يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. يمكن تحليل القرنيات المجددة أو المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحقيق في تجديد الأنسجة الخالية من الندوب في قرنية الفرخ الجنينية المصابة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تظهر جروح القرنية الجنينية في الفرخ قدرة ملحوظة على التجدد الكامل والسريع ، في حين تعاني القرنيات المصابة البالغة من فقدان الشفافية بسبب الندوب الليفية. يتم استعادة سلامة أنسجة القرنيات الجنينية المصابة بشكل جوهري مع عدم وجود ندبة يمكن اكتشافها. نظرا لسهولة الوصول إليه وسهولة التلاعب به ، يعد جنين الفرخ نموذجا مثاليا لدراسة إصلاح جرح القرنية بدون ندبة. يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية الفرخ الجنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في العصور الجنينية المبكرة للوصول إلى العين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكيل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية. ثالثا ، يتم إجراء جروح القرنية الخطية التي تخترق الطبقة الظهارية الخارجية والسدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح. وقد كشفت الدراسات التي أجريت حتى الآن باستخدام هذا النموذج أن القرنيات الجنينية المصابة تظهر تنشيط تمايز الخلايا القرنية، وتخضع لإعادة تشكيل منسقة لبروتينات ECM إلى بنيتها الكلية ثلاثية الأبعاد الأصلية، وتصبح معصبة بشكل كاف بواسطة الأعصاب الحسية القرنية. في المستقبل ، يمكن تحليل التأثير المحتمل للعوامل الداخلية أو الخارجية على عملية التجدد في القرنيات الشافية باستخدام تقنيات البيولوجيا التنموية ، مثل تطعيم الأنسجة ، أو الكهربية ، أو العدوى الفيروسية الرجعية ، أو زرع الخرز. تحدد الاستراتيجية الحالية الفرخ الجنيني كنموذج تجريبي حاسم لتوضيح العوامل الجزيئية والخلوية التي تنسق التئام جروح القرنية بدون ندوب.
المقدمة
القرنية هي النسيج الشفاف والخارجي للعين الذي ينقل وينكسر الضوء الذي يؤدي إلى حدة البصر. في القرنية البالغة ، يؤدي تلف أو عدوى سدى القرنية إلى استجابة سريعة وقوية لالتئام الجروح تتميز بانتشار الخلايا القرنية ، والتليف ، وزيادة الالتهاب الذي يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين ، وتوليد الخلايا الليفية العضلية الإصلاحية ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) بشكل عام 1,2 . بعد الإصابة ، يؤدي إصلاح أنسجة القرنية هذا إلى أنسجة ندبية غير شفافة تقلل من شفافية القرنية وتمنع مرور الضوء ، وبالتالي تشوه الرؤية ، وفي الحالات الشديدة ، تؤدي إلى عمى القرنية3. وبالتالي ، هناك حاجة واضحة لتطوير نماذج حيوانية موثوقة لمعالجة تعقيدات التئام الجروح وتحديد العوامل الخلوية والجزيئية المسؤولة عن إغلاق الجروح وتجديد الأنسجة.
حتى الآن ، استخدمت معظم الدراسات التي تدرس التئام جروح القرنية نماذج حيوانية بعد الولادة4 أو البالغين1،2،5،6،7. في حين أن هذه الدراسات قد أدت إلى تقدم كبير في فهم استجابة التئام جروح القرنية والآليات الكامنة وراء تكوين الندبات ، فإن أنسجة القرنية التالفة في نماذج الشفاء هذه تفشل في التجدد الكامل ، مما يحد من فائدتها لتحديد العوامل الجزيئية والآليات الخلوية المسؤولة عن تلخيص كامل لمورفولوجيا القرنية وهيكلها بعد الإصابة. على النقيض من ذلك ، فإن جروح الجنين الناتجة بسكين في قرنية الفرخ الجنينية تمتلك قدرة جوهرية على الشفاء التام بطريقة خالية من الندوب8. على وجه التحديد ، تظهر قرنية الفرخ الجنينية تجديدا غير ليفي مع التلخيص الكامل لبنية المصفوفة خارج الخلية وأنماط التعصيب 8,9.
