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها مزايا كبيرة على الآخرين. توفر هذه الطريقة فرصة لاستكشاف تفاعل البروتينات مع غ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم المؤلفين بمنحة مؤسسة العلوم الروسية 20-74-00133.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
A23187	سيجما ألدريتش	C7522-10MG
أليكسا فلور 647 NHS إستر (سكسينيمديل إستر) ثيرمو	فيشر العلمي	A37573	صبغة الفلورسنت
أبيراز من البطاطس	سيجما ألدريتش	A2230
BD FACSCantoII	Bioscience
ألبومين مصل الأبقار	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
كلوريد الكالسيوم ، اللامائي ، مسحوق ، & ge ؛ 97٪	سيجما ألدريتش	C4901-100G
كاري مطياف الكسوف المضان	Agilent
D- (+) - الجلوكوز	سيجما ألدريتش	G7528-1KG
DiIC16 (3) (1،1 '- ثنائي هيكساديسيل-3،3،3 '، 3'-تتراميثيل إندوكربوسيانين بيركلورات)	ثيرمو فيشر العلمي	D384
DMSO	سيجما ألدريتش	D8418
ملح ثنائي الصوديوم EDTA	VWR علوم الحياة AMRESCO	Am-O105B-0.1
الحصول على بيانات القياس الخلوي		EDTA Bioscience
FlowJo	Tree Star		لتحليل البيانات
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme Research	HFX 1010
هيدروكسيلامين هيدروكلوريد	بانريك	141914.1209
L- & alpha - فوسفاتيديل كولين (الدماغ ، الخنازير)	أفانتي القطبية الدهون	840053P
L- & alpha - فوسفاتيديل سيرين (الدماغ ، الخنزير) (ملح الصوديوم)	أفانتي القطبية للدهون	840032P
كلوريد المغنيسيوم	سيجما ألدريتش	M8266-100G
الطارد الصغير	أفانتي الدهون القطبية	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		البرنامج الإحصائي
أقراص محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) ، درجة التكنولوجيا الحيوية	VWR علوم الحياة AMRESCO	97062-732
كلوريد البوتاسيوم	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandin E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	وسط ترشيح هلام لتنقية البروتين
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	ترشيح جل لتنقية الصفائح
بيكربونات الصوديوم	Corning	61-065-RO
كلوريد الصوديوم	Sigma Aldrich	S3014-500G
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة	Sigma Aldrich	S3139-250G
Spin collumns مع غشاء 0.2 & micro ؛ م	سارتوريوس	VS0171
ثلاثي الصوديوم سيترات ثنائي هيدرات	سيجما ألدريتش	S1804-1KG

FACSبرنامج برنامج مقياس الخلايا وسط الدموية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles