مقالة منهجية

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

DOI:

10.3791/63470

⸱

فبراير 1, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phormidium lacuna هي بكتيريا زرقاء خيطية تم عزلها من برك الصخور البحرية. تصف هذه المقالة عزل الخيوط عن المصادر الطبيعية ، واستخراج الحمض النووي ، وتسلسل الجينوم ، والتحول الطبيعي ، والتعبير عن sfGFP ، والحفظ بالتبريد ، وطرق الحركة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا الزرقاء هي محور البحوث الأساسية ومشاريع التكنولوجيا الحيوية التي تستخدم فيها الطاقة الشمسية لإنتاج الكتلة الحيوية. ثغرة Phormidium هي بكتيريا زرقاء خيطية معزولة حديثا. تصف هذه الورقة كيف يمكن عزل البكتيريا الزرقاء الخيطية الجديدة من برك الصخور البحرية. كما يصف كيف يمكن استخراج الحمض النووي من الخيوط وكيف يمكن تسلسل الجينومات. على الرغم من أن التحول قد تم تأسيسه للعديد من الأنواع أحادية الخلية ، إلا أنه يتم الإبلاغ عنه بشكل أقل تواترا للبكتيريا الزرقاء الخيطية. يتم وصف طريقة مبسطة للتحول الطبيعي ل P. lacuna هنا. P. lacuna هو العضو الوحيد في ترتيب الذبذبات الذي تم إنشاء التحول الطبيعي له. توضح هذه الورقة أيضا كيفية استخدام التحول الطبيعي للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (sfGFP). قام مروج cpcB داخلي المنشأ بتحفيز تعبير أقوى بنحو 5 مرات من مروجي cpc560 أو A2813 أو psbA2 من Synechocystis sp. PCC6803. علاوة على ذلك ، تم إنشاء طريقة للحفظ بالتبريد ل P. lacuna و Synechocystis sp.CPP 6803 ، وتم وصف طرق لتقييم الحركة في وسط سائل وعلى الأسطح الخضراء والبلاستيكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا الزرقاء هي كائنات بدائية النواة تستخدم التمثيل الضوئي كمصدر للطاقة 1,2. تركز الأبحاث بشكل متزايد على أنواع البكتيريا الزرقاء. يمكن تحويل العديد من البكتيريا الزرقاء باستخدام الحمض النووي3. يمكن إخراج الجينات أو المبالغة في التعبير عنها في هذه الأنواع. ومع ذلك ، يقتصر التحول على عدد قليل من الأنواع4،5،6،7،8،9،10،11 ، وقد يكون من الصعب إنشاء تحول في السلالات من مجموعات الاستزراع أوالبرية 8. تم عزل سلالات الأنواع الخيطية Phormidium gapuna (الشكل 1) من برك الصخور البحرية ، حيث تتقلب الظروف البيئية ، مثل تركيزات الملح أو درجة الحرارة ، بمرور الوقت. يمكن استخدام هذه البكتيريا الزرقاء الخيطية ككائنات حية نموذجية لترتيب Oscillatoriales12 الذي تنتمي إليه.

خلال التجارب التي تختبر نقل الجينات عن طريق الكهربية13,14 ، وجد أن P. ثغرة يمكن تحويلها عن طريق التحول الطبيعي 15. في هذه العملية ، يتم تناول الحمض النووي بشكل طبيعي من قبل بعض الخلايا. بالمقارنة مع طرق التحول الأخرى16,17 ، يتمتع التحول الطبيعي بميزة عدم الحاجة إلى أدوات إضافية يمكن أن تعقد الإجراء. على سبيل المثال ، يتطلب الكهربية الكافيت المناسب ، والأسلاك السليمة ، واختيار الجهد المناسب. P. ثغرة هي حاليا العضو الوحيد في الذبذبات المعرضة للتحول الطبيعي. نظرا لأن البروتوكول الأصلي يعتمد على بروتوكولات الكهربية ، فإنه لا يزال يتضمن العديد من خطوات الغسيل التي قد تكون غير ضرورية. تم اختبار مناهج مختلفة لتبسيط البروتوكول ، مما أدى إلى بروتوكول التحويل المعروض هنا.

تسلسل الجينوم ضروري لمزيد من الدراسات الجزيئية القائمة على الضربة القاضية الجينية أو الإفراط في التعبير. على الرغم من أنه يمكن الحصول على تسلسل الجينوم باستخدام آلات تسلسل الجيل التالي في غضون فترات قصيرة ، إلا أن استخراج الحمض النووي قد يكون صعبا ويعتمد على الأنواع. مع P. ثغرة ، تم اختبار العديد من البروتوكولات. ثم أنشئت طريقة معدلة قائمة على بروميد الأمونيوم ثلاثي ميثيل سيتيل (CTAB)، مما أدى إلى نقاء مقبول للحمض النووي وإنتاج الحمض النووي لكل دورة تنقية لمواصلة العمل في المختبر. يمكن تسلسل جينوم خمس سلالات باستخدام هذا البروتوكول. كانت خطوة التحول المنطقي التالية هي إنشاء تعبير البروتين في P. ثغرة.

يمكن الكشف عن sfGFP المستخدم كبروتين علامة في هذا البروتوكول باستخدام أي مجهر فلوري. يمكن استخدام جميع المروجين الذين تم اختبارهم لتعبير P. lacuna sfGFP. أدى العدد المتزايد من السلالات الناشئة عن التحول إلى الحاجة إلى طريقة لتخزين الثقافات. يتم إنشاء هذه الطرق للإشريكية القولونية والعديد من البكتيريا الأخرى18. في البروتوكولات القياسية ، يتم إعداد مزارع الجلسرين ، ونقلها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. لا تتطلب هذه الطريقة سوى بضع خطوات وهي موثوقة للغاية لتلك الأنواع التي تم تأسيسها من أجلها. ولم يكن البروتوكول الموحد ممكنا بالنسبة للثغرة المتصورة لأن الخلايا الحية لا يمكن استردادها في جميع الحالات. ومع ذلك ، عندما تمت إزالة الجلسرين بعد ذوبان الجليد ، نجت خلايا جميع التجارب. يتم تقديم طرق بسيطة لتحليل حركية P. ثغرة ، والتي يمكن دمجها مع طفرات الضربة القاضية للتحقيق في النوع الرابع pili أو دور المستقبلات الضوئية. تختلف هذه الفحوصات عن تلك الخاصة بالبكتيريا الزرقاء أحادية الخلية19،20،21 ويمكن أن تكون مفيدة أيضا للذبذبات الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. العزلة عن البيئة الطبيعية

ملاحظة: يمكن عزل الطحالب الخضراء والدياتومات والبكتيريا الزرقاء الخيطية والطحالب الدقيقة الأخرى. يمكن استخدام البروتوكول لأي نوع من أنواع الطحالب الدقيقة من برك الصخور التي تنمو تحت ظروف المختبر. يمكن التعرف بسهولة على البكتيريا الزرقاء الخيطية التي تنتمي إلى الذبذبات من خلال حركتها وشكلها الخيطي. يمكن تحديد الأنواع في حالة شبه نقية عن طريق تسلسل الجينوم أو تسلسل 16S rRNA.

  1. نقل عينات مياه البحر السائلة من برك الصخور البحرية (أي التجاويف في الساحل الصخري) إلى قوارير سعة 50 مل. لكل قارورة ، لاحظ المكان أو الإحداثيات الدقيقة للمصدر الطبيعي. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتصفية المحتوى من خلال شبكات 50 ميكرومتر لتقليل كميات العوالق الحيوانية. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية حتى يمكن زراعتها الفرعية.
  2. انقل مزارع 1 مل إلى أطباق بتري 10 سم تحتوي على 3٪ باكتو-أجار في f/2 متوسطة 22,23 (انظر جدول المواد). قم بإعداد ما يصل إلى 20 لوحة. تزرع تحت ضوء أبيض من 50 ميكرومول m-2 s-1.
    ملاحظة: يمكن استخدام كثافة ضوء أعلى للزراعة. يمكن استخدام كثافة تصل إلى 400 ميكرومول m-2 s-1 ل P. ثغرة ، على الرغم من أن الأنواع الأخرى قد تكون أكثر حساسية للضوء.
  3. بعد أسبوع واحد ، انقل الخلايا المطلوبة إلى ألواح أجار طازجة باستخدام ملقط معقم. عزل الخلايا تحت المجهر ثنائي المنظار تحت ظروف معقمة. قم بتخزين لوحة الأجار القديمة عند 4 درجات مئوية حتى تظهر الخلايا وتنمو على لوحة الأجار الجديدة.
  4. كرر خطوة النقل هذه كل أسبوع للقضاء على التلوث. استخدم العين المجردة للكشف عن التلوث الثقيل والمجهر مع تكبير 400x لإجراء فحوصات إضافية للتلوث.
  5. إذا بدت العينة خالية من التلوث، فاختبر التلوث البكتيري أو الفطري على ألواح الأجار. انقل جزءا صغيرا من المستنبتة مع حلقة تلقيح إلى صفيحة أجارLB 24 (قطرها 10 سم) ، واحتفظ باللوحة في درجة حرارة الغرفة ، وتحقق من نمو الملوثات على مدار 1-3 أيام.
  6. إذا تم الحصول على أنواع من البكتيريا الزرقاء الخيطية المعقمة ، فاستخدمها لمزيد من أعمال الاستزراع. زراعة P. ثغرة في السائل أو على لوحات باكتو أجار. استخدم قوارير سعة 250 مل مع 50 مل من f/2 متوسطة أو f/2+ متوسطة للزراعة السائلة.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: تعتمد هذه الطريقة من 25 26 

  1. تحضير قارورتين مع 50 مل من f/2 المتوسطة. تطعيم كل منها مع ~ 1 مل من خيوط P. ثغرة من الثقافات النامية الأخرى. حافظ على الثقافات لمدة 7 أيام أو أكثر تحت الإثارة (الدوران الأفقي) عند 50 دورة في الدقيقة تحت الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) عند 25 درجة مئوية.
  2. عالج الثقافة بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة بكامل الطاقة. قياس OD عند 750 نانومتر ؛ تحقق للتأكد من أنه ~ 0.5. استمر في تنمية الثقافات إذا كان OD منخفضا جدا.
  3. اجمع الخيوط بواسطة 5000 × جم ، 20 دقيقة من الطرد المركزي. إزالة supernatant. انقل الخيوط مع السائل المتبقي إلى غرفة الصحافة الفرنسية27. اضبط ضغط الصحافة الفرنسية على 20000 رطل لكل بوصة مربعة واستخرج الخلايا.
    ملاحظة: ستقوم الصحافة الفرنسية بتحليل جميع الخلايا وإطلاق الحمض النووي. ستنتج قوى القص القوية شظايا الحمض النووي 1500 نقطة أساس.
  4. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم وقم بإزالة السوبرنات.
  5. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (4 M urea ، 0.1 M Tris / Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.4) و 50 ميكرولتر من بروتين K (10 mg / mL) إلى الكرية. سخني العينة إلى 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الاهتزاز عند 550 دورة في الدقيقة.
  6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (3٪ CTAB ، 1.4 M NaCl ، 10 mM EDTA ، 0.1 M Tris / Cl ، 1٪ Sarkosyl ، 0.1 M DTT ، الرقم الهيدروجيني 8) واحتضن لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية و 550 دورة في الدقيقة. نقل المحاليل إلى أنابيب الطرد المركزي ، وإضافة مجلدين من الكلوروفورم / إيزواميلكحول (24/1).
  7. بعد الاهتزاز ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 9000 × جم. انقل المرحلة المائية العلوية إلى قوارير تفاعل وأضف 1 مل من الإيثانول البارد المثلج و 50 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 م.
  8. دوامة العينة ووضعها في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو أكثر.
  9. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 10000 × جم (4 درجات مئوية) وتخلص من السوبرنات. اغسل الكريات بالإيثانول بنسبة 70٪.
  10. الطرد المركزي للعينة مرة أخرى. إزالة supernatant وتجفيف الكريات بين عشية وضحاها. إذابة الحمض النووي في الماء الخالي من النوكليز. قم بقياس طيف الحمض النووي للتحقق مما إذا كان OD 260 nm / OD 280 nm يتراوح بين 1.6 و 1.9.
  11. تحليل حجم الحمض النووي على هلام الرحلان الكهربائي agarose28.
  12. تسلسل الحمض النووي الجينومي عن طريق تسلسل الجيل التالي لمدة 300 دورة، مع إعداد نهاية مقترنة وقراءة طول 150 قاعدة (انظر جداول المواد).
  13. إجراء التجميع باستخدام برنامج الكمبيوتر المناسب ؛ انظر المثال الوارد في جدول المواد.
  14. أرسل مسودة الجينوم إلى خادم RAST للتعليق التوضيحي.
    ملاحظة: قم بتحميل تسلسلات الحمض النووي للحصول على تعليق توضيحي كامل في غضون بضع دقائق.

3. التحول الطبيعي والتعبير GFP

ملاحظة: يعتمد التحول على متجه بلازميد منتشر في الإشريكية القولونية. يمكن استخدام pGEM-T أو pUC19 كناقلات العمود الفقري. وتوجد تقنيات الاستنساخ في العديد من المختبرات؛ انظر أيضا البروتوكولات القياسية28 والمقالات المتعلقة بناقلات التحويل ل P. ثغرة15,29. يتم وصف أمثلة للمتجهات لتعبير sfGFP في قسم النتائج التمثيلية. وترد تفاصيل أربعة متجهات لم تنشر بعد في الملف التكميلي 1.

  1. نفذ جميع الخطوات باستخدام مواد معقمة تحت ظروف مختبرية معقمة (مقعد نظيف ، أواني زجاجية معقمة).
  2. قم بتلقيح 2 × 50 مل من الوسط السائل f/2 في قارورتين سعة 250 مل مع 2 × 1 مل من خيوط P. gapuna من ثقافة الجري. تزرع في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) تحت الإثارة (الدوران الأفقي ، 50 دورة في الدقيقة) لمدة 5 أيام تقريبا عند 25 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد ~ 200 ميكروغرام من الحمض النووي لمتجه التحويل باستخدام مجموعة إعداد midi (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بتجانس 100 مل من تعليق خلية P. lacuna (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. قياس OD عند 750 نانومتر (القيمة المطلوبة = 0.35).
  5. جهاز الطرد المركزي لنظام تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة عند 6000 × جم. قم بإزالة السوبرناتانت ، الكريات في 800 ميكرولتر (الحجم الإجمالي بما في ذلك السائل المتبقي والشعيرات) من السائل المتبقي ووسط f / 2 + الإضافي.
  6. خذ ثمانية ألواح f/2+ bacto-agar (قطرها 10 سم) تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. ماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل لوحة أجار. ماصة على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا في منتصف كل لوحة أجار (على رأس الحمض النووي).
  7. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق اللوحة وازرعها في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
  8. قم بتوزيع خيوط كل صفيحة أجار مع حلقة تلقيح على عدة ألواح f/2+ bacto-agar طازجة تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. قم بزراعة الألواح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وتحقق من الثقافات بانتظام تحت المجهر.
  9. تحديد الخيوط الحية المحولة بعد 7-28 يوما تحت المجهر. ابحث عن خيوط خضراء صحية (الشكل 2) تختلف عن الخيوط الأخرى. إذا كان من الممكن تحديد هذه الخيوط الخضراء ، فتابع الخطوة التالية ؛ خلاف ذلك ، احتفظ باللوحة لمدة 7 أيام أخرى.
  10. استخدم الملقط لنقل هذه الخيوط الحية المحددة إلى 50 مل من السائل f/2+ الوسط مع 250 ميكروغرام / مل كاناميسين. تزرع في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر (دوران أفقي ، 50 دورة في الدقيقة). راقب النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
  11. انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط أجار يحتوي على 250 ميكروغرام / مل كاناميسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. بعد عدة أيام ، انقل خيوط مفردة إلى صفيحة أجار طازجة بتركيز أعلى من الكاناميسين ، على سبيل المثال ، 500 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة الأصلية.
  12. تأكد من نشر الخيوط بتركيز عال من الكاناميسين في الثقافة السائلة أو على الأجار. زيادة تركيز الكاناميسين مرة أخرى لتسريع الفصل.
    ملاحظة: تنمو الثغرة P. المحولة في ما يصل إلى 10000 ميكروغرام / مل كاناميسين. قد لا تتسامح الأنواع الأخرى مع مثل هذه التركيزات العالية.
  13. إذا نمت الخلايا المقاومة ووزعت على نطاق واسع على صفيحة ، فاختبر تكامل الإدراج في جينوم P. lacuna عن طريق إجراء PCR مع الاشعال الخارجي والداخلي.
    1. استخدم الاشعال التي تم تصميمها لاستنساخ الإدخال كاشعال داخلي.
    2. لتصميم الاشعال الخارجية ، حدد التسلسلات التي هي 5 ' و 3' من موقع الإدراج المقترح على جينوم P. ثغرة ولكن خارج الإدراج.
    3. بالنسبة لتفاعلات PCR ، استخدم الاشعال الداخلي والاشعال الخارجي. استخدم السلالة (السلالات) المقاومة والنوع البري.
      ملاحظة: تشير الاشعال الداخلية إلى أن الإدراج موجود؛ تظهر الاشعال الخارجية أن الإدراج يتم إدخاله في الموقع الصحيح.
  14. لكل تفاعل PCR ، ضع ~ 10 ملغ من الخيوط مباشرة في أنابيب PCR وقم بإجراء PCR وفقا للبروتوكولات القياسية24. إذا لم يتم الحصول على منتج ، فقم بتغيير درجة حرارة التلدين وغسل الخيوط بالماء.
    ملاحظة: يمكن استخدام العديد من البوليميراز المختلفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل. البوليميراز القياسية ، مثل بوليميراز Taq ، لديها معدل خطأ أعلى من البوليميراز التحقق من الأخطاء ، والتي هي أكثر تكلفة. لا يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل التحليلي هذا أي بوليميراز للتحقق من الأخطاء. ومع ذلك ، يجب اختبار البوليميراز الذي يتحقق من الأخطاء إذا لم يتم الحصول على منتج PCR باستخدام بوليميراز قياسي.
  15. تحليل منتجات PCR للخط المقاوم على الرحلان الكهربائي agarose24.
    1. قارن مواضع النطاق مع العلامة وقارن النوع البري والمحول. باستخدام الاشعال الداخلية والخارجية ، ابحث عن نطاق أكبر للمحول من النوع البري (بسبب إدخال كاسيت المقاومة) أو نطاقين للمحول: واحد بحجم النطاق البري وواحد أكبر. وبما أن الحالة الأخيرة تشير إلى الفصل غير المكتمل، استمر في الزراعة بتركيزات عالية من الكانامايسين.
      ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي، راجع15,24 أو غيرها من الأدبيات القياسية.
  16. بالنسبة لتعبير GFP: راقب الخيوط المفردة باستخدام مجهر التألق (انظر جدول المواد) عند تكبير الهدف المحدد عند 40x أو 63x. التقط صورة انتقال ساطعة وصورة تألق. استخدم الإعدادات التالية ل GFP: ممر النطاق الترددي 470 نانومتر للإثارة، وممر النطاق الترددي 525 نانومتر للانبعاثات، وفاصل شعاع 495 نانومتر، وقت التعرض الأولي 500 مللي ثانية.
  17. اضبط وقت التعرض للحصول على إشارات تألق واضحة ، وتجنب شدة التشبع. حاول استخدام نفس الإعداد لجميع العينات.
  18. نظرا لأن الخيوط من النوع البري ستعرض أيضا التألق ، فقم بالتقاط الصور بنفس الإعدادات المذكورة أعلاه لهذا التألق في الخلفية.
    ملاحظة: يجب أن يكون للسلالة التي تعبر عن GFP إشارة أعلى ؛ خلاف ذلك ، فإنه لا يعبر عن GFP.
  19. استنادا إلى أوقات التعرض وكثافة البكسل لصور التألق ، قم بحساب ومقارنة محتوى GFP للخيوط المختلفة.

4. الحفظ بالتبريد

ملاحظة: P. ثغرة والبكتيريا الزرقاء وحيدة الخلية Synechocystis sp. يتم استخدام PCC 6803. الطريقة الحالية تعمل بشكل أفضل مع P. ثغرة.

  1. زرع P. ثغرة أو Synechocystissp PCC 6803 لمدة 10 أيام على الأقل في 10 مل من f/2+ أو BG-11 المتوسطة ، على التوالي ، تحت الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) عند 25 درجة مئوية تحت الإثارة (الدوران الأفقي ، 50 دورة في الدقيقة).
  2. قم بتجانس ثقافة P. gapuna (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق أو باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة بكامل الطاقة. حدد OD 750 نانومتر لأي من الثقافتين للتحقق مما إذا كانت القيمة بين 1 و 7.
  3. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 15 دقيقة. إزالة supernatant.
  4. حبيبة الخلية في 800 ميكرولتر من f/2+ أو BG-11 متوسطة (الحجم النهائي) ونقلها إلى 2 مل من التبريد. أضف 800 ميكرولتر من محلول الجلسرين بنسبة 50٪ إلى تعليق الخلية. أغلق القارورة واخلطها عن طريق الانعكاس المتكرر.
  5. انقل المبرد إلى النيتروجين السائل وخزنه في صندوق تبريد في ثلاجة -80 درجة مئوية. لاحظ موضع الصندوق داخل الفريزر وإحداثيات العينة داخل الصندوق.
  6. لاستعادة الخلايا ، أخرج المبرد وقم بإذابة المحتويات في درجة حرارة الغرفة. انقل المحتويات إلى أنبوب تفاعل 2 مل.
  7. اغسل العينة مرتين. بالنسبة للغسيل1 ، يتم إجراء جهاز طرد مركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 2 مل من f/2+ أو BG-11 المتوسط. بالنسبة للغسيلالثاني ، أعد الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة السوبرناتانت ، الكريات في 2 مل من f / 2 + أو BG-11 المتوسطة.
  8. للتحقق من سلامة هذه الخلايا الجاهزة للزراعة ، انقل الكريات إلى 9 مل من الوسط وزرعها في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) تحت الإثارة (55 دورة في الدقيقة). قارن OD 750 نانومتر من الثقافة في اليوم الأول وبعد أسبوع 1.

5. حركية ثغرة الفيرميديوم

ملاحظة: سيتم وصف ثلاثة اختبارات مختلفة. يتم استخدام نفس الثقافة في جميع الحالات.