يصف هذا البروتوكول سلسلة من الخطوات التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في الأعمار الجنينية المبكرة لتسهيل الوصول إلى الجنين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية ويكون الجرح مطلوبا. ثالثا ، يتم إجراء شقوق القرنية المركزية الخطية التي تخترق ظهارة القرنية وفي السدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كانت سلالة البيض المستخدمة في هذا البروتوكول هي White Leghorn ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة إلينوي ويسليان.
1. حضانة بيض الفرخ
- حافظ على البيض عند ~ 10 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد وضعها لوقف التطور. عندما تكون مستعدا لبدء نمو جنين الفرخ ، امسح قشر البيض بالكامل بمناديل خالية من الوبر (انظر جدول المواد) مشبعة بالماء في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأوساخ والحطام.
- تأكد من تعقيم قشر البيض. امسح سطح البيض بالكامل باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. امسح الإيثانول بسرعة لتجفيف البويضة وتجنب امتصاص الإيثانول من خلال قشر البيض إلى الجنين.
- رتب البيض أفقيا على صينية. ضع علامة على الجزء العلوي من البويضة للإشارة إلى الموضع المتوقع للجنين. احتضن البيض أفقيا ، مع تنشيط وظيفة الهزاز ، في حاضنة رطبة 38 درجة مئوية.
2. نافذة البيض للتحضير لتشريح الغشاء
- إزالة البيض من الحاضنة في اليوم الثالث من التطور الجنيني (E3). قم بتعقيم الجزء العلوي من البيض باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. تجفيف الإيثانول من أسطح قشر البيض.
ملاحظة: لضمان عدم تأخير التطور أثناء إجراء النوافذ ، تمت إزالة 6-12 بيضة ، وتم تنفيذ الإجراء بسرعة على هذه البويضات بينما تركت البويضات المتبقية في الحاضنة. - ضع البيضة أفقيا في حامل بيض آمن (انظر جدول المواد). باستخدام النهاية الحادة لمقص التشريح ، قم بإنشاء ثقب صغير في الجزء العلوي من قشر البيض بالقرب من النهاية المدببة للبيضة.
ملاحظة: سيسهل هذا الثقب إزالة الزلال ، وهو أمر ضروري لإسقاط صفار البيض والجنين بعيدا عن سطح قشر البيض الداخلي. بالنسبة لحاملي البيض ، تم استخدام شقق حشو البيض من لب الورق ، والتي يتم شحن البيض داخلها. - من خلال الثقب (الخطوة 2.2) ، أدخل إبرة تحت الجلد مشطوفة 18 G. مع دفع الإبرة إلى السطح الداخلي السفلي للبويضة والجانب المائل من الإبرة الذي يواجه الطرف المدبب للبويضة (على سبيل المثال ، بعيدا عن الموقع المتوقع لصفار البيض والجنين بالقرب من منتصف البيضة) ، قم بإزالة 2-3 مل من الزلال من بيضة الدجاج وتخلص منها.
ملاحظة: إذا كانت إبرة الشخص تصطدم بالجنين أو الأوعية الدموية المرتبطة به خلال هذه الخطوة، فسيؤدي ذلك إلى شفط الدم مع الزلال. هذا سيؤدي إلى وفاة الجنين. علاوة على ذلك ، إذا تم شفط صفار البيض عن غير قصد مع الزلال خلال هذه الخطوة ، فلن يكون الجنين قابلا للحياة. في كلتا الحالتين ، يجب التخلص من البويضة إذا لم يكن من الممكن استخدام الجنين على الفور لأغراض أخرى. - نظف سطح قشر البيض المحيط بالثقب باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة قليلا بالإيثانول بنسبة 70٪ وامسحها جافة. ختم الثقب المصنوع لإزالة الزلال بشريط شفاف.
- مع النهاية الحادة لمقص التشريح ، قم بعمل ثقب "نافذة" ثان في الجزء العلوي من قشر البيض في موقع وضع العلامات (الخطوة 1.3). تأكد من أن المقص لا يمتد بعيدا جدا في قشر البيض لتجنب ملامسة الجنين أو الأوعية الدموية الجنينية وإتلافها ، والتي غالبا ما يتم وضعها داخل البويضة أسفل موقع الثقب الثاني مباشرة.
- باستخدام ملقط القزحية المنحني ، قم بتوسيع ثقب "النافذة" ليمتد قطره ~ 2-3 سم ويكون بمثابة "نافذة" للجنين النامي أسفل القشرة.
- أدخل أحد طرفي الملقط في الحفرة ، مع إبقائه موازيا لقشر البيض ومتجاورا بشكل وثيق. مع وضع نهاية الملقط الأخرى خارج قشر البيض ، قم بقرصة نهايتين الملقطتين بعناية معا ، مما يسمح لهما بكسر وإزالة قطع صغيرة من قشر البيض. استمر في كسر وإزالة شظايا قشر البيض حتى تبقى نافذة 2-3 سم تتراكب مباشرة على الجنين.
ملاحظة: البيض الذي لا توضع فيه الأجنة مباشرة تحت الثقب المصنوع في الخطوة 2.6. يجب ألا تستخدم لأن تشريح الغشاء القادم سيكون من الصعب إكماله. حتى مع هز البيض أفقيا ، فإن حوالي 10٪ من البيض غير صالح للاستخدام بسبب سوء وضع الجنين. يمكن استخدام هذه الأجنة لأغراض أخرى.
- أدخل أحد طرفي الملقط في الحفرة ، مع إبقائه موازيا لقشر البيض ومتجاورا بشكل وثيق. مع وضع نهاية الملقط الأخرى خارج قشر البيض ، قم بقرصة نهايتين الملقطتين بعناية معا ، مما يسمح لهما بكسر وإزالة قطع صغيرة من قشر البيض. استمر في كسر وإزالة شظايا قشر البيض حتى تبقى نافذة 2-3 سم تتراكب مباشرة على الجنين.
- للحد من التلوث البكتيري ، أضف من خلال ثقب النافذة (على سبيل المثال ، في البيضة) ~ 100-200 ميكرولتر من محلول رينجر (8 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.37 غرام من KCl ، و 0.23 غرام من CaCl 2.2H 2 0 لكل لتر من H2المقطر 0) يحتوي على المضادات الحيوية البنسلين/ الستربتومايسين (50 U / مل من البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، انظر جدول المواد).
- قم بإغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط لاصق شفاف. قم بإجراء ختم البيض عن طريق محاذاة زاوية من الشريط على المحور الطويل للثقب والضغط على الشريط إلى القشرة على بعد 1-2 سم تقريبا من حافة الحفرة.
- استمر في الختم حول الفتحة حتى يتم ترك رفرف معلق من الشريط على جانب واحد. اضغط على قطعتي الشريط معا ، مما يخلق شكلا مقببا فوق الثقب ، واضغط على رفرف الشريط المتدلي على القشرة لإنهاء ختم البيضة.
ملاحظة: يجب وضع البيض في نافذة إما E2 أو E3. وفقا للتجربة، يؤدي النوافذ قبل E2 إلى انخفاض صلاحية الجنين. علاوة على ذلك ، بواسطة E4 ، يصبح الجنين والأغشية خارج الجنين ملتصقة بقشر البيض10 ، وغالبا ما تؤدي أي محاولات للنافذة في E4 أو في وقت لاحق إلى تلف الجنين أو تمزق الأوعية الدموية خارج الجنين ، مع أي من الحدثين يؤدي إلى نتيجة موت الجنين.
- استمر في الختم حول الفتحة حتى يتم ترك رفرف معلق من الشريط على جانب واحد. اضغط على قطعتي الشريط معا ، مما يخلق شكلا مقببا فوق الثقب ، واضغط على رفرف الشريط المتدلي على القشرة لإنهاء ختم البيضة.
- أعد البيض "النافذة" إلى الحاضنة لمزيد من التطوير. تأكد من إبقاء البيض أفقيا وإيقاف تشغيل وظيفة هزاز الحاضنة.
- كرر الخطوات 2.2.-2.9. لكل بيضة.
3. التشريح المجهري للأغشية خارج الجنين
- قم بإزالة بيضة E5.5 ذات النوافذ من الحاضنة. كشف الجنين عن طريق قطع الشريط بعيدا عن النافذة باستخدام مقص تشريح معقم.
- استخدم مجهرا تشريحيا لمراقبة الجنين وأغشيته خارج الجنين من خلال النافذة. إذا لزم الأمر ، استخدم المقص أو ملقط القزحية المنحني لتوسيع النافذة بحيث يكون الجنين في وضع جيد أسفل النافذة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية الجنينية.
- أضف قطرتين من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- استخدم مجهر تشريح للتأكد من أن الجنين في مرحلة النمو المناسبة (هامبورغر هاملتون المرحلة 27 ، ~ E5.5)11,12 وتحديد مواقع الغشاء السلوي (ACM) والغشاء المشيمي (CAM).
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون الجنين محاطا ب ACM ، والذي يتكون من الغشاء الأمنيوسي والغشاء المشيمي العلوي المنصهر والمغطى جزئيا بواسطة allantois عالي الأوعية الدموية ، والذي يمتد من منطقة الأمعاء الجنين ويندمج مع المشيمية المتراكبة لتشكيل CAM11,12. لا يتم إجراء ACM بشكل كبير في الأوعية الدموية ، مما يمكن المرء من تشريح هذه الأغشية لفضح الجنين دون إتلاف الأوعية الدموية وإلحاق الضرر بالجنين. - إجراء تشريح الغشاء خارج الجنين في هذه المرحلة (E5.5).
ملاحظة: E5.5 هو الوقت المثالي لإجراء تشريح الغشاء خارج الجنين. تشريح الأغشية في وقت مبكر (على سبيل المثال ، في E4) قبل تشكيل CAM يقلل من إمكانية الوصول إلى الجنين في المراحل اللاحقة11. علاوة على ذلك ، في E5.5 ، يتم تغطية الجنين جزئيا فقط بواسطة CAM عالي الأوعية الدموية ، ولكن على مدار الأيام 1-2 التالية ، يغلف CAM بسرعة ويمنع المزيد من الوصول إلى الجنين11,12. لهذا السبب ، فإن تشريح الغشاء في E6 أو في وقت لاحق يمثل تحديا مع زيادة خطر تمزق الأوعية الدموية.- استخدم زوجا من الملقط الناعم المعقم للإمساك بلطف ACM وسحبه بعيدا عن الجنين. ثم استخدم مقص تشريح دقيق معقم لقطع ثقب في ACM مباشرة فوق الطرف الأمامي الذي يمتد من الغشاء الذي يغطي الطرف الأمامي إلى الغشاء الذي يغطي الرأس.
ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على استرخاء أغشية المشيمة والسلى، مما يسهل الإمساك بها وتشريحها باستخدام الملقط في الخطوات التالية. انظر الشكل 1 للحصول على مخطط مفيد لكيفية تشريح الأغشية من خلال نافذة قشر البيض.
- استخدم زوجا من الملقط الناعم المعقم للإمساك بلطف ACM وسحبه بعيدا عن الجنين. ثم استخدم مقص تشريح دقيق معقم لقطع ثقب في ACM مباشرة فوق الطرف الأمامي الذي يمتد من الغشاء الذي يغطي الطرف الأمامي إلى الغشاء الذي يغطي الرأس.
- استخدم زوجين من الملقط الناعم والمعقم للقبض بلطف على السلى في وضعين متجاورين بين ACM و CAM (على سبيل المثال ، منطقة بين القطع المصنوع فوق الطرف الأمامي وأقرب حافة من CAM).
- حرك بعناية كل زوج من الملقط ، وكلاهما يمسك الغشاء الأمنيوسي بقوة ، بعيدا عن بعضهما البعض ، مع تحرك زوج واحد ظهريا إلى الجنين والآخر بطنيا.
ملاحظة: تعمل هذه الحركة على تمزيق السلى بشكل أكبر مع فصل ACM (الذي يتم سحبه في الاتجاه الظهري فيما يتعلق بالجنين بواسطة زوج واحد من الملقط) و CAM (الذي يتم سحبه في الاتجاه البطني فيما يتعلق بالجنين بواسطة الزوج الآخر من الملقط). - تأكد من فصل الأغشية عندما لا يغطي الطب التكميلي والبديل الجنين والشريان والوريد الألانتويك ، الذي ينبعث من الأمعاء الجنينية إلى CAM ، واضح بسهولة.
- حرك بعناية كل زوج من الملقط ، وكلاهما يمسك الغشاء الأمنيوسي بقوة ، بعيدا عن بعضهما البعض ، مع تحرك زوج واحد ظهريا إلى الجنين والآخر بطنيا.
- استخدم ملقط ناعم معقم لتشريح وإزالة أي غشاء أمنيون متبق يغطي الجنين. ويلاحظ بشكل شائع أن السلى المتبقي سيغطي جزئيا النصف الذيلي من الجنين.
- باستخدام ملقط معقم ، أمسك السلى بالقرب من منطقة منتصف الجمجمة من الجنين واسحب السلى بعناية في اتجاه ذيلي فيما يتعلق بالجنين نحو CAM النازح السابق. سيتم الآن كشف الجنين بالكامل ، وسيحدث المزيد من نمو CAM بشكل رئيسي بعيدا عن الجنين النامي.
ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على مخطط مفيد حول كيفية ظهور الجنين المكشوف بعد تشريح الغشاء. راجع أيضا التقرير11 المنشور مسبقا للحصول على مخططات تخطيطية مفيدة للخطوات من 3.3.-3.6.
- باستخدام ملقط معقم ، أمسك السلى بالقرب من منطقة منتصف الجمجمة من الجنين واسحب السلى بعناية في اتجاه ذيلي فيما يتعلق بالجنين نحو CAM النازح السابق. سيتم الآن كشف الجنين بالكامل ، وسيحدث المزيد من نمو CAM بشكل رئيسي بعيدا عن الجنين النامي.
- أضف بضع قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- أعد إغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط شفاف، كما هو موضح في الخطوة 2.8. أعد البيضة إلى الحاضنة لمزيد من التطوير ، مع الحفاظ على البويضة أفقية والحفاظ على وظيفة هزاز الحاضنة غير نشطة.
- كرر الخطوات 3.1.-3.8. لكل بيضة.
ملاحظة: سيمكن تشريح الغشاء خارج الجنين في E5.5 الموصوف أعلاه من الوصول إلى الجنين من خلال E7 ، وهو الوقت الذي يمكن فيه إجراء الجرح 8,9. بحلول E8 ، يبدأ النمو المستمر لأنسجة CAM في تغطية منطقة الجمجمة من الجنين ، وبالتالي منع المزيد من الوصول إلى القرنية. إذا كان المرء يرغب في إجراء جرح في القرنيات القديمة E8-E9 ، فمن الممكن إعادة وضع CAM البطني المتنامي فيما يتعلق بالجنين (الخطوة 3.10). إذا كان المرء يرغب في الجرح في E7 ، الخطوة 3.10. ليس من الضروري القيام به ويمكن للمرء أن ينتقل إلى الخطوة 4 ، جرح القرنية. - قم بإزالة بويضة E7 من الحاضنة التي تم تشريح أغشيتها خارج الجنين سابقا في E5.5 (الخطوات 3.1.-3.8). أمسك بالملقط المعقم أي أنسجة غشاء أمنيون متاحة تنصهر في CAM واسحب غشاء السلى بلطف بعيدا عن منطقة الجمجمة من الجنين في اتجاه بطني فيما يتعلق بالجنين.
ملاحظة: نظرا لأن الغشاء الأمنيوني الذي يتم إزاحته بعيدا عن الجنين يتم دمجه في CAM ، فإن CAM المتنامي وعالي الأوعية الدموية سيتبع ملقط الإمساك بالسلى ويبتعد عن منطقة الجمجمة. كرر هذه الخطوة يوميا لإزاحة الطب التكميلي والبديل باستمرار بعيدا عن الجنين حتى يكون الجنين في السن المطلوبة للجرح.
4. جرح القرنية
- احصل على بويضة من الحاضنة للجرح في العمر الجنيني المطلوب ، E7-E9. كشف الجنين عن طريق قطع الشريط بعيدا عن النافذة باستخدام مقص تشريح معقم. أضف بضع قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- استخدم سكين تشريح دقيق لإجراء شق يمتد على مدى قرنية العين اليمنى (نظرا لكيفية وضع الجنين في البويضة ، لا يمكن الوصول إلى العين اليسرى ولكن يمكن أن تكون بمثابة تحكم غير مصاب) ، وهو مواز ويتماشى مع الشق المشيمي (الشكل 1). سوف يجتاز القطع الأول ظهارