يوفر بروتوكول المسافة البادئة المجهرية للقوة الذرية إمكانية تشريح دور الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية لخلية معينة من نسيج أو عضو أثناء النمو الطبيعي أو المقيد (أي تحت عجز الماء).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجهر القوة الذرية لدراسة الخواص الفيزيائية لخلايا البشرة لجذور الأرابيدوبسيس الحية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم وصف طريقة هنا لتوصيف الخصائص الفيزيائية للجدار الخلوي لخلايا البشرة لجذور Arabidopsis الحية من خلال المسافات البادئة النانوية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) إلى جانب مجهر مضان بصري مقلوب. تتكون الطريقة من تطبيق قوى مضبوطة على العينة أثناء قياس تشوهها ، مما يسمح بتحديد المعلمات مثل معامل يونغ الظاهر لجدران الخلايا بدقة تحت خلوية. يتطلب تجميدا ميكانيكيا دقيقا للعينة والاختيار الصحيح للمسافة البادئة وأعماق المسافة البادئة. على الرغم من أنه لا يمكن استخدامه إلا في الأنسجة الخارجية ، إلا أن هذه الطريقة تسمح بتوصيف التغيرات الميكانيكية في جدران الخلايا النباتية أثناء التطور وتمكن من ارتباط هذه التغييرات المجهرية بنمو عضو بأكمله.
المقدمة
الخلايا النباتية محاطة بجدار خلوي عبارة عن بنية معقدة تتكون من شبكات متفاعلة من السكريات والبروتينات والمستقلبات والماء الذي يختلف سمكه من 0.1 إلى عدة ميكرومتر حسب نوع الخلية ومرحلة النمو 1,2. تلعب الخواص الميكانيكية لجدار الخلية دورا أساسيا في نمو النباتات. تم اقتراح قيم صلابة منخفضة لجدار الخلية كشرط مسبق لنمو الخلايا وتوسيع جدار الخلية ، وهناك أدلة متزايدة على أن جميع الخلايا تستشعر القوى الميكانيكية لأداء وظائفها. ومع ذلك ، لا يزال هناك جدل حول ما إذا كانت التغييرات في الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية تحدد مصير الخلية2،3،4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير المواد النباتية وظروف النمو
- لتوليد المواد النباتية اللازمة ، قم بتعقيم بذور نوع Arabidopsis البري وخطوط الاهتمام الطافرة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، استخدمنا ما يلي: ttl1: خطوط إدخال T-DNA Salk_063943 (ل TTL1; AT1G53300) - كولومبيا-0 (Col-0) من النوع البري ؛ طفرة Procuste1 (prc1-1) ، والتي تتكون من طفرة خروج المغلوب (Q720stop) في جين CESA6 (AT5G64740) ، كما هو موضح سابقا في10,11 ؛ و TTL1 X PRC1-1 متحولة مزدوجة.- ضع حجما تقريبيا يبلغ 50 ميكرولتر من البذور في أنبوب صغير. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول + 0.01٪ محل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تجارب القوة البادئة
يعرض النص التالي بعض النتائج المتوقعة عند إجراء تجربة المسافة البادئة للقوة لإظهار الناتج النموذجي المتوقع عند تنفيذ البروتوكول بشكل جيد.
منحنيات إزاحة القوة
يتم عرض مخططات المسافة البادئة للقوة التمثيلية التي تم الحصول عليها لوضع مسافة بادئة للعينات الحية في موضع موضوع في وسط خلية منطقة استطالة الجذر في الشكل 2. عندما يبدأ طرف AFM في وضع مسافة بادئة لسطح جدار الخلية ، تبدأ القوة في الزيادة (المشار إليها .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أصبحت ميكانيكا الخلايا والجدران الخلوية ذات صلة بشكل متزايد لاكتساب نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الميكانيكا على عمليات النمو. مع انتشار القوى الفيزيائية على مسافات كبيرة في الأنسجة الصلبة ، أصبحت دراسة التغيرات في الخصائص الفيزيائية للجدار الخلوي وكيفية استشعارها والتحكم فيها وضبطها وتأثيرها على نمو النبات مجالا مهما للدراسة2،3،8.
يتم تقديم طريقة هنا لدراسة الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية للخلايا في منط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح. يتوفر البرنامج النصي MATLAB المستخدم لتركيب البيانات بناء على طلب شخصي عن طريق الكتابة إلى J. C. B.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل CSIC I + D 2018 ، المنحة رقم 95 (ماريانا سوتيلو سيلفيرا). CSIC Grupos (عمر بورساني) و PEDECIBA.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 × محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | تشمل كلوريد الصوديوم وعازلة الفوسفات وهي مصممة لمنع الصدمات التناضحية والحفاظ على توازن الماء في الخلايا الحية. | ||
| برنامج AFM | Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| المجهري للقوة الذرية (AFM) BioScope | Catalyst ، Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Catalyst Probe holder - السائل | Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | cat-FCH | حامل مسبار لمحفز المنظار الحيوي ، المصمم لتشغيل السوائل في التلامس أو وضع التنصت. متوافق أيضا مع تشغيل الهواء. |
| مقياس التناضح بالتبريد؛ نموذج OSMOMAT 030 | Gonotech، برلين، ألمانيا | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | التركيز الأصلي ، (1962) |
| مجهر مقلوب بصري مقترن ب AFM | Olympus IX81 ، ميامي ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| PEGAMIL | Anaerobicos SRL ، بوينس آيرس ، الأرجنتين | 100429 | أحاديث ، غير حمضية سيليكون غراء |
| أطباق بتري | Deltalab | 200201.B | بوليسترين ، 55 × 14 مم ، معقم إشعاعي. |
| بروبيديوم يوديد | سيجما | P4170 | لاختبار جدوى الجذر. |
| مسبار نيتريد السيليكون ، DNP-10 ، الكابولي A | Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | DNP-10 / A | للفحص المجهري لتعديل القوة في التشغيل السائل. نصف قطر طرف المسبار 20-60 نانومتر. 175-& ناتئ مثلث طويل ، ؛ بثابت زنبركي يساوي 0.35 نيوتن / م. |
| ملاقط | سيجما | T4537 |
المراجع
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