  1. زرع P. ثغرة في f/2 وسط تحت التحريض الأفقي (50 دورة في الدقيقة) في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) لمدة 5 أيام تقريبا حتى OD 750 نانومتر المقدر هو 0.35. تخزين العينة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بتجانس الخيوط (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق أو باستخدام الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة دقيقة واحدة عند أقصى طاقة ودورة 1. قياس OD 750 نانومتر. إذا كان أعلى من 0.35 ، فقم بتخفيف الكسر باستخدام f / 2 متوسط. استخدم هذا الحل في مقايسات الحركة في الخطوات 5.3 و5.4 و5.5.
  3. فحص الحركة في الوسط السائل
    1. للمراقبة المباشرة للحركية ، انقل 8 مل من الوسط الذي يحتوي على P. gapuna (من الخطوة 5.2) إلى طبق بتري 6 سم. انتظر بضع دقائق حتى تصل العينة إلى درجة حرارة الغرفة. غطي طبق بتري بورق السيلوفان.
    2. ضع شريحة مجهر على طاولة x-y الخاصة بالمجهر القياسي باستخدام كاميرا. قم بتشغيل ضوء المجهر. من الناحية المثالية ، استخدم دائما نفس الإعدادات الكهربائية والبصرية للإضاءة. انقل هدفا 4x أو 10x إلى مسار الضوء.
    3. ضع طبق بتري فوق الشريحة. اضبط الخيوط المفردة أو حزم الخيوط بواسطة حركات x و y و z للجدول.
      ملاحظة: نظرا للترتيب ثلاثي الأبعاد ، يمكن التركيز فقط على جزء من القسم ذي الصلة. تسمح رقائق السيلوفان بضبط التركيز دون قيود.
    4. راقب حركات الخيوط أو الحزم المفردة. تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تلمس السائل. سجل حركات الخيوط باستخدام كاميرا مجهر قياسية (انظر الفيديو التكميلي S1).
  4. فحص الحركة على السطح
    1. لمراقبة حركة الخيوط على أسطح الأجار ، قم بإعداد أطباق بتري 6 سم مع f/2 bacto-agar. تأكد من أن الأجار مرتفع بما يكفي للعدسة الموضوعية للاقتراب من سطح الأجار. بدلا من ذلك ، قم بإعداد طبقة أجار بسماكة ~ 3 مم وسجل الخيوط من خلال الأجار (احتفظ باللوحة رأسا على عقب أو استخدم مجهرا مقلوبا).
    2. ماصة 0.5 مل من محلول يحتوي على P. ثغرة (من الخطوة 5.2) على سطح باكتو أجار لطبق بتري 6 سم. اسمح للسائل بدخول السطح. أغلق طبق بتري وراقب حركة الخيوط على السطح باستخدام هدف 4x أو 10x.
    3. تأكد من استخدام نفس الإعدادات الكهربائية والبصرية للمجهر طوال التسجيل وفي التسجيلات اللاحقة.
    4. التقط تسجيلات بفاصل زمني باستخدام كاميرا العين ونظام الكمبيوتر الصغير. تأكد من أن الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة هو 5 s-1 دقيقة. قم ببرمجة البرنامج النصي Linux للكمبيوتر الصغير للتحكم في تسجيل الفاصل الزمني. راجع الملف التكميلي 2 للحصول على مثال على البرنامج النصي والفيديو التكميلي S2 كمثال.
  5. فحص التاكسي الضوئي
    1. بالنسبة لتجارب التاكسي الضوئي ، قم بإعداد حاملات الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (هنا ، باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد) حيث يتم تركيب مصابيح LED المحددة مقاس 5 مم لتشعيع مساحة 20 مم2 من الأسفل إلى الأعلى (الشكل 3). إذا لزم الأمر ، استخدم العديد من حاملات LED بالتوازي ، وقم بتوصيل كل LED كهربائيا من خلال مقاوم ومقياس جهد بمصدر طاقة قابل للتعديل. قياس وضبط كثافة LED ، اعتمادا على التجربة. تأكد من أن الإعداد بأكمله في غرفة مظلمة أو حاوية مظلمة مغلقة.
    2. ضع 8 مل من الوسط الذي يحتوي على P. gapuna (من الخطوة 5.2) في طبق بتري 6 سم. اضبط شدة الضوء لمؤشر LED. أغلق طبق بتري بالغطاء وضعه على حامل LED بحيث يكون LED في وسط طبق Petri.
    3. بعد المدة المطلوبة (عادة 2 أيام) ، التقط صورة لطبق Petri باستخدام كاميرا هاتف ذكي تستهدف مباشرة موضع المعالجة الخفيفة. استخدم لوحة LED بيضاء لتشعيع العينة. استخدم الإعدادات اليدوية للكاميرا ؛ تجنب انعكاسات الضوء. اضبط دائما للحصول على نفس المسافة بين عدسة الكاميرا والعينة. تأكد من أن إعدادات التعريض الضوئي تعطي صورة مناسبة للتحليلات اللاحقة باستخدام ImageJ.
    4. حدد قطر الدائرة المركزية للخيوط باستخدام برنامج ImageJ.
      1. افتح ImageJ، انقر على ملف | فتح، وحدد الملف المطلوب، وانقر فوق Enter.
      2. حدد الزر مستقيم (بخط مستقيم ). اضغط على زر الماوس الأيسر لرسم خط من أحد طرفي طبق بتري إلى الطرف الآخر. تأكد من أن الخط يمر عبر مركز دائرة الخيوط.
      3. اضغط على Ctrl-K على لوحة المفاتيح أو انقر فوق تحليل | رسم ملف التعريف في قائمة ImageJ. ابحث عن نافذة x-y مع كثافة بكسل مرسومة مقابل المسافة - ملف تعريف 1D لطبق Petri. تأكد من أن أقل كثافة بكسل أعلى قليلا من 0 وأعلى قيمة أقل من 255.
      4. تقدير قيمة متوسطة لكثافة البيكسل خارج الدائرة وقيمة متوسطة أخرى لكثافة البيكسل في الدائرة. عند الموضع y بين هذه القيم، قم بتقدير قيم x لجانبي الدائرة عن طريق الإشارة بالماوس إلى هذه المراكز. لاحظ كلا القيمتين واحسب الفرق.
      5. احصل على أعلى قيمة x عن طريق توجيه الماوس إلى المحور y على اليمين. لاحظ أن هذه القيمة e تمثل قطر طبق بتري. إذا كان هذا القطر 5 سم، فاحسب قطر دائرة الخيوط المركزية على أنه d/e × 5 سم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وباتباع الطرق المذكورة أعلاه، عزلت 5 سلالات مختلفة من الثغرة المتصورة من برك الصخور وتسلسلت (الشكل 1 والجدول 1). كانت جميع الثقافات عقيمة بعد ~ 1 سنة من الزراعة الفرعية باستثناء P. lacuna HE10JO. لا تزال هذه السلالة ملوثة بماريفيرغا أتلانتيك ، وهي بكتيريا بحرية. خلال رحلات هيلغولاند اللاحقة ، تم عزل البكتيريا الزرقاء الخيطية الأخرى من برك الصخور ، والتي تختلف عن P. ثغرة وتحتاج إلى توصيف.

