مقالة منهجية

تصوير الأنسجة متعددة الإرسال للغاية باستخدام أصباغ رامان

DOI:

10.3791/63547

⸱

أبريل 21, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير الإلكتروني الذي يحفز بالأشعة قبل الرنين (epr-SRS) لأصباغ رامان الشبيهة بقوس قزح منصة جديدة لتصوير البروتين القائم على الظهارة متعددة الإرسال للغاية. هنا ، نقدم دليلا عمليا بما في ذلك إعداد الأجسام المضادة ، وتلطيخ عينات الأنسجة ، وتجميع مجهر SRS ، وتصوير أنسجة epr-SRS.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب تصور نطاق واسع من المؤشرات الحيوية المحددة في الأنسجة دورا حيويا في استكشاف المنظمات المعقدة للأنظمة البيولوجية المعقدة. وبالتالي ، فقد تم تقدير تقنيات التصوير متعددة الإرسال بشكل متزايد. هنا ، نصف منصة ناشئة للتصوير الاهتزازي متعدد الإرسال للغاية لبروتينات محددة ذات حساسية مماثلة للتألق المناعي القياسي عبر التصوير الإلكتروني قبل الرنين الذي يحفز رامان (epr-SRS) لأصباغ رامان الشبيهة بقوس قزح. تتحايل هذه الطريقة على حد القنوات القابلة للحل طيفيا في التألق المناعي التقليدي وتوفر نهجا بصريا من طلقة واحدة لاستجواب علامات متعددة في الأنسجة ذات الدقة دون الخلوية. وهو متوافق بشكل عام مع مستحضرات الأنسجة القياسية ، بما في ذلك الأنسجة الثابتة بارافورمالديهايد ، والأنسجة المجمدة ، والأنسجة البشرية المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE). نتوقع أن توفر هذه المنصة صورة أكثر شمولا لتفاعلات البروتين للعينات البيولوجية ، خاصة بالنسبة للأنسجة السليمة السميكة. يوفر هذا البروتوكول سير العمل من إعداد الأجسام المضادة إلى تلطيخ عينات الأنسجة ، إلى تجميع مجهر SRS ، إلى تصوير أنسجة epr-SRS.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون أنظمة الأنسجة المعقدة من مجموعات فرعية خلوية متميزة تتشابك مواقعها المكانية وشبكات التفاعل بعمق مع وظائفها واختلالاتها 1,2. للكشف عن بنية الأنسجة واستجواب تعقيدها ، من الضروري معرفة المواقع المكانية للبروتينات بدقة خلية واحدة. وبالتالي ، فإن تقنيات تصوير البروتين متعددة الإرسال للغاية قد تم تقديرها بشكل متزايد ويمكن أن تصبح حجر الزاوية لدراسة بيولوجيا الأنسجة3،4،5. يمكن تصنيف طرق تصوير البروتين متعددة الإرسال الشائعة الحالية إلى فئتين رئيسيتين. أحدهما هو التصوير المناعي التسلسلي الذي يعتمد على جولات متعددة من تلطيخ الأنسجة والتصوير ، والآخر هو تصوير قياس الكتلة الخلوية إلى جانب الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن الثقيلة6،7،8،9،10،11،12.

هنا ، يتم تقديم استراتيجية بديلة لتصوير البروتين القائم على الأجسام المضادة متعددة الإرسال. على عكس طريقة التصوير الفلوري السائدة ، والتي يمكنها فقط تصور 4-5 قنوات في وقت واحد بسبب أطياف الإثارة والانبعاثات الواسعة (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) ~ 500 cm-1) ، يعرض مجهر Raman عرض خط طيفي أضيق بكثير (FWHM ~ 10 cm-1) وبالتالي يوفر تعدد الإرسال القابل للتطوير. في الآونة الأخيرة ، من خلال تسخير الطيف الضيق ، تم تطوير مخطط جديد لمجهر رامان يسمى الفحص المجهري الإلكتروني قبل الرنين الذي يحفز رامان (epr-SRS) ، مما يوفر استراتيجية قوية للتصوير متعدد الإرسال13. من خلال فحص أوضاع الاهتزاز المقترنة إلكترونيا لأصباغ رامان ، يحقق epr-SRS تأثيرا تعزيزيا جذريا يبلغ 10 13 ضعفا على مقاطع رامان العرضية ويتغلب على عنق الزجاجة الحساس لمجهر رامان التقليدي (الشكل 1A)13،14،15. ونتيجة لذلك ، تم دفع حد الكشف عن epr-SRS إلى sub-μM ، مما يمكن رامان من اكتشاف العلامات الجزيئية المثيرة للاهتمام مثل البروتينات والعضيات المحددة داخل الخلايا13,16. على وجه الخصوص ، باستخدام الأجسام المضادة المترافقة مع صبغة رامان ، تم إثبات تصوير epr-SRS لبروتينات محددة في الخلايا والأنسجة (تسمى eprSRS المناعية) بحساسية مماثلة للتألق المناعي القياسي (الشكل 1B)13,17. من خلال ضبط الطول الموجي للمضخة بمقدار 2 نانومتر فقط ، ستكون إشارة epr-SRS متوقفة تماما (الشكل 1B) ، والتي تعرض تباينا اهتزازيا عاليا.

على جانب المسبار ، تم تطوير مجموعة من مجسات رامان الشبيهة بقوس قزح تسمى أصباغ تشتت مانهاتن رامان (MARS) لاقتران الأجسام المضادة13،18،19،20. تتكون لوحة رامان الفريدة هذه من أصباغ جديدة تحمل روابط ثلاثية مترافقة π (مادة تكميلية) ، يعرض كل منها ذروة epr-SRS واحدة وضيقة في نطاق رامان الطيفي المتعامد الحيوي (الشكل 1C). من خلال تعديل بنية الكروموفور الأساسي وتحرير ذرتي الرابطة الثلاثية (المادة التكميلية) بشكل نظائري، تم تطوير مجسات رامان المنفصلة طيفيا. من خلال الاستفادة من تعدد الإرسال القابل للتطوير ، يوفر الفحص المجهري epr-SRS إلى جانب لوحة صبغة MARS استراتيجية بصرية لتصوير البروتين متعدد الإرسال بلقطة واحدة في الخلايا والأنسجة.

يوفر Immuno-eprSRS استراتيجية بديلة لطرق تصوير البروتين متعدد الإرسال الحالية ذات نقاط القوة الفريدة. بالمقارنة مع نهج التألق مع التلطيخ الدوري والتصوير وإزالة الإشارات ، تضمن هذه المنصة القائمة على Raman تلطيخا وتصويرا أحادي الجولة. لذلك ، فإنه يتحايل على التعقيد العملي في الإجراءات الدورية ويبسط البروتوكول إلى حد كبير ، وبالتالي يفتح مناطق جديدة لتصوير البروتين متعدد الإرسالات. على سبيل المثال ، من خلال تسخير بروتوكول إزالة الأنسجة المصمم خصيصا لصبغة رامان ، تم توسيع نطاق المناعي eprSRS إلى ثلاثة أبعاد لرسم خرائط البروتين متعددة الإرسال للغاية في الأنسجة السليمة السميكة17. تم تصور أكثر من 10 أهداف بروتينية على طول أنسجة دماغ الفئران التي يبلغ سمكها ملليمترا17. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا عرض اقتران المناعي eprSRS مع بروتوكول مجهر توسيع الاحتفاظ بالجزيئات الحيوية (ExM)المحسن 21 ، والتصوير النانوي بطلقة واحدة لأهداف متعددة22. بالمقارنة مع التحليل الطيفي الكتلي للتصوير 4,9 ، فإن epr-SRS غير مدمر ولديه قدرة تقسيم بصرية جوهرية. علاوة على ذلك ، فإن epr-SRS أكثر كفاءة في الوقت في مسح الأنسجة. عادة ، تستغرق منطقة الأنسجة التي تبلغ 0.25 مم2 بحجم بكسل 0.5 ميكرومتر بضع دقائق فقط للتصوير لقناة epr-SRS واحدة. على سبيل المثال ، يبلغ إجمالي وقت التصوير لأربع قنوات SRS بالإضافة إلى أربع قنوات فلورية في الشكل 4 حوالي 10 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء البروتوكول وفقا لبروتوكول التجارب على الحيوانات (AC-AABD1552) الذي وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كولومبيا.

1. إعداد الأجسام المضادة المترافقة مع صبغة رامان

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للاقتران على أنه ~ 0.1 M NaHCO 3 في المخزن المؤقت PBS ، الرقم الهيدروجيني =8.3 ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. تحضير محلول مسبار MARS (المواد التكميلية) N-hydroxysuccinimidy (NHS) الذي يعمل بالاستر على شكل 3 ملليمتر في DMSO اللامائي. يمكن الرجوع إلى توليف تحقيقات MARS إلى التقارير السابقة 13،17،18.
    ملاحظة: لأغراض التخزين ، يجب حماية محلول استر NHS للصبغة من الضوء والاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية.
  3. تذوب المواد الصلبة للأجسام المضادة في المخزن المؤقت للاقتران بتركيز 2 ملغم/مل. بالنسبة للأجسام المضادة التي تذوب في مخازن مؤقتة أخرى ، استبدلها في مخزن الاقتران بتركيز 1-2 ملغ / مل مع مرشحات الطرد المركزي.
    ملاحظة: يفضل استخدام الأجسام المضادة الثانوية الممتزجة بشكل كبير للتلطيخ المتعدد لتقليل التفاعل عبر الأنواع. وترد الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في الجدول 1 وجدول المواد.
  4. أداء تفاعل الاقتران.
    1. بالنسبة للأجسام المضادة الثانوية ، أضف 15 ضعفا من محلول الصبغة إلى محلول الأجسام المضادة في قارورة زجاجية ببطء مع التحريك. على سبيل المثال ، في محلول الأجسام المضادة 0.5 مل 2 مجم / مل ، أضف محلول صبغة 35 ميكرولتر 3 ملليمتر.
    2. احتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة (RT) مع التحريك لمدة 1 ساعة. حماية التفاعل من الضوء.
  5. تنقيه.
    1. قم بإعداد ملاط راتنج ترشيح الجل (جدول المواد) في مخزن PBS المؤقت ، باتباع الخطوات 1.5.2-1.5.4.
    2. أضف 10 مل من مسحوق راتنج ترشيح الجل إلى 40 مل من المخزن المؤقت PBS داخل أنبوب 50 مل.
    3. احتفظ بالمحلول في حمام مائي 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. قم بتزيين السوبرناتانت وأعد إضافة PBS إلى 40 مل. تخزين الطين في 4 درجة مئوية.
    5. قم بتعبئة عمود استبعاد الحجم (قطر 1 سم ، أعمدة تدفق الجاذبية) بمحلول الطين على ارتفاع 10-15 سم.
    6. شطف وغسل العمود مع ~ 10 مل من PBS المخزن المؤقت لمزيد من التعبئة الراتنج.
    7. ضع خليط تفاعل الاقتران (~ 0.5 مل) على العمود. أضف على الفور 1 مل من المخزن المؤقت PBS كمخزن مؤقت للإزالة عند تحميل كل خليط التفاعل. أعد ملء المخزن المؤقت (PBS) باستمرار إلى العمود.
    8. اجمع استقامة المحلول المقترن من خلال النظر إلى اللون الموجود على العمود (صبغات MARS لها ألوان خضراء إلى زرقاء فاتحة) أو قياس الامتصاص عند 280 نانومتر (A280).
  6. ركز المحلول الذي تم جمعه على 1-2 ملغم / مل باستخدام مرشح طرد مركزي.
  7. حدد تركيز ومتوسط درجة وضع العلامات (DOL ، نسبة الصبغة إلى البروتين) عن طريق قياس طيف الأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-Vis) للمحلول المقترن باستخدام قارئ لوحة نانو.
    ملاحظة: توفر المواد التكميلية خصائص استرات NHS لصبغة MARS للحساب. DOL الطبيعي للجسم المضاد الثانوي حوالي 3.

2. إعداد عينة الأنسجة

  1. بارافورمالديهايد أنسجة دماغ الفئران الثابتة.
    1. تخدير الفئران (C57BL/6J ، أنثى ، 25 د بعد الولادة) مع الأيزوفلوران. تقييم التخدير المناسب مع اختبار قرصة إصبع القدم.
    2. قتل الفئران عن طريق إزاحة عنق الرحم. قم بدمج الفئران على الفور مع 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) في PBS عبر القلب.
    3. جمع دماغ الماوس، باتباع الخطوات 2.1.4-2.1.5
    4. قطع لأعلى من جذع الدماغ على طول خياطة السهمي. قشر نصفي الجمجمة بعيدا إلى الجانب وأخرج الدماغ باستخدام الملقط.
    5. إصلاح الدماغ الذي تم جمعه في 4٪ PFA في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ثم ، اغسل الدماغ في مخزن PBS المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة لإزالة PFA الزائد.
    6. ضع الأغاروز الصلب في الماء بتركيز نهائي قدره 7٪ (w / v) في كوب ، مع غطاء فضفاض. حرك المحلول بقضيب تحريك زجاجي. سخني الملاط في الميكروويف حتى يصبح المحلول واضحا.
    7. اترك الأغاروز ليبرد إلى 45-55 درجة مئوية.
    8. صب الأغاروز السائل في غرفة صغيرة ، ثم انقل الدماغ من PBS إلى الأغاروز السائل ووجهه باستخدام ملعقة لتضمين الدماغ. انتظر حتى تصلب كتلة الأغاروز الأنسجة.
    9. قسم الأنسجة المزروعة إلى شرائح إكليلية بسماكة 40 ميكرومتر باستخدام اهتزاز.
    10. انقل الأنسجة إلى صفيحة من 4 آبار للتلطيخ التالي. إزالة الأغاروز مع الملقط. اغسل المنديل مع 1 مل من PBS ، ثلاث مرات.
  2. أنسجة البنكرياس الفئران المجمدة الثابتة.
    1. إصلاح البنكرياس الماوس في 4٪ PFA في PBS في 4 درجة مئوية مع هزاز لمدة 16-20 ساعة.
    2. اغسل العينة في 1 مل من PBS (4 درجات مئوية) ثلاث مرات لإزالة PFA.
    3. قم بتضمين العينة (~ 0.3-0.5 سم في الحجم) في كتل مركبة ذات درجة حرارة القطع المثلى (OCT). ضع 2 قطرة من OCT في قالب تبريد بلاستيكي. ضع الأنسجة في الاتجاه الصحيح واسكب OCT فوق الأنسجة حتى لا يبقى أي من الأنسجة مكشوفا.
    4. قسم البنكرياس إلى شرائح بسماكة 8 ميكرومتر وقم بشل حركتها على شريحة زجاجية ملزمة للأنسجة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    5. قبل التلطيخ ، قم بموازنة العينة إلى RT. اغسل الأنسجة باستخدام PBS لإزالة كتل OCT.
  3. عينات FFPE.
    1. اخبز شريحة أنسجة FFPE على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. إزالة البارافين والإماهة: ضع العينات بالتتابع في المحاليل التالية في أنبوب سعة 50 مل في RT لمدة 3 دقائق في كل مرة مع اهتزاز خفيف:
      الزيلين مرتين ،
      الإيثانول مرتين ،
      95 ٪ (المجلد / المجلد) الإيثانول في الماء منزوع الأيونات مرتين ،
      70 ٪ (المجلد / المجلد) الإيثانول في الماء منزوع الأيونات مرتين ،
      50 ٪ (المجلد / المجلد) الإيثانول في المياه منزوعة الأيونات مرة واحدة ،
      الماء منزوع الأيونات مرة واحدة.
    3. انقل العينة إلى سترات الصوديوم 20 mM (الرقم الهيدروجيني 8.0) عند 100 درجة مئوية في وعاء زجاجي. تأكد من غمر الأنسجة في المحلول.
    4. ضع الجرة في حمام مائي 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    5. اغسل العينة بالماء منزوع الأيونات في RT لمدة 5 دقائق.

3. الأنسجة المناعية eprSRS تلطيخ

  1. استخدم قلما مسعورا لرسم حدود حول أقسام الأنسجة على الشريحة.
    ملاحظة: يتم استخدام جرة تلطيخ الشرائح لاتباع خطوات حضانة الأنسجة على الشريحة. الأنسجة العائمة (أقسام دماغ الفأر بسماكة 40 ميكرومتر) ملطخة بألواح الآبار.
  2. احتضان الأنسجة مع 0.3-0.5٪ PBST (تريتون X-100 في PBS) لمدة 10 دقائق.
  3. احتضن الأنسجة باستخدام المخزن المؤقت المانع (مصل الحمير بنسبة 5٪ ، و 0.5٪ Triton X-100 في PBS) لمدة 30 دقيقة.
  4. تحضير محلول التلطيخ الأساسي: أضف جميع الأجسام المضادة الأولية إلى 200-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (2٪ مصل الحمير ، 0.5٪ Triton X-100 في PBS) بالتركيزات المطلوبة. جهاز الطرد المركزي محلول التلطيخ الأساسي عند 13000 × g لمدة 5 دقائق. استخدم السوبرناتانت فقط إذا كان يعجل بالشكل.
  5. احتضان الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام.
    ملاحظة: لتلطيخ أقسام الأنسجة على الشريحة، ضع العينة في صندوق تلطيخ مع مسح مبلل للحفاظ على الرطوبة.
  6. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 0.3-0.5٪ PBST في RT لمدة 5 دقائق لكل منها. استخدم 1 مل PBST للأنسجة العائمة. بالنسبة للأنسجة الموجودة على الشريحة ، اغسل الشرائح في جرة تلطيخ الشرائح وتأكد من غمر جميع الأنسجة في المحلول.
  7. احتضان الأنسجة في 200-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة 30 دقيقة.
  8. تحضير محلول التلطيخ الثانوي: أضف جميع الأجسام المضادة الثانوية (والليكتين إذا لزم الأمر) إلى 200-500 ميكرولتر من مخزن التلطيخ العازل مع التركيزات المطلوبة (عادة 10 ميكروغرام / مل). قم بالطرد المركزي لمحلول التلطيخ الثانوي عند 13000 × g لمدة 5 دقائق. استخدم السوبرناتانت فقط إذا كان يعجل بالشكل.
  9. احتضان الأنسجة في 200-500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام.
  10. اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.3-0.5٪ PBST في RT لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. احتضان مع 200-500 ميكرولتر من محلول DAPI لمدة 30 دقيقة.
  12. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS في RT لمدة 5 دقائق لكل منها.
  13. بالنسبة لأقسام الأنسجة العائمة ، انقلها إلى شرائح زجاجية باستخدام ماصة إسقاط الزجاج. انشر الأنسجة بفرشاة مناديل ورقية ونظف المناطق المحيطة بها بمناديل مبللة إذا لزم الأمر.
  14. قم بتركيب الأنسجة في قطرة من الكواشف المضادة للتلاشي باستخدام غطاء زجاجي وقم بتثبيته باستخدام طلاء الأظافر.

4. SRS المجهر التجمع

ملاحظة: يتم استخدام نظام التألق البؤري التجاري في التصوير الفلوري SRS جنبا إلى جنب. ويمكن الاطلاع على مزيد من الأوصاف في تقرير سابقرقم 17. سيركز هذا البروتوكول على جانب التصوير SRS باستخدام الإثارة ضيقة النطاق.

  1. قم بإعداد طاولة بصرية معزولة عن الاهتزاز في غرفة مع التحكم في درجة الحرارة.
  2. ضع نظام ليزر مزدوج متزامن (مضخة وستوكس) على الطاولة البصرية (الشكل 2A) مع مبرد متصل.
    ملاحظة: يوفر الليزر الأساسي في نظام الليزر المزدوج قطار نبض خرج عند 1064 نانومتر مع عرض نبضة 6 ثوان ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز. شعاع ستوكس هو من الليزر الأساسي. تم تعديل شدة شعاع ستوكس بالجيوب الأنفية بواسطة محول سعة كهروبصرية مدمج (EOM) عند 8 ميجاهرتز مع عمق تعديل يزيد عن 90٪. الجزء الآخر من الليزر الأساسي هو مضاعفة التردد إلى 532 نانومتر ، والذي يستخدم أيضا لزرع متزامن مذبذب بصري بارامتري بيكو ثانية (OPO) لإنتاج قطار نبض مغلق في الوضع بعرض نبضة 5-6 ps (يتم حظر شعاع الخمول من OPO بمرشح قياس التداخل). الطول الموجي الناتج من OPO قابل للضبط من 720-950 نانومتر ، والذي يعمل بمثابة شعاع المضخة.
  3. قم بتركيب المرايا (نطاق الطول الموجي: 750-1100 نانومتر) ، ومقسمات الحزم ثنائية اللون (DBS ، مرشح 980 نانومتر طويل التمرير ، مستطيل) ، والعدسة (طلاء لوني ، AR ل 650-1050 نانومتر) على حواملها الخاصة. استخدم حوامل مرآة حركية مستقرة للغاية للمرايا ومقسمات الشعاع ثنائي الكروم.
  4. قياس ارتفاع خرج الليزر وأحجام الحزم للمضخة وحزم ستوكس. اضبط ارتفاع المرايا والعدسات لضمان وصول الضوء إلى مركز جميع العناصر البصرية.
  5. ضع المرآة M1 على الطاولة البصرية واجعلها ~ 45 درجة إلى إخراج الليزر (الشكل 2B). استخدم المقابض الموجودة على الحامل الحركي لإجراء تعديلات على الطرف والإمالة. تأكد من أن الضوء ينتقل على نفس الارتفاع على طول الطاولة وخط مستقيم فيما يتعلق بالطاولة.
  6. ضع ومحاذاة مقسمات الحزم ثنائية اللون (مرشحات التمرير الطويل 980 نانومتر) والمرايا لتقسيم المضخة وعوارض ستوكس (الشكل 2A-B).
  7. ضع وأحاذي أزواج العدسات (L1 و L2 و L3 و L4) على كل مسار من مسارات الحزم لتجميع الحزم وتوسيع أقطار الحزمة لتتناسب مع البؤبؤ الخلفي للهدف (الشكل 2A-B).
  8. استخدم مرايا M7 و M8 لمحاذاة أشعة الليزر المدمجة في المجهر (الشكل 2C). قم بمحاذاة شعاع واحد في المجهر أولا واستخدم أزواج المرآة على الشعاع الآخر لضمان التداخل المكاني للحزمتين.
  9. قم بإعداد جزء الكشف.
    1. ضع مكثف زيت مغلف بالأشعة تحت الحمراء (1.4-NA) لجمع المضخة الأمامية وعوارض ستوكس بعد المرور عبر العينات (الشكل 2C).
    2. قم بتركيب صمام ثنائي ضوئي Si كبير المساحة على صندوق محمي بموصلات BNC (الشكل 2E). أضف مصدر طاقة DC بجهد 64 فولت إلى الصمام الثنائي الضوئي المثبت لزيادة عتبة التشبع وعرض النطاق الترددي للاستجابة.
    3. عكس الضوء الأمامي مع مرآة مقاس 2 بوصة. أعد تركيز الضوء على الصمام الثنائي الضوئي بعد مرشح بصري لمنع شعاع ستوكس المعدل (الشكل 2D).
    4. أرسل تيار الإخراج الخاص بالصمام الثنائي الضوئي إلى مضخم صوت قفل سريع تم إنهاؤه ب 50 لإلغاء الإشارة. أرسل مشغل 8 ميجاهرتز إلى مضخم القفل كإشارة مرجعية.
    5. أرسل المكون X في المرحلة من مضخم القفل إلى مربع الواجهة التناظرية للمجهر.
  10. قم بتحسين التداخل الزمني مع مرحلة التأخير الآلية المدمجة عن طريق قياس إشارة SRS لسائل D2O النقي في المجهر.

5. الحصول على الصور وتحليلها

  1. قم بإجراء تصوير epr-SRS متعدد القنوات باستخدام ضبط الطول الموجي المتسلسل للمضخة.
    1. اضبط طاقة الليزر على مضخة P = 10-40 ميجاوات و PStokes = 40-80 ميجاوات على لوحة التحكم بالليزر.
    2. اضبط وقت سكن البكسل على 2-4 ميكروثانية واستخدم إطارات متعددة يبلغ متوسطها عادة 10-20 إطارا على برنامج الفحص المجهري.
      ملاحظة: تجنب الاستخدام التوافقي لطاقة الليزر العالية (مضخة P > 40 ميجاوات ، PStokes > 80 ميجاوات) وحجم البكسل الصغير (<0.2 ميكرومتر) ، والتي من المحتمل أن تسبب "تأثير التبييض" لأصباغ رامان بسبب الإثارة متعددة الفوتونات.
    3. اضبط ثوابت الوقت الخاصة بمضخم القفل على نصف وقت سكن البكسل.
  2. فك الخلط الطيفي الخطي.
    ملاحظة: يتبع epr-SRS اعتمادا خطيا صارما على الإشارة إلى التركيز على نطاق التركيز بأكمله؛ وبالتالي ، فإن فك الخلط الطيفي الخطي فعال لإزالة أي محادثات متقاطعة محتملة بين القنوات. بالنسبة لقياس قناة N epr-SRS باستخدام مجسات N MARS ، يمكن التعبير عن الإشارات المقاسة (S) على أنها S = MC ، حيث C هي تركيزات مسبار MARS ، و M عبارة عن مصفوفة N x N تحددها مقاطع رامان العرضية لمجسات MARS.
    1. قم بقياس المصفوفة M على عينات eprSRS المناعية أحادية اللون الموسومة بمجسات MARS مختلفة.
    2. استخدم المعادلة C = M−1· S لتحديد مصفوفة تركيز مسبار MARS باستخدام قياس إشارة العينة المتعددة S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 3 أمثلة على صور ل epr-SRS في عينات مختلفة، بما في ذلك الخلايا الثابتة (الشكل 3A)، وأنسجة الفئران الثابتة بارافورمالديهايد (PFA) (الشكل 3B)، والعينات البشرية المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) (الشكل 3C). الدقة المكانية للمجهر SRS محدودة الحيود ، والدقة الجانبية النموذجية هي ~ 300 نانومتر ، والدقة المحورية هي 1-2 ميكرومتر باستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة للإثارة. ونتيجة لذل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكول eprSRS المناعي الذي ينطبق على نطاق واسع على أنواع الأنسجة الشائعة ، بما في ذلك أنسجة الفئران المحفوظة حديثا ، والأنسجة البشرية FFPE ، وأنسجة الفئران المجمدة. تم التحقق من صحة Immuno-eprSRS لمجموعة من الظواهر في الخلايا والأنسجة ، كما هو موضح في الجدول 1. هذه المنصة ذات اللقطة الواحدة مناسبة بشكل خاص للتطبيقات التي لا تعمل فيها الاستراتيجيات الدورية بشكل جيد. على سبيل المثال ، يتطلب التألق الدوري الأنسجة السميكة حيث أن جولات متعددة من وضع العلامات المناعية 3D غير عملية طويلة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر روث أ. سينجر وريتشارد كيه بي بينينجر على تزويدهما بأنسجة البنكرياس الفأرية. يقر W.M. بالدعم المقدم من NIH R01 (GM128214) و R01 (GM132860) و R01 (EB029523) والجيش الأمريكي (W911NF-19-1-0214).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16٪ بارافورمالدهيد ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15710
& alpha - tubulinAbcamab18251الأجسام المضادة الأولية
& alpha ; -tubulinBioLegend625902الأجسام المضادة الأولية
& بيتا ؛ -III-tubulinBioLegend657402الأجسام المضادة الأولية
& بيتا ؛ -III-tubulinAbcamab41489الأجسام المضادة الأولية
& -tubulinAbcamab131205الأجسام المضادة الأولية
Agarose ، درجة حرارة التبلور المنخفضةSigma AldrichA9414لتضمين الدماغ
الجسم المضاد المضاد للتوبولين المنتج في الأرانب (& alpha ؛ -tubulin)Abcamab52866الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة للكالبندين المنتجة في الفأر (كالبندين)Abcamab82812الأجسام المضادة الأولية
لمستقبلات GABA B R2 & nbsp ؛ الجسم المضاد المنتج في خنزير غينيا (مستقبلات GABA B R2)Millipore SigmaAB2255الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة ل GFAP المنتجة في الماعز (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة للجلوكاجون   الأجسام المضادة المنتجة في الفأر (الجلوكاجون)سانتا كروز التكنولوجياالحيويةsc-514592الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة للأنسولين المنتجة في خنزير غينيا (الأنسولين)DAKOIR00261-2الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة ل MBP المنتجة في الفئران (MBP)Abcamab7349الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة للنيو المنتجة في الأرانب (NeuN)الأجسام المضادة الأولية للحراري العلميPA5-78639الأجسام
المضادة الأوليةالأجسام المضادة المضادة للبنكرياس (PP) المنتجة في عديد ببتيد البنكرياس الماعز (PP)سيجما ألدريتشSAB2500747الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة ل Pdx1 المنتجة في الأرانب (Pdx1)Milipore06-1379الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة للسوماتوستاتين المنتجة في الفئران (سوماتوستاتين)Abcamab30788الأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة المضادة للفيمنتين المنتجة في الدجاج ( Vimentin)Abcamab24525الأجسام المضادة الأولية
مرشح تمرير النطاقKR ElectronicsKR27248 ميجا هرتز
BNC 50 أوم Terminatorالدوائر الصغيرةSTRM-50
BNC كابلThorlabs2249-Cالمحور ، BNC ذكر / ذكر
مرآة عازلةالعريض ThorlabsBB1-E03750 - 1100 نانومتر
C57BL / 6J الفئرانمختبر جاكسون000664
الطرد
مكثفأوليمبوسغمر الزيت ، 1.4 NA
السيتوكيراتين 18Abcamab7797الأجسام المضادة الأولية
السيتوكيراتين 18Abcamab24561الأجسام المضادة الأولية
مصدر طاقة التيار المستمرTopWard6302Dجهد التحيز هو 64 فولت
ثنائي اللونThorlabsKM100CLحركي لما يصل إلى 1.3 بوصة (33 مم) بصريات مستطيلة طويلة ،
حمار أعسر مضاد للدجاج IgY (H + L)جاكسون ImmunoResearch703-005-155الأجسام المضادة الثانوية لتصريف MARS
الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) JacksonImmunoResearch705-005-147الأجسام المضادة الثانوية لاقتران MARS
الحمار المضاد لخنزير غينيا IgG (H + L) JacksonImmunoResearch706-005-148الأجسام المضادة الثانوية لاقتران MARS
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) JacksonImmunoResearch715-005-151الأجسام المضادة الثانوية لتصريف MARS
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) JacksonImmunoResearch711-005-152الأجسام المضادة الثانوية لاقتران MARS الحمار
المضاد للفئران IgG (H + L) JacksonImmunoResearch712-005-153الأجسام المضادة الثانوية لتصريف MARS
الحمار المضاد للأغنام IgG (H + L) JacksonImmunoResearch713-005-147الثانوي الأجسام المضادة لتصريف MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916الأجسام المضادة الأولية
الإيثانولسيجما ألدريتش443611
مكبر للصوتأدوات زيورخHF2LIDC - 50 ميجاهرتز
FFPE عينة الكلىUSBiomaxHuFPT072
الأجسامالمضادة
GiantinAbcamab24586الأجسام المضادة الأولية
GlucagonSanta Cruz Biotechnologysc-514592الأجسام المضادة الأولية
H2BAbcamab1790الأجسام المضادة الأولية
HeLaATCCATCC CCL-2
مرشح ممر النطاقالترددي عالي OD Chroma التكنولوجياET890 / 220mقم بتصفية شعاع Stokes ونقل شعاع المضخة
قلم مسعورفيشر ScientificNC1384846
الأنسولينThermoFisher701265الأجسام المضادة الأولية
نظام ليزر SRS المتكاملالفيزياء التطبيقية & شركة الإلكترونياتيوفر picoEMERALDpicoEMERALD قطار نبض إخراج عند 1,064 نانومتر مع عرض نبضة 6 ps ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز ، والذي يعمل كشعاع Stokes. يتم استخدام شعاع التردد المزدوج عند 532 نانومتر لزرع مذبذب بارامتري بصري بيكو ثانية (OPO) بشكل متزامن لإنتاج قطار نبض مغلق بالوضع بعرض نبضة خمسة ~ 6 ps (يتم حظر شعاع المهمل ل OPO بمرشح تداخلي). الطول الموجي الناتج ل OPO قابل للضبط من 720 &ndash ؛ 950 نانومتر ، والتي تعمل كشعاع مضخة. يتم تعديل شدة حزمة ستوكس 1,064 نانومتر جيبيا بواسطة EOM مدمج عند 8 ميجاهرتز بعمق تعديل يزيد عن 90٪. يتداخل شعاع المضخة مكانيا مع شعاع ستوكس باستخدام مرآة ثنائية اللون داخل picoEMERALD. يتم تحقيق التداخل الزمني بين المضخة وقطارات نبض Stokes من خلال مرحلة تأخير مدمجة ويتم تحسينها بواسطة إشارة SRS ل D2O النقي في المجهر.
مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوبأوليمبوسFV1200MPE
مرآة حركية جبلThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 ضابطات سداسية منخفضة
المستوى ليكتين من Triticum vulgaris (القمح)Sigma AldrichL0636-5 mg
مقسم شعاع ثنائي اللون طويل التمريرSemrockDi02-R980-25x36980 نانومتر ليزر BrightLine   جهاز تقسيم شعاع ثنائي اللون ثنائي اللون أحادي الحافة مسطح بالليزر
MAP2BioLegend801810الأجسام المضادة الأولية
برنامج التصوير بالفحص المجهريOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanلتحليلات صغيرة الحجم تعتمد على الامتصاص في قارئ لوحة.
مصل الحمار العاديJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-Well DishesFisher Scientific12-566-300
Objective LensOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, العمل Distance =  2 & thinsp ؛ فرشاة
الطلاء
مجموعة المنظارThorlabsRS99يتضمن الوحدات العلوية والسفلية ، & Oslash ؛ 1 "آخر ، وشوكة لقط.
الأس الهيدروجيني
قارئ الألواحTecanInfinite 200 PROقارئ لوحة متعدد الأوضاع سهل الاستخدام. قدرات قياس الامتصاص على نطاق طيفي يبلغ 230 & ndash ؛ 1000 نانومتر.
كاشف ProLong Gold المضاد للبهتانThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900الأجسام المضادة الأولية
Sephadex G-25 MediumGE Life Sciences17-0033-01راتنج ترشيح هلام للتحلية وتبادل العازلة
صندوق محمي مع موصلات BNC صندوقألومنيوم Pomona Electronics2902مع غطاء ، BNC أنثى / أنثى
سي الثنائي الضوئيThorlabsFDS1010350 & ndash ؛ 1100 نانومتر ، 10 مم × 10 مم منطقة نشطة
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073Gالأجسام المضادة الأولية
مسار الأنسجة Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813شريحة لاصقة لجذب وربط أقسام الأنسجة الطازجة أو الثابتة بالفورمالين كيميائيا بقوة على سطح الشريحة (شرائح زجاجية ملزمة tiisue)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069الأجسام المضادة الأولية
XylenesSigma Aldrich214736
من الدرجة النطاق جهاز المركزي حامل حامل سريع السرعة الأولية مم مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  3. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  4. Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
  5. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
  6. Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657(2018).
  7. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  8. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  9. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851(2019).
  10. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).
  13. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465(2017).
  14. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  15. Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
  16. Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
  17. Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
  18. Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).
  19. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).
  20. Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).
  21. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
  22. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
  23. Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537(2018).
  24. Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
  25. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  26. Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Stimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

مقالات ذات صلة