نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الانتشار في كل مكان لركيزة معينة و E3 ubiquitin-ligase في خلايا الثدييات. تم استخدام خطوط الخلايا HEK293T للإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم تنقية الركيزة متعددة التواجدات في كل مكان من تحلل الخلايا عن طريق الترسيب المناعي ، وتم حلها في SDS-PAGE. تم استخدام النشاف المناعي لتصور هذا التعديل بعد الترجمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في كل مكان هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يحدث في الخلايا حقيقية النواة التي تعتبر حاسمة لتنظيم العديد من المسارات البيولوجية، بما في ذلك بقاء الخلايا، وانتشار، والتمايز. إنها عملية عكسية تتكون من ارتباط تساهمي للأوبيكويتين بالركيزة من خلال تفاعل متتالي لثلاثة إنزيمات مختلفة على الأقل ، تتكون من E1 (إنزيم تنشيط Ubiquitin) ، E2 (إنزيم يوبيكويتين المقترن) ، و E3 (إنزيم Ubiquitin-ligase). يلعب مجمع E3 دورا مهما في التعرف على الركيزة والانتشار في كل مكان. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتقييم انتشار الركيزة في خلايا الثدييات باستخدام النقل المشترك العابر للبلازميد الذي يشفر الركيزة المحددة ، و E3 ubiquitin ligase ، و ubiquitin المعلمة. قبل التحلل ، يتم التعامل مع الخلايا المنقولة باستخدام مثبط البروتيازوم MG132 (كاربوبنزوكسي-لو-لو-ليوسينال) لتجنب تدهور البروتيسومال الركيزة. علاوة على ذلك ، يتم تقديم مستخلص الخلايا إلى الترسيب المناعي على نطاق صغير (IP) لتنقية الركيزة متعددة الكل كل مكان للكشف عنها لاحقا عن طريق النشاف الغربي (WB) باستخدام أجسام مضادة محددة لعلامة ubiquitin. وبالتالي ، يتم وصف بروتوكول متسق وغير معقد لفحص الانتشار في كل مكان في خلايا الثدييات لمساعدة العلماء في معالجة انتشار ركائز محددة وغازات E3 في كل مكان.
المقدمة
تعد التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) آلية مهمة فيما يتعلق بتنظيم البروتين ، وهو أمر ضروري لتوازن الخلايا. انتشار البروتين في كل مكان هو تعديل ديناميكي ومعقد يخلق مجموعة متنوعة من الإشارات المختلفة مما يؤدي إلى العديد من النتائج الخلوية في الكائنات حقيقية النواة. في كل مكان هو عملية عكسية تتكون من ربط بروتين يوبيكويتين يحتوي على 76 من الأحماض الأمينية بالركيزة ، ويحدث في سلسلة إنزيمية تتكون من ثلاثة تفاعلات متميزة1. تتميز الخطوة الأولى بتنشيط يوبيكويتين ، والذي يعتمد على التحلل المائي ATP لتشكيل يوبيكويتين عالي الطاقة مرتبط بالثيوستر بين ubiquitin C-terminus وبقايا السيستين الموجودة في الموقع النشط لإنزيم E1. في وقت لاحق ، يتم نقل يوبيكويتين إلى....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم تمثيل نظرة عامة على بروتوكول فحص الانتشار في كل مكان في خلايا الثدييات في الشكل 1.
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء فحص الانتشار في كل مكان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. زراعة الخلايا
- قم بزراعة خط الخلايا HEK293T في طبق استزراع معالج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
UXT (نسخة يتم التعبير عنها في كل مكان) هو بروتين يشبه ما قبل الفولدين يشكل مجمعات قابلة للطي للبروتين يتم التعبير عنها في كل مكان في أنسجة الفئران والبشر مثل القلب والدماغ والعضلات الهيكلية والمشيمة والبنكرياس والكلى والكبد18. تم وصف شكلين متساويين للربط من UXT ، يطلق عليهما UXT-V1 و UXT-V2 ، يؤديان وظائف متميزة ومواقع دون الخلايا. يتم توطين UXT-V1 في الغالب في السيتوبلازم وداخل الميتوكوندريا ، وهو متورط في موت الخلايا المبرمج الناجم عن TNF-α وتكوين الإشارات المضادة للفيروسات19,2.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد التواجد في كل مكان تعديلا أساسيا بعد الترجمة ينظم مستويات العديد من البروتينات ويلعب دورا حاسما في العديد من مسارات الإشارات والعمليات البيولوجية ، مما يضمن بيئة صحية داخل الخلايا. يعد نظام يوبيكوتين بروتيازوم (UPS) أحد المحاور الرئيسية للبحوث الصيدلانية الحديثة ، مما يوفر إمكانية تثبيت مثبطات الورم أو الحث على تدهور المنتجات السرطانية22. على سبيل المثال، الانتشار الشاذ لأورام خلايا البلازما المسؤولة عن إفراز الغلوبولين المناعي أحادي النسيلة في الورم النقوي المتعدد (MM) يعزز مسارا فسيولوجيا مر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
F.R.T مدعوم بمنحة FAPESP رقم 2020/15771-6 و CNPq Universal 405836/2018-0. يتم دعم P.M.S.P و V.S بواسطة CAPES. تم دعم C.R.S.T.B.C بمنحة FAPESP رقم 2019/23466-1. نشكر ساندرا ر. س. ماروياما (FAPESP 2016/20258-0) على الدعم المادي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 مم TC معالج طبق ثقافة | Corning | 430167 | |
| أنبوب 15 مل | Corning | 430766 | |
| 96 بئر صفيحة | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA | حبات Sigma-Aldrich | E6779 | |
| الأجسام المضادة للفأر | Seracare | 5220-0341 | الماعز المضاد للفأر IgG |
| الأجسام المضادة للأرانب | Seracare | 5220-0337 | الماعز المضاد للأرانب IgG |
| المضاد للأجسام المضادة للأكتين | Sigma-Aldrich | A3853 | التخفيف المستخدم: 1: 2000 |
| الأجسام المضادة المضادة ل Fbxo7 | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | التخفيف المستخدم: 1: 1000 |
| الأجسام المضادة المضادة ل HA | Sigma-Aldrich | H3663 | التخفيف المستخدم: 1: 1000 |
| خلية | الأجسام المضادة المضادة | ل Myc 2272 | التخفيف المستخدمة: 1: 1000 |
| كاشف برادفورد | سيجما-ألدريتش | B6916-500ML | |
| BSA | سيجما-ألدريتش | A9647-100G | الألبومين في مصل الأبقار |
| Nuaire | NU-4850 | ||
| طرد مركزي | Eppendorf | 5804R | 500 × g< / em> لمدة 5 دقائق |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco s النسر المعدل s متوسط | Corning | 10-017-CRV | مصل الأبقار الجنيني عالي الجلوكوز |
| Gibco | F4135 | ترشيح الاستخدام المسبق | |
| ببتيد HA | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| خلايا HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR علوم الحياة | 0365-500G | |
| كلاين دوار | تكنولوجيا التجارة العالمية | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na 3< / sub>VO4< / sub> (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose غشاء | نشاف GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| مجهر بصري | OPTIKA | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | للثدييات التعبير |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | & nbsp ؛ تبرع بلطف الدكتور مارسيلو دام ؛ علامة ريو | 2xFlag (N-terminal). إنزيمات التقييد: EcoRI و XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7- & Delta ؛ F-box | تبرع بلطف الدكتور مارسيلو دام ؛ علامة ريو | 2xFlag (N-terminal). إنزيمات التقييد: EcoRI و XhoI. &دلتا. 335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | تبرع بلطف الدكتور مارسيلو دام ؛ ريو | تاغ HA (C-terminal). إنزيمات التقييد: EcoRI و XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | تبرع بلطف الدكتور مارسيلو دام ؛ علامة ريو | 6x-His-Myc (N-terminal). إنزيمات التقييد: EcoRI و KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x | AccuGENE | 51226 | للحصول على 1x PBS ، قم بتخفيف 10x PBS في ماء عالي النقاء |
| بولي إيثيلينيمين (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| كوكتيل مثبط البروتياز SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| هزاز شاكر | Kasvi | 19010005 | |
| نظام SDS-PAGE | BioRad | 165-8004 | |
| محلول الخالط | فينيكس Luferco | AP-22 | |
| قاعدة Trizma | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| التربسين (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| كاشف اللومينول الغربي النشاف | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | SC-2048 |
المراجع
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
- Koegl, M., et al. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