تم اختبار العدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن العديد من سلالات البكتيريا الزرقاء متوفرة من مجموعات الاستزراع32،33،34،35،36 ، لا يزال هناك طلب على البكتيريا الزرقاء الجديدة من البرية لأن هذه الأنواع تتكيف مع خصائص محددة. تم جمع P. ثغرة من برك الصخور ويتم تكييفها مع الاختلافات في تركيزات الملح ودرجة الحرارة30. تم العثور على سلالات من هذا النوع خلال الرحلات في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل من قبل معهد كارلسروهر للتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأوتوكلاف 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
باكتو أجارأوتونوروالد214010
BG-11 محلول المياه العذبةسيجما ألدريتشC3061
BG-11 متوسطميرك73816-250 مل
حمض البوريكميرك 10043-35-3H3< / sub>BO3< / sub>
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيومكارل روث10035-04-8CaCl2< / sub> & middot ؛ 2 H2< / sub>O
قوارير ثقافة الخلية Cellstar مع غطاء برغي مرشح ، معقم ، 250 ملGreiner658190
قوارير زراعة الخلايا Cellstar مع غطاء لولبي مرشح ، معقم ، 50 ملGreiner601975
جهاز طرد مركزي LYNX 4000Thermo Scientific75006580والدوار
جهاز الطرد المركزي microstar 17VWR InternationalN / Aلما يصل إلى 13,000 دورة في الدقيقة
Cetyltrimethylammonium broomide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19< / sub>H42< / sub>BrN
الكلوروفورم: كحول الأيزواميل 24: 1PanReac AppliChem
A1935
الكوبالت (II) كلوريد سداسي الهيدراتMerck7791-13-1CoCl2 & middot; 6 H2O
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدراتMerck7758-99-8  CuSO4< / sub> & middot ؛ 5 H2O
D(+)-BiotinCarl Roth58-85-5  C10< / sub>H16< / sub>N2O3< / sub>S
سلم الحمض النووي 1 كيلو بايتنيو إنجلاند بيولابزN3232
سلم الحمض النووي 100 نقطة أساسنيو إنجلاند بيولابسN3231
الماصة الكهربائية في Accujet-pro SBrand GmbH26360لسحب العينات 1-25 مل
الإيثانولVWR64-17-5C2< / sub>H6< / sub>O
إيثيلين ديامين حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات ملح ثنائي الهيدراتكارل روث6381-92-6EDTA-Na 2< / sub> & middot ؛ 2 H2< / sub>O
مجهر مضان ApoTomeZeiss
مجهر مضان Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cellشركة الأدوات الأمريكيةN / A
نظام documation هلام Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One / -exuADVANCED
Glassware ، مختلف
الجلسرينكارل روث56-81-5C3< / sub>H8< / sub>O3< / sub>
Iron (III) كلوريد سداسي هيدراتMerck10025-77-1  FeCl3 & middot; 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
كبريتات كاناميسينكارل روث25389-94-0C18H36N4O11 & middot; H2SO4
Lauroylsarcosine, ملح الصوديوم (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 & middot; Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
مصدر الضوء ، أنبوب الفلورسنت L18W / 954 ضوء النهارزراعة OSRAMللبكتيريا الزرقاء
مصدر الضوء ، لوحة LED XL 6500K 140 WBloom StarN / Aزراعة البكتيريا الزرقاء ، حتى 1,000 & micro ؛ مول M-2< / SUP> S-1< / sup>
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومكارل روث7791-18-6MgCl2< / sub> & middot ؛ 6 H2< / sub>O
المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدراتServa13446-34-9MnCl2< / sub> & middot ؛ 4 H2< / sub>O
مجهر DM750Zeiss
طقم استخراج البلازميد الإعدادي ميدي مجموعة NucleoBond Xtra MidiMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
كمبيوتر صغير Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDلتسجيل الفاصل الزمني
كاميرا العين EC3Leicaللتسجيل المستمر حتى 30 ثانية
كاميرا العين MikrOkular Full HDBresserلتسجيلات الفاصل الزمني ، إلى جانب الكمبيوتر الصغير Raspberry Pi
أطباق Petri متعددة الستايرول ، 100 مم × 20 ممMerckP5606-400EA
أطباق بتري بوليسترول ، 60 مم × 15 ممMerckP5481-500EA
مقياس ضوئي Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 & micro; LGilsonرمز المنتج: FA10006M
Pipetman 10-100 & micro; LGilsonرمز المنتج: FA10004M
ماصات بلاستيك 10 مل ،معقم Greiner607107
أنبوب بلاستيك ، معقم ، 15 ملGreiner188271
أنبوب بلاستيك ، معقم ، 50 ملGreiner227261
بروميد البوتاسيومكارل روث7758-02-3KBr
كلوريد البوتاسيومكارل روث7447-40-7KCl
مزود الطاقة Statron 3252-1Statron Gerä ؛ tetechnik GmbH
مزود الطاقة Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsل LED
Proteinase KPromegaMC500Cمن Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymeraseNew England BiolabsM0491S
مجموعة التسلسل NextSeq 500/550 v2.5Illumina
نظام التسلسل NextSeq 550 SY-415-1002إلومينا
شاكر يونيماكس 2010هايدولفللزراعة
أسيتات الصوديومكارلروث 127-09-3NaCH3< / sub>COO
كلوريد الصوديومكارل روث7647-14-5كلوريد الصوديوم
ثنائي هيدروجين فوسفات أحادي الهيدراتكارلروث 10049-21-5NaH2PO4 · H2< / sub>O
فلوريد الصوديومكارل روث7681-49-4NaF
كربونات هيدروجين الصوديومكارلروث 144-55-8NaHCO3< / sub>
الصوديوم ثنائيهيدرات Serva10102-40-6Na2< / sub>MoO4< / sub> & middot ؛ 2 H2< / sub>O
نترات الصوديومميرك7631-99-4NaNO3
كبريتات الصوديومكارل روث7757-82-6Na2SO4
سداسي هيدرات كلوريد السترونتيومكارلروث 10025-70-4SrCl2 & middot; 6 H2O
هيدروكلوريد الثيامينميرك67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
تريسكارل روث77-86-1C4< / sub>H11< / sub>NO3< / sub>
جهاز الموجات فوق الصوتية UP100H مع سونوترودي MS3Hielscher تقنية الموجات فوق الصوتيةUP100H
Ultraturrax كسارة صامتة MHeidolph Instrumentsالخالط
اليورياكارل روث57-13-6CH4< / sub>N2O
فيتامين B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
محلول0.3 & micro; M thiamin-HCl ، 2.1 نانومتر بيوتين ، 0.37 نانومتر سيانوكوبالامين
لقطات المياه ، معالجة المياهتقنيات المياه VEOLIAELGA_21001
كبريتات الزنك سباعي هيدراتسيجما7446-20-0ZnSO4< / sub> & middot ؛ 7 H2< / sub>O
software ، برنامج URL< / strong>
gatb-minia لتجميعالحمض النوويhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelineيصنع سقالات كبيرة من قراءات الحمض النووي القصيرة ،
لمعالجة immagage (شدة البكسل ، قطر الدائرة) إدخال
>
مياه البحر الاصطناعية0.41 م كلوريد الصوديوم ، 53 ملي مولار كلوريد الصوديوم < الفرعي >2،< / فرعي >28 ملي مولار Na2< / sub>SO4< / sub> ، 10 ملي مولار CaCl 2< / sub> ، 9 mM & nbsp ؛ KCl ، 2.4 ملي مولار NaHCO3 < / sub> ، 0.84 مللي متر كيلوبايت ، 0.49 ملي متر H3< / sub>BO3< / sub> ، 90 وميكرو ؛ M SrCl2< / sub> ، 72 & micro ؛ M NaF
f / 2 - مياهالبحر الاصطناعية المتوسطة السائلة ، محلول العناصر النزرة 0.1٪ (v / v) ، محلول فيتامين 0.05٪ (v / v) ، 0.88 ملي مولار NaNO 3< / sub> ، 36 & micro ؛ M NaH2PO4 
f / 2 + < / sup> السائل المتوسطf / 2-medium ، مع زيادة 10 مرات NaNO 3< / sub > و NaH 2< / sub >PO 4 < / sub > (0.88 mM NaNO 3< / sub > ، 36 & micro ؛ M NaH2PO4
f/2+-agar3٪ (وزن/حجم) باكتو أجار، مياه البحر الاصطناعية، محلول العناصر النزرة 0.1٪، محلول فيتامين 0.05٪، 8.8 ملي مولار أحاديد الصوديوم3، 0.36 ملي مولار NaH2PO4
f/2-agar3٪ (وزن / حجم) باكتو أجار ، مياه البحر الاصطناعية ، 0.1٪ (حجم / حجم) محلول العناصر النزرة ، 0.05٪ (حجم / حجم) محلول فيتامين ، 0.88 ملي نيو أكسيد < فرعي >3< / فرعي > ، 36 وميكرو ؛ M NaH2PO4
محلول العناصر النزرة0.36 mM NaH2PO4, 12 & micro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 وميكرو ؛ M MnCl2< / sub>
Vitamin محلول0.3 & micro; M thiamin-HCl ، 2.1 نانومتر بيوتين ، 0.37 نانومتر سيانوكوبالامين
تساعد Press مجموعة أدوات موليبدات فيتامين وبرنامج ImageJ المستند إلى Linux خادم التعليقات التوضيحية RAST https://rast.nmpdr.org: تسلسل الحمض النووي للجينوم ، ويكتشف إطارات القراءة المفتوحة ، ويسرد تسلسل البروتين ووظائفها<قوية > ووسائط ثقافية < / قوية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515(2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440(2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454(2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة