هندسة العوامل المضادة للفيروسات عبر رنين البلازمون السطحي

يتم تحفيز النشاط المضاد للفيروسات المرتبط ب Tetherin بواسطة α الإنترفيرون ، وهو يشتمل على حبال قائمة على البروتين ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالفيروسات المشكلة بالكامل على أسطح الخلايا المصابة¹. لا تزال ضرورة غليكوزيل التيثرين في تثبيط إطلاق الفيروس غير مؤكدة ، مما يعني أهمية أنماط الجليكوزيل على الجليكان المعبر عنه بشكل مؤتلف للدراسات المختبرية ^1,2 ، والتي تعتمد على تشكيل (في حالة فيروس الأنفلونزا) الأنفلونزا المعبر عنها سطحيا هيماغلوتينين HA ^3,4 . وقد لوحظ أن تعديل قليل السكاريد المربوط بالجليكوزيل المرتبط ب N يكفي لتقييد إطلاق فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1^بوساطة التيثرين 2 ، بينما يلعب dimerization دورا أساسيا في منع إطلاق الفيروس ، وبالتالي إشراك المجال عبر الغشاء أو مرساة جليكوزيل فوسفاتيديل إينوسيتول (GPI) لربط الفيروسات الناشئة⁵ . يتم وصف الميزات الفريدة للحبل البشري والفئران لمنع العديد من الفيروسات المغلفة والفيروسات القهقرية والفيروسات الخيطية. BST-2 / tetherin هو بروتين مضاد للفيروسات يمكن تحريضه بواسطة الإنترفيرون للمناعة الفطرية ^1,6 ، ويعمل مع نشاط مضاد للفيروسات واسع الطيف ويتم معاداته بواسطة البروتينات السكرية المغلفة⁵ إما لنقل التيثرين أو تعطيل بنية التيثرين ⁶. على سبيل المثال ، يعرف البروتين السكري المغلف المعبر عنه سطحيا HA والنورامينيداز على فيروس الأنفلونزا A بمعاداة التيثرين بطريقة خاصة بالسلالة⁷ ، مما يسهل التعرف على مواقع ربط مستقبلات المضيف⁸. تتم دراسة الأجسام المضادة التي تستهدف الجليكان في القياس المتكافئ لتفاعلاتها مع دروع الجليكان سريعة التخصيص على HA ، مما يؤدي إلى تقارب ملزم بالنوعين الفرعيين⁴ من الأنفلونزا A H3N2 و H1N1.

لتوضيح آليات الربط بين العوامل المضادة للفيروسات وطفرات غلاف الفيروس ، أي روابط الكربوهيدرات ، والطرق المناعية والطيفية التكميلية ، يتم تصنيع شقوق أحادية وثنائية وثلاثية مانوز كيميائيا. يتم إنشاء الببتيدات المانوسيلية عن طريق أزيدو جليكوزيل من جليكوزيل {بيتا}-بيراسيتات إلى 1،2-trans glycosyl azides^{تحويل 9} ، مما يحاكي الجلوكوزامين N-acetyl الموجود عادة وقليل السكاريد عالي المانوز على سطح الفيروسات التي تهدد الحياة. تستخدم الإيزوكوسترات الحيوية التريازول لتقليد الروابط التي تشكل بقايا مانوسيلات من ببتيد HA¹⁰ وتسهيل التفاعلات الخاصة بالموقع مع مشتقات CV-N المضادة للفيروسات حول بقعة الجليكوزيل الثانية المرتبطة ب N على مجال رأس HA (قمة HA مع 4 جليكان مرتبط ب N N54 ، N97 ، N181 ، N301) ⁸،^11،12 . أظهرت التفاعلات بين حمض الجلوتاميك (Glu) والأرجينين (Arg) وثنائي القطب الحلزوني الناتج استقرارا جيدا لكل من الببتيدات النموذجية والبروتينات ولكن يتم تصورها باستخدام SPR. إذا ما قورنت بالتعرف على موقع جليكوزيل واحد مركب كيميائيا على HA¹⁰ عن طريق تثبيط ارتباط المستقبلات مباشرة على شقوق الجليكان ، فإن التقارب الأعلى لهيكل Fc المتحور المكون من أربعة مواقع لمستقبلاته يظهر أنه يستنبط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، مما يكشف عن التركيب غير ذي الصلة للجليكان المرتبط ب N المرتبط بمتحولة Fc ليتم تحديده ميكانيكيا¹³.

يعرض CV-N نشاطا مضادا للفيروسات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 14،15 والإنفلونزا¹⁶ وفيروس الإيبولا ، والذي يتم بوساطة الارتباط النانوي بتعديلات قليل السكاريد عالية المانوز على بروتينات سبايك المغلف 12،17،^18،19. تم تحديد ارتباط الأنفلونزا HA بموقع واحد عالي التقارب لربط الكربوهيدرات (H) في CV-N أو اثنين من Hs في CVN2 ثنائي الارتباط تساهميا للحصول على ثوابت تفكك التوازن (K D) = 5.7 نانومتر (الشكل 1A) و K_D = 2.7 نانومتر ، على التوالي. يحتوي كل من CV-N و CVN2 على واحد أو اثنين من مواقع ربط الكربوهيدرات منخفضة التقارب (L) s¹²،¹⁷،^20،21. يرتبط الإيبولا GP1,2 ب 2H من CVN2 مع تقارب في النطاق النانوي السفلي (K_D = 26 نانومتر). يظهر ارتباط CV-N WT بالإيبولا GP1,2 و HA صلات من K D = 34 نانومتر إلى K_D = 5.7 نانومتر (A / New York / 55/04)¹². الليكتين ، مثل CV-N ، الذي يستهدف على وجه التحديد جليكان عالي المانوز على الأظرف الفيروسية ، يمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد C ، و SARS-CoV ، وفيروس الهربس ، وفيروس ماربورغ ، وفيروس الحصبة²².

تمت دراسة جزيء CV-N الصغير بدقة لأكثر من 20 عاما لأنه يعمل على ربط مجموعة واسعة من الفيروسات لمنع دخول الفيروس^16,18. تشير التحليلات الهيكلية ومقايسات تقارب الربط إلى الربط المتقاطع لاثنين من Ls في ثنائي CVN2 المبادل بالمجال عن طريق الارتباط ثنائي التكافؤ في نطاق micromolar لتعزيز الحساسية للبروتينات السكرية المغلفة الفيروسية^10,19. يتكون الارتباط الانتقائي ل Manα1-2Manα على أذرع Man(8) D1D3 و Man(9) من موقعين ملزمين لهما صلات مختلفة يقعان على بروتومرات البروتين^{المعاكسة 20} ، وبالتالي الوصول إلى تقارب الارتباط النانوي (الشكل 1B). وبالتالي ، يعتبر CVN2 جسما مضادا زائفا فيما يتعلق بتطبيقه لربط الحواتم على فيروس نقص المناعة البشرية gp120 ، على غرار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس¹⁷. هنا ، يهتم المؤلف بالتحقيق في الارتباط المحتمل ل CVN2 بارتفاع SARS-CoV-2 عبر مجال ربط المستقبلات (RBD). تؤدي منحنيات الربط للإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 مع SARS-CoV-2 RBD إلى K_D = 4.7 نانومتر لهذا التفاعل المرتبط بيولوجيا²³.

على النقيض من ذلك ، تتعرف فئات الغلوبولين المناعي المختارة على أنماط البروتين الهيكلية المحددة والمتسقة ، والتي تضفي ركيزة لنضج التقارب في مناطق HA المثبتة بالغشاء²⁴. يظهر CV-N نشاطا قويا للغاية في جميع فيروسات الأنفلونزا A و B تقريبا¹⁶ ، وهو عامل مضاد للفيروسات على نطاق واسع. معرفتنا غير مكتملة حول موقع الحلقات المستهدفة على جذع HA1 و HA2 والتي ربما تتضمن هياكل epitopic لاستهداف الجليكان بواسطة أجسام مضادة شديدة التحييد وبالمقارنة مع ربط الليكتين²⁵.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة ربط SPR ل CV-N إلى طفرات غلاف الفيروس. (أ) مقايسة SPR لربط CV-N بالليجند: بروتين HA كامل الطول (90 كيلو دالتون). مجموعة البيانات الحركية (5120 ، 2560 ، 1280 ، 640 ، 320 ، 160 ، 80 ، 40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 0 نانومتر) تظهر الارتباط المرجعي المزدوج في الوقت الفعلي بالأنفلونزا HA A / New-York / 55/04 (H3N2). (B) ارتباط متغير CVN2L0 V2 بربط DM المجمد ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 500 نانومتر و 16 ميكرومتر. التسلسل: يتم تمييز بقايا L باللون الأصفر. يتم تمييز بقايا H باللون الرمادي. E58 و R73 هما بديل للسيستين في البروتين البري ويجعلان V2 طية بروتين مستقرة مع ثلاثة بدلا من أربعة روابط ثاني كبريتيد الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في حين أن درع الجليكان الموجود على الجزء العلوي من HA البعيد الغشائي يحفز ارتباطا عالي التقارب ب CV-N 12 ، فقد لوحظ ارتباط CVN2 ب HA المجاور لجسر ثاني كبريتيد الجزء العلوي من HA في مواقعه منخفضة التقارب^10,12. يتم تحديد التفاعلات القطبية المختلفة ومواقع التفاعل في ربط الكربوهيدرات بواسطة CV-N. يتم التحقق من هذه التفاعلات عن طريق توليد متغيرات خروج المغلوب في موقع الربط لربط صلات الربط في السيليكو المتوقع^{جليكوزيل 12}. وبالتالي ، يهدف المشروع إلى مقارنة ببتيدات HA التي تم اختبارها كيميائيا سابقا في تقارب وخصوصية ملزمة مع تسلسلات ببتيد قصيرة من طفرات 2019-nCoV المرتبطة بالسارس و SARS-CoV-2 ، والتي تحدث بشكل طبيعي معدلة بواسطة عدد صغير من مواقع الجليكوزيل المختلفة المرتبطة ب N والجليكوزيل المرتبط ب O. باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد وفحوصات الربط ، أبلغ بينتو وزملاؤه عن جسم مضاد أحادي النسيلة ، S309 ، من المحتمل أن يتعرف على حاتم على بروتين سبايك SARS-CoV-2 يحتوي على جليكان محفوظ داخل الجنس الفرعي لفيروس Sarbecovirus ، دون التنافس مع مرفق المستقبل²⁶. يصف بروتوكول هذه الدراسة مدى أهمية تصميم متغيرات CV-N والتعبير عنها وتوصيفها لدراسة كيفية ارتباط CV-N و CVN2 بالبروتينات الغليكوزيلاتية والببتيدات الاصطناعية باستخدام تقنية SPR^10,12.

يتم التعبير عن ثنائي التدوير المرتبط بالترادف CVN2L0²⁷ ومتغيرات موقع الربط (V2-V5) بشكل مؤتلف والمتغيرات مع بدائل رابطة ثاني كبريتيد (C58E و C73R) (الشكل 2 أ). أيضا ، يتم إعداد طفرة مع طفرة أحادية النقطة E41A لأن هذا الموقف ينظر إليه على أنه بقايا تلامس بين الجزيئات. هذا الطفرة هي جزيء آخر مثير للاهتمام لقياسات ربط SPR بين الليكتين والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز التي تفك رموز مجالات الربط وتسمح بالمقارنة مع الشكل الثنائي. يظهر الهيكل البلوري المبدل المجال ل CVN2 رابطا مرنا يمتد بين 49 و 54 بقايا. يمكن أن يستمر المجالان في التحرك حول المفصلة كأجسام صلبة ، ويطوران إما مونومر من خلال تفاعلات المجال داخل الجزيئات (المجال A - بقايا 1-39 ؛ 90-101- مع المجال B - بقايا 40-89) أو ثنائي عن طريق تبديل المجال بين الجزيئات [المجال A (من المونومر الأول) مع المجال B (من الثاني) ، والمجال B (من المونومر الأول) مع المجال A (من النسخة الثانية)]. لا توجد تفاعلات وثيقة بين المجالين A و B للأوليين ، باستثناء Glu41²⁸. يمكن تطوير جين CV-N باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة مع أوليغوس²⁹ المركب 40 مير ثم يتم استنساخه في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية كما وصفها Keeffe، J.R.27. يتضمن البروتين ، الذي يستخدم لتحقيق البنية البلورية المعنية (PDB ID 3S3Y) ، علامة تنقية N-terminal 6-histidine متبوعة بموقع انقسام البروتياز العامل Xa. يستخدم الطفرات الموجهة للموقع لعمل طفرات نقطية ، وتبديل الكودونات ، وإدخال أو حذف قواعد أو كودونات مفردة أو متعددة لتبادل الأحماض الأمينية. توفر هذه التحولات نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن في وظيفة البروتين وهيكله. تمت دراسة CV-N و CVN2 و CVN3 المعبر عنها وتنقيتها بشكل جيد من الناحية الفيزيائية الحيوية²⁰،²¹،²⁷ ، وهي رخيصة الإنتاج ^، وبالتالي تستخدم لتوصيف مقايسات الربط بالجليكان المثبت على رقائق مستشعر SPR. يوفر مقايسة الممتز المناعي التقليدي المرتبط بالإنزيم (ELISA) قابلية استنساخ أقل فيما يتعلق بتقنية تجميد روابط الجليكان ويحول الارتباط في الوقت الفعلي لمتغيرات موقع الربط المختلفة ، والتي تظهر ل SPR ، إلى مقايسات نقطة النهاية.

يتم التعبير عن متغير التقارب المرتبط CVN2L0-V2 (طية سليمة من CV-N المتجانس مع استبدال جسر ثاني كبريتيد¹⁰) بعلامة His-tag في الإشريكية القولونية (E. coli) ، ويتم تنقيتها فوق عمود Ni-NTA باستخدام كروماتوغرافيا التقارب واختبارها للارتباط ب HA (H3N2) ، ببتيد HA-أحادي المانوسيلات وببتيد HA-ثنائي المانوسيلات باستخدام SPR. الببتيدات المانوسيلية كيميائيا ، أو بروتين HA و S ، كلها روابط وأمين مقترنة بسطح الرقاقة المحبة للماء عن طريق الإسترات التفاعلية أو هندسة بروتين البيوتين ستربتافيدين. يتم تطبيق نفس الإجراء الخاص بالتشغيل المتسلسل على تلك الروابط ، وحقن التخفيفات المختلفة ل CV-N ومتغيرات CV-N (و CVN2) للحصول على معلومات حركية لتحليلات التفاعل الجزيئي كما هو موضح أدناه³⁰. تستخدم رقاقة مستشعر SPR المجمدة RBD لدراسات الربط على ببتيدات CV-N إلى S ، وتتم مقارنة الصلات بربط SARS-CoV-2 مع ACE2 البشري.

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام بروتين اندماج صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) CVN في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم بدلا من CV-N وهو مناسب للمقايسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على بروتين HA H3 لفيروس الأنفلونزا الكامل المؤتلف تجاريا (انظر جدول المواد) أو يتم التعبير عنه في خطوط خلايا HEK293 في الثدييات وخلايا الحشرات المصابة بالفيروس البقعي وفقا للبروتوكولات القياسية¹². يتم التعبير عن بروتين سبايك Wuhan-1 في خلايا HEK293 في الثدييات. يسمح تخليق الببتيد أحادي المومانوسيلات (MM) والببتيد ثنائي المونيل (DM) بالكشف عن الروابط المتجانسة ل CVN2 والجزيء الصغير أحادي المومانوسيلات¹⁰.

1. إنشاء هياكل CV-N

1. لكل من متغيرات CVN2 وبروتين CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) ، احصل على بنية الجين بتسلسل قائد pelB N-terminal وعلامة His-tag في pET27b (+) من مصادر تجارية (انظر جدول المواد ، الملف التكميلي 1).
2. الحصول على CVN2L0 ومتغيراته (V2 و V3 و V4 و V5 ؛ الشكل 2A ، C) في خلفية جين قالب CVN2L0 يتكون من تسلسلين مختلفين من الحمض النووي لكل تكرار CV-N.
3. إذابة الحمض النووي البلازميد المجفف بالتجميد في الماء المقطر المعقم منزوع الأيونات (ddH₂O) إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / ميكرولتر.

2. تحضير صفائح LB-agar مع خلايا الحمض النووي المحول للبلازميد

1. تحضير وسط الاستزراع LB-Lennox عن طريق إذابة 10 جم / لتر من الببتون ، و 5 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم في ddH₂O (انظر جدول المواد) ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإجراء التحويل إلى E. coli BL21 (DE3) المختصة لكل متغير (V2-V5) بالطريقة الكيميائية بعد تقرير منشور مسبقا¹⁰.
2. قم بتقسيم المحلول (900 ميكرولتر و 100 ميكرولتر) ، وانقل 100 ميكرولتر على ألواح LB-agar (50 ميكروغرام / مل كاناميسين) ، واستخدم برفق موزع الخلايا المعقمة. احتضان ألواح الآجار طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

3. الاستنساخ

1. استنساخ جين CV-N في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a (انظر جدول المواد) للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية بعد المرجع²⁷.

4. الطفرات الموجهة للموقع

1. لتوليد CVN2L0²⁹ و CVN-E41A الطافر في خلفية جين قالب CVN2L0 يحتوي على تسلسلين متميزين للحمض النووي لكل CV-N كرر²⁷.
2. قم بإجراء طفرات باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة للموقع (انظر جدول المواد) وبادئات مطفرة محددة 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' و 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' لتشغيل PCR³¹.
   1. ابدأ سلسلة من تفاعلات العينات باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج (dsDNA) تتراوح من 5-50 نانوغرام (على سبيل المثال ، 5 و 10 و 20 و 50 نانوغرام من قالب dsDNA). حافظ على تركيز التمهيدي ثابتا.
      ملاحظة: يتم استخدام مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل وبروتوكول الدورة الحرارية بشكل عام كما هو موضح في دليل التعليمات لمجموعة الطفرات الموجهة للموقع³².
3. أضف إنزيم تقييد Dpn I (1 ميكرولتر ، 10 وحدة / ميكرولتر ، انظر جدول المواد) أسفل تراكب الزيت المعدني. امزج التفاعلات جيدا وبلطف ، وقم بتدويرها لأسفل في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لهضم dsDNA الأبوي فائق الالتفاف.

5. تحول الخلايا البكتيرية

1. قم بإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue (انظر جدول المواد) برفق على الجليد. لتحويل كل عنصر تحكم وتفاعل عينة ، قم بتقسيم الخلايا فائقة الكفاءة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب دائري القاع من مادة البولي بروبيلين المبردة مسبقا (14 مل).
   1. نقل 1 ميكرولتر من الحمض النووي أحادي الشريط المعالج ب Dpn I (ssDNA) من كل تفاعل تحكم وعينة (ssDNA متحور) لفصل حصص الخلايا فائقة الكفاءة ، والتي توليف الشريط التكميلي. حرك تفاعلات التحول بعناية لخلط واحتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قبل نقل الحمض النووي المعالج ب Dpn I إلى تفاعل التحويل ، يوصى بإزالة أي زيت معدني متبقي بعناية من طرف الماصة. كعنصر تحكم اختياري ، يجب فحص كفاءة تحويل الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue عن طريق خلط 0.1 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد التحكم pUC18 (1 ميكرولتر) مع حصص 50 ميكرولتر من الخلايا فائقة الكفاءة.
2. ضع نبضة حرارية على تفاعلات التحول عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة 2 دقيقة.
   ملاحظة: تم بالفعل تحسين النبض الحراري المطبق للظروف المذكورة في أنابيب البولي بروبلين المستديرة القاع (14 مل).
3. أضف 0.5 مل من مرق NZY + (يحتوي على لكل لتر: 10 جم من أمين NZ (تحلل الكازين المائي) ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 12.5 مل من 1 M MgCl₂ ، 12.5 مل من 1 M MgSO₄ ، 10 مل من 2 M جلوكوز ، درجة حموضة 7.5 ، ومسخن مسبقا إلى 42 درجة مئوية) واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. قم بلوحة الحجم الصحيح لكل تفاعل تحويل (5 ميكرولتر من تحويل بلازميد التحكم ؛ 250 ميكرولتر من تحويل العينة) على ألواح أجار LB-ampicillin.
   ملاحظة: بالنسبة لضوابط التحول والطفرات، انشر الخلايا على ألواح أجار LB-ampicillin التي تحتوي على 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactopyranoside (X-gal، 80 ميكروغرام/مل) وإيزوبروبيل-1-ثيو-β-D-غالاكتوبيرانوسيد (IPTG، 20 mM) (انظر جدول المواد). تلقيح 50 مل من مزارع الخلايا بمستعمرة واحدة من E المتحولة. خلايا قولونية لتنقية الحمض النووي البلازميد المتحور للتحليلات. يتم تأكيد الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي في منشأة خارجية.

6. التعبير وتنقية البروتين

1. للحصول على ثقافة واسعة النطاق ، قم بتلقيح كمية صغيرة من LB (تحتوي على الأمبيسلين) بمستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.
2. باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بإضافات ، مثل 10 mM من MgCl₂ ، و 10 mM من MgSO 4 ، و 20 mM من الجلوكوز_، مما يخفف من ثقافة البذور إلى 1/100.
   1. تنمو الخلايا مع اهتزاز قوي عند 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا إلى ABS 600 نانومتر بين 0.4-0.6 (مرحلة منتصف السجل) قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية. حث مع 1 mM IPTG وتنمو بين عشية وضحاها.
   2. بعد ذلك ، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأعد الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم ، تجاهل الطاف مع ماصة. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 مل من محلول التحلل واحتضان التعليق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تركيب محلول التحلل: (50 mM من NaH 2 PO₄، 300 mM من كلوريد الصوديوم، 2٪ Triton-X100، 500 نانوغرام/مل من الليزوزيم، 1 mM من فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)، 1 mM من ثنائي ثيوثريتول، 1 mM من MgCl₂، الرقم الهيدروجيني 8، انظر جدول المواد).
   1. أخضع الخليط لدورتي تجميد وذوبان (-80 درجة مئوية). فصل الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) ، على وجه الخصوص ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) - الصفحة³³ (الشكل 2B ، C).
      ملاحظة: يمكن تحلل الخلايا بعدة طرق ، مثل ذوبان الجليد بالتجميد ، أو الصوتنة ، أو التجانس ، أو التحلل الأنزيمي ، أو مزيج من هذه الطرق. يوصى بالتنقية من هيئات التضمين لجمع غلات البروتين العالية²⁶.
4. تنقية البروتينات باستخدام كروماتوغرافيا عمود Ni-NTA (انظر جدول المواد). قم بتحميل الكسر القابل للذوبان على عمود حبة Ni-NTA المجدد (1 مل / دقيقة). اغسل النظام بمخزن TBS المؤقت (50 مللي متر من Tris ، 150 mM من كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) قبل بدء التدرج (0-100٪ 500 mM imidazole في TBS على مدار 60 دقيقة) وجمع الكسور (1 مل / دقيقة). غسيل البروتينات المنقاة للتوصيف الكيميائي الحيوي مقابل 100 mM PBS (الشكل 2C ، D).
5. بدلا من ذلك ، استخدم جل التقارب His-Select Ni²⁺ (انظر جدول المواد) في أنابيب سعة 14 مل لربط وإعادة تعليق CV-N المعبر عنه المؤتلف الموسوم به في المحاليل العازلة مع 20 mM imidazole و 250 mM imidazole ، على التوالي. احتضان دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   ملاحظة: قم بتطبيق هذه البروتينات شبه المنقاة على عمود معبأ مسبقا للاستخدام مرة واحدة لتبادل المخزن المؤقت وتنظيف العينات البيولوجية ، على سبيل المثال ، الكربوهيدرات والبروتينات ، والتي يمكن أن تحمل 1-1.5 مل من كروماتوغرافيا التقارب المعدني الثابت.
6. نقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي مع مرشح قطع 10 كيلو دالتون (انظر جدول المواد) وتركيزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية. بالنسبة لقياسات SPR ، استبدل المحاليل المراد تحليلها ب 10 mM HEPES ، و 150 mM كلوريد الصوديوم ، و 3 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، و 0.05٪ Tween20 ، و pH 7.4 (HBS-EP (+) ، انظر جدول المواد).
   1. أضف هذا المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف 1:10 وأجهزة طرد مركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية.
7. تحديد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop UV-Vis (انظر جدول المواد) بناء على معامل الانقراض المحسوب (20,440 M-1 ^cm-1) للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجما 23,474 Da³⁴. استخدم PBS (100 mM ، pH 7.0) أو SPR buffer كفراغ ، وقم بقياس تركيز البروتين في ثلاث خطوات تخفيف (1: 1 ، 1: 10 ، و 1: 100).

الشكل 2: تسلسلات CV-N والتعبير. (أ) يتم التعبير عن CVN2 بدون رابط بين كل تكرار CV-N (101 حمض أميني لكل منهما) وأربعة جسور ثاني كبريتيد في متجه pET11a في E. القولونية. (ب) تعبيرات مستعمرتين مستقلتين ل CV-N (مونومر) و CVN2 (ديمر). (ج) يتم تنقية متغيرات رابطة ثاني كبريتيد وتحليلها على SDS-PAGE. يتم استخدام علامة الوزن الجزيئي المنخفض (6 ميكرولتر) كمرجع. WT = CVN2L0 تحمل أربعة جسور ثاني كبريتيد كما هو موضح في (A). V2 هو متغير مع استبدال رابطة ثاني كبريتيد ببقايا قطبية في الموضعين 58 و 73. V3-V5 هي متغيرات مع اثنين من روابط S-S المتبقية وإما قطبية (C58E-C73R) أو غير قطبية (C58W-C73M) تحل محل الأحماض الأمينية أو مزيج من بدائل زوج البقايا هذه. (د) يتم استخلاص كروماتوجرام HPLC ل CVN2L0 المنقى بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة مع تدرج خطي من 5٪ -65٪ مخزن مؤقت B في المخزن المؤقت A على مدار 30 دقيقة. المخزن المؤقت A هو: 0.1٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في ddH₂O ، المخزن المؤقت B هو: 0.08٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في الأسيتونيتريل. يتم تحليل البروتين على عمود هلام السيليكا عالي الأداء 300-5-C4 (150 × 4.6 مم) عند 214 نانومتر و 280 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. التحليل الطيفي SPR

1. استخدم نظام SPR ثنائي القناة (انظر جدول المواد) مع تشغيل المخزن المؤقت HBS-EP (+) و 10 mM glycine HCl pH 1.5-1.6 كمخزن مؤقت للتجديد. قم بتشغيل الجهاز ، وجهاز إزالة العينات ، وأخذ العينات التلقائي ، وضخ وغسل النظام بأكمله باستخدام ddH₂0 لمدة 1 ساعة. ضع المخزن المؤقت للتشغيل الجاهز للاستخدام في زجاجة منفصلة.
2. قم بإسقاط زيت الانتفاخ على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية (انظر جدول المواد) مطلية بغشاء ذهبي رقيق وعلى الجانب العلوي تعمل بهيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة لأسفل.
   ملاحظة: C19RBDHC30M 200 نانومتر ستربتافيدين مشتق كربوكسي ميثيل ديكستران هيدروجيل مع كثافة متوسطة من بروتين فيروس كورونا 2 RBD المصاب بالبيوتينيل المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة ، هو عبارة عن شريحة استشعار جاهزة للاستخدام مع ليجند مثبت مسبقا.

8. مقايسة ربط SPR لربط CV-N ببروتين HA و S و RBD

1. شل حركة الروابط البروتينية إلى رقائق المستشعر باتباع الخطوات أدناه.
   1. افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وتشغيل محرر الجدول في برنامج SPRAutoLink المدمج (انظر جدول المواد). اختر وانقر فوق BASIC_Immobilization من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. يظهر محرر النماذج المستخدم في الزاوية العلوية اليمنى.
   2. انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرفين موضوعين في أخذ العينات الأوتوماتيكي لمزيد من التحليلات. انقر فوق التحكم المباشر في أخذ العينات التلقائي ك "أداة" في شريط القائمة لإعادة الرفوف إلى الأمام أو إلى المنزل. اختر 4 درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل.
      ملاحظة: يسمح برنامج SPR ب "التحكم المباشر في أداة SPR" و "التحكم المباشر للمضخة" عن طريق اختيار الأدوات المقابلة ، بالإضافة إلى معالجة أخذ العينات التلقائي ، والنقر فوق النموذج ؛ كما يمكن اختيار تشغيل محرر الجدول أو مخطط البيانات أو المعالجة اللاحقة لإجراء تحليل البيانات. يتم حفظ الملفات مباشرة في الدليل الافتراضي وتصديرها كملفات scrubber.files من نافذة ما بعد المعالجة.
2. ابدأ تشغيل المضخة لبث ddH₂0 بالنقر فوق أدوات والتحكم المباشر في المضخة وتسجيل البيانات بالنقر فوق التحكم المباشر في أداة SPR ، وفي كل مرة ابدأ في النوافذ التي تظهر حديثا. ضع كواشف التوصيل (الخطوة 8.3) في قارورة سعة 300 ميكرولتر ، وضعها في رفوف أخذ العينات الأوتوماتيكية وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق تشغيل.
   ملاحظة: يتم تكييف أسطح الرقائق إما بمحلول جليكاين 10 mM pH 9.0 أو ربما تم غسلها باستخدام 1 M كلوريد الصوديوم ، 0.1 M محلول بورات الصوديوم pH 9.0 لتكييف سطح رقاقة مشتق من الكربوكسيل لمزيج تنشيط EDC / NHS³⁰.
3. لهذا التفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، استخدم شريحة CMD500D (انظر جدول المواد) لإنشاء وحدات معامل الانكسار الدقيق (μRIU) = 2500 - 3000 خلية تدفق مع HA و μRIU = 400 خلية تدفق مع بروتين سبايك. عند معدل تدفق لبث يبلغ 15 ميكرولتر / دقيقة ، قم بحقن خليط مائي ومتساو من 0.4 M N-ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) كربودايميد هيدروكلوريد (EDC * HCl) و 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) عن طريق تطبيق الخطوات المتسلسلة التالية.
   1. إعادة تعبئة مضخة إعادة الملء عند 25000 ميكرولتر / دقيقة ، وإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية ، وحقن 90 ميكرولتر من محلول تنشيط العينة (EDC / NHS) على مدار 6 دقائق من وقت الاتصال ، ثم الاستمرار لمدة 5 دقائق أخرى.
   2. كرر هذه الدورة بعد تشغيل خط الأساس لمدة دقيقة واحدة عند 10 ميكرولتر / دقيقة على خلية التدفق اليسرى فقط (الأزرق) لحقن وشل حركة الببتيدات المركبة كيميائيا 10 و HA وبروتين السنبلة عند²⁰ ميكروغرام / مل ، والسماح بتعديل خط الأساس اللاحق باستخدام ddH₂O لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5.
4. قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى جهاز إزالة الغازات من ddH₂0 إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP (+) (الشكل التكميلي 1).
5. تحليل مخططات استشعار SPR.
   1. لإجراء دراسات حركية ، استخدم تركيزات تحليلية مختلفة (^10-5-10-8 م) ، مع خطوة تجديد بعد كل حقنة وقياسات فارغة بعد تحليلات مختلفة. قم بتغيير معدل التدفق إلى 10 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحقن لمدة 4 دقائق من وقت التلامس ، ثم 5 دقائق من توليد خط الأساس ، وخطوتين تجديد مدة كل منهما 2 دقيقة بفاصل 30 ثانية.
   2. حقن المحلول العازل للقياسات الفارغة التي يتم طرح أجهزة الاستشعار الخاصة بها من تشغيل العينات لتطبيع تركيزات البروتين المختلفة.
6. انقر فوق النموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى "المعالجة اللاحقة" بالنقر فوق وضع التشغيل هذا. انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في نموذج مخطط البيانات لكل خلية تدفق ، وقم بتصدير التراكب كملف تنقية (.ovr). انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملف. احصل على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة منحنيات اليسار واليمين وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من إشارات قناة الرباط.
   ملاحظة: يتم تشغيل البيانات في "مرحلة ما بعد المعالجة" عن طريق تحديد المخططات الحسية حسابيا. يتم وضعه في تراكب من المخططات الحسية من خلايا التدفق اليمنى واليسرى ، أو يتم تمثيله كمخططات حسية من اختلاف كلتا القناتين.
7. نظف السوائل بالكامل باستخدام 50-100 مللي مول من محلول الجلايسين بدرجة حموضة 9.5 وماء و 20٪ إيثانول قبل وبعد قياسات الربط لإزالة آثار الملح أو أي تلوث بالبروتين ، أو أكثر صرامة ، مع 0.5٪ SDS وجلايسين.
   ملاحظة: لمنع تلف الجهاز ، يوصى بالتحقق من الاستقرار الميكانيكي للرقاقة الزجاجية قبل إعادة إدخال خرطوشة الرقاقة في الجهاز إذا تم تخزين الرقائق تحت المخزن المؤقت أو في رطوبة 100٪.

يتم اختبار جزيء CVN2L0 ثنائي المجال المبدل للارتباط بالمنطقة العليا HA في ثلاث تجارب SPR منفصلة ويتم تقديم تقارب الربط بقيم KD. يفترض أن المجال B يشتمل على مواقع ربط H ، والتي تتأثر باستبدال رابطة ثاني كبريتيد في بقايا أيونية ، ويشكل المجال A L10,18. يتم اختبار الحقن الفردي ل CVN2L0 والمتغيرات V2 (ثلاثة جسور ثاني كبريتيد) و V5 (جسران ثاني كبريتيد) أولا للارتباط بشريحة مستشعر HA المقترنة لتقدير قدرات الربط قبل إعداد قياس الحركية باستخدام أخذ العينات الأوتوماتيكي ومحرر جدول التشغيل (الشكل 3A والشكل التكميلي 2). يتم أتمتة الحقن المتكرر لسلسلة من CVN2L0 و V2 و V5 بتركيزات مختلفة في نطاق النانو مولار و μ مولار في النظام بمرور الوقت (الشكل 3B-D). ربط عدد روابط Cys-Cys السليمة ، CVN2L0 ملزم يجمد HA عند KD = 255 نانومتر عند الوصول إلى تشبع جيد. في هذه الحالة ، تكون كلتا قيمتي KD ، المحسوبة إما من البيانات الحركية أو عن طريق ملاءمة بيانات التوازن مع متساوي الحرارة المرتبط ب Langmuir ، في اتفاق معتدل (الجدول 1 والشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4).

الشكل 3: مقايسة ربط SPR لربط الرباط عبر التفاعلات متعددة التكافؤ. يتم اختبار CVN2 (WT) ومتغيرات موقع الربط V2 و V5 مع بدائل ثاني كبريتيد في جيب ربط الكربوهيدرات عالي التقارب لربط HA المتجمد تساهميا. (أ) يمكن استخراج منحنيات ربط خلايا التدفق الأيسر والأيمن ل CVN2 و V2 و V5 من بروتوكول تشغيل SPR ، ويتم تلخيص مخططات الاستشعار في تراكب. (ب) مخطط حسي من تجربة SPR التقليدية يظهر كتحليلات حركية لربط CVN2L0 ب HA ، وحقن تركيزات التحليل من 10-4 إلى 10-8 M. يتم قياس CVN2L0 حتى أعلى تركيز عند 1.5 ميكرومتر (الخط العلوي) وحتى 500 نانومتر (الحد الأدنى) ، حيث لا يتم تحقيق تشبع على سطح الرقاقة ولا ربط التوازن. RU = وحدات الاستجابة. يتم استخدام شريحة مستشعر CMD500D. (ج) مخطط استشعار SPR لربط V2 ب HA. (د) V5 ملزمة ل HA. الشكل (B-D) مستنسخ بإذن من المرجع10. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تقارب ربط CVN2 والمتغيرات ب HA المقاسة عبر SPR. يستخدم Scrubber 2.0 (برنامج BioLogic) لملاءمة منحنيات ارتباط SPR وتفكك SPR في الوقت الفعلي ولحساب ثوابت تفكك التوازن (KD) من البيانات الحركية والتوازن. كا = ثابت معدل الارتباط. دينار كويتي = معدل التفكك ثابت.

في حين أن قيم KD لربط CVN2L0 و V2 ب HA كلاهما في نطاق نانومولي ، فإن V5 يتضاءل في الربط (الجدول 1). في V5 ، يتم استبدال رابطتين من ثاني كبريتيد ببقايا اقتران الأيونات التي تعيد تدريب التفاعلات الأيونية المحتملة بين بقايا Glu و Arg المتحولة (الشكل 2A ، 3D). يتم تحليل البيانات الأولية باتباع معدل الارتباط المتكامل ومعادلات معدل التفكك ، والتي تصف حركية الربط لتفاعل CV-N القابل للذوبان مع الربيطة المجمدة وتفكك المركب المتشكل من سطح الرقاقة. يتم إجراء قياسين مستقلين ، ويتم تحليل المخططات الحسية ، المكافئة لتلك التي تم الحصول عليها من النسخ المتماثلة. يتم حساب KD على أنه حاصل قسمة koff / kعلى (الجدول التكميلي 1) 10,35. ومع ذلك ، يرتبط KD ببيانات التوازن التي تناسب ارتباط Langmuir isotherm36 ، حيث يتم رسم استجابة ارتباط التوازن كدالة لتركيز المادة المراد تحليلها (الشكل التكميلي 3A ، 4A ، 3B ، 4B). بطريقة تعتمد على التركيز ، يتم تحديد ثابت معدل التفكك kd بعد التحليلات ودمجها في تركيب مرحلة الارتباط (kon) لتقدير ثابت معدل الارتباط ka. (الجدول 1، الشكل التكميلي 3 جيم، الشكل التكميلي 4 جيم).

بعد ذلك ، تتم مقارنة ربط CV-N ب HA بتفاعله مع RBD. يتم قياس ارتباط CV-N WT ب SARS-CoV-2 RBD عند تقارب أضعف (K D = 260 ميكرومتر ، الشكل 4A) مقارنة بالارتباط ب HA (KD = 5.7 نانومتر) 8،10،12 والارتباط ببروتين S (KD = 18.6 ميكرومتر ، الشكل 5). يتم رسم التركيز مقابل الاستجابة لربط CV-N WT ب RBD ، بافتراض استهداف محدد للكربوهيدرات المحفوظة المحتملة على الوحدة الفرعية RBD S1 (الشكل 4 أ). يظهر نفس مخطط التقارب لارتباط CVN2L0-V4 ب DM الذي لم يعد قابلا للتحليل بسبب استبدال روابط ثاني كبريتيد التي تتداخل مع الارتباط عالي التقارب بالببتيدات الصغيرة الغليكوزيلاتية (الشكل 4 ب).

CVN2L0-V4 (2 روابط ثاني كبريتيد مقابل الاستبدال غير المتماثل لبقايا السيستين إما ببقايا Glu-Arg أو الأحماض الأمينية البرمائية Trp و Met) يمكن أن تشكل شبكات روابط هيدروجينية غير قطبية حول موقع ربط الكربوهيدرات B الزائف10. تصل الكثافة العالية للجليكان على بروتين HA إلى الارتباط ببقايا Glu-Arg القطبية بدلا من السيستين (الجدول التكميلي 1) ، وارتباط مع الببتيدات المانوسيلية (KD = 10 μM ل DM) بين CVN2L0 والتعديلات في Glu-Arg ، ولكنها تظهر تفككا متقطعا للمتغيرات من هذا الببتيد أحادي الغليكوزيلاتي ، خاصة عندما يتم تعديل H على كلا المونومرات. بالنسبة للتفاعل بين CVN2L0-V4 مع DM ، فإن استجابة حقن CVN2L0-V4 56 ميكرومتر تعطي استجابة أعلى من Rmax. (الشكل 4 ب). فشل V5 (2x Glu-Arg) في الانفصال عن DM المرتبط بالسطح (البيانات غير معروضة). باختصار ، تنخفض منحنيات الاستجابة للتركيزات المنخفضة قبل إنهاء الحقن لجميع أجهزة الاستشعار على ارتباط CVN2 بالببتيد بدون ارتباط H الأصلي والمونومر ب RBD.

الشكل 4: تحليلات SPR ل (A) ارتباط مونومر CV-N WT ب RBD. يتم حساب K D عن طريق ملاءمة البيانات الحركية (الجانب الأيسر ، K D = 260 μM) ومقارنتها ببيانات التقارب (الجانب الأيمن) باستخدام نموذج جزيئي حيوي بسيط للربط 1: 1 بين ligand و analyte (KD equil = 274 μM). يتم رسم استجابة ربط التوازن أو قدرة الربط كدالة للتركيز مقارنة بمنحنيات ربط SPR (0-605 ميكرومتر CVN). H = موقع ربط عالي التقارب. L = موقع ربط منخفض التقارب. كلاهما موجود على CV-N و CVN2L0. (ب) ارتباط ثنائي CVN2L0-V4 ب DM ، بافتراض 2L دون تحليل KD. تركيزات CVN2L0-V4 هي 56 ميكرومتر ، 28 ميكرومتر ، 14 ميكرومتر ، 7 ميكرومتر ، 3.5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: ارتباط CVN-E41A الطافر و CV-N WT بالبروتين السكري (A) S. تشير الأسهم إلى بداية مرحلة الارتباط والتفكك. (ب) ربط CVN-E41A ب RBD على SARS-CoV-2. يتم تثبيت الروابط مسبقا على رقائق مستشعر HC polycarboxylate و CMD500D. تستخدم الوحدة الفرعية Covid-19 S1 [Pinto، D. et al.26 ؛ و Barnes، C. et al.37] لتجميد RBD. معدل التدفق: 30 ميكرولتر / دقيقة ، 25 درجة مئوية ؛ البيانات الخام المرسومة. بالمقارنة ، تم تصوير ارتباط الأجسام المضادة لمصل الدم البشري ب RBD بعامل تخفيف 1: 200. (C) مقايسة SPR لارتباط CV-N WT بالبروتين السكري S الذي يجمد إلى مستوى استجابة يبلغ 400 μRIU لالتقاط CV-N. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لقد ثبت من قبل أن CV-N الأحادي مع L واحد لا يمكن أن يربط gp120 بشكل كاف ، ولكن قدرة تحييد CV-N تتطلب الربط المتقاطع لموقعين مرتبطين بالكربوهيدرات ويتم استعادتها في الغالب عن طريق dimerization لتعمل مع 2H12,19. ومن ثم ، يتم التعبير عن متحولة أحادية CVN-E41A ، والتي يشتبه في أنها تزعزع استقرار المجال الزائف B أو يمكن أن تقطع الاتصال بالمجال الثاني A ، مثل الموجود في CV-N WT. CVN-E41A monomer يكشف عن الاستقرار عند الارتباط ببروتين S مشابه لمونومر CV-N. على الرغم من أن استجابة SPR لتركيزات التحليل 605-680 ميكرومتر تؤدي إلى وحدات استجابة عالية وحساسات SPR نموذجية لربط CV-N WT و E41A ، على التوالي ، فإن الطفرة غير مستقرة عند تخفيفها (الشكل 5).

الشكل التكميلي 1: مخطط استشعار SPR لالتقاط تقليد DM كجزء من قمة HA. لقطة شاشة: مخطط بيانات SPR يوضح بروتوكول تشغيل SPR لتجميد DM على شريحة مستشعر SPR CMD500D ، المطلية بهيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران 500 نانومتر ومناسبة للتحليلات الحركية لتحليلات الوزن الجزيئي المنخفض على كثافة ليجند عالية. يتم تثبيت شرائح الاستشعار مباشرة على الكاشف بزيت الانبعاث ويتم تثبيتها أسفل خلية تدفق ثلاثية المنافذ. بعد تبريد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك pH 8.5 ، يتم حقن CVN2 مرتين (التركيز = 1 ميكرومتر و 2 ميكرومتر ، على التوالي). أرجواني: الفرق بين خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2 ؛ يتم تسجيل الاستجابة بفاصل 0.2 ثانية. أزرق: خلية التدفق 1: 3000-4000 وحدة معامل الانكسار الدقيقة (μRIU) المغلفة من محلول 400 نانومتر من ligand DM إلى سطح كربوكسيل نشط. أحمر: خلية التدفق المرجعي 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التشغيل اليدوي على شريحة مستشعر CMD500D التي تعمل بوظيفة HA والتي تظهر ربط CVN2L0-V5 و V2 و CVN2L0 dimeric . عند معدلات تدفق التسريب من 30-50 ميكرولتر / دقيقة ، يتم حقن متغيرات CVN2L0 ورابطة ثاني كبريتيد معبرا عنها بعلامة His-وتنقيتها عبر Ni-NTA في نطاق منتصف ميكرومتر واختبارها للارتباط ب HA مع مرحلة ارتباط مدتها 3 دقائق ومرحلة تفكك مدتها دقيقتان. الحقن هي V5 (15 ميكرومتر) ، V2 (2.4 ميكرومتر) ، 0 ميكرومتر ، CVN2L0 مستنسخة من بروتين اندماج سومو (1 ميكرومتر) ، و CVN2L0 (2 ميكرومتر). يتم استخدام تشغيل المخزن المؤقت عند درجة الحموضة الفسيولوجية لجميع التجارب عند 25 درجة مئوية. يتم تفريغ جميع المحاليل وتصفيتها (0.2 ميكرومتر) قبل الحقن في النظام. أرجواني: الفرق بين خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2 ؛ يتم تسجيل الاستجابة بفاصل 0.2 ثانية. الأزرق: خلية التدفق 1: 2540 μRIU HA. أحمر: خلية التدفق المرجعي 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: CVN2 ملزم ب HA. تحليل المخططات الحسية عند محاذاة المنحنيات تلقائيا. (أ) تم تصفير المستشعرات ومحاذاتها باستخدام برنامج Scrubber (يسار) وربط متساوي الحرارة يظهر منحنى استجابة يعتمد على التركيز للتحليلات المقيدة (يمين). (ب) الربط متساوي الحرارة معبرا عنه بالسعة المئوية. (ج) الارتباط النظري المركب حسابيا ومنحنيات التفكك. (د) بيانات الحركية على مخططات استشعار SPR بدون منحنيات مجهزة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: CVN2 ملزم ل HA. تحليل المخططات الحسية عند محاذاة المنحنيات يدويا. (أ) تم تصفير المستشعرات ومحاذاتها باستخدام برنامج Scrubber (يسار) وربط متساوي الحرارة يظهر منحنى استجابة يعتمد على التركيز للتحليلات المقيدة (يمين). (ب) الربط متساوي الحرارة معبرا عنه بالسعة المئوية. (ج) الارتباط النظري المركب حسابيا ومنحنيات التفكك. (د) بيانات الحركية على مخططات استشعار SPR بدون منحنيات مجهزة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: البيانات الحركية التي تم الحصول عليها من أجهزة استشعار SPR لربط متغيرات رابطة CVN2L0 و Cys-Cys V2 و V4 و V5 ب HA باستخدام نموذج ربط Langmuir 1: 1. KD [M] = k إيقاف / k تشغيل  أو kd / ka. يتم إنشاء جميع البيانات عند 25 درجة مئوية في المخزن المؤقت HBS-EP (+): الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.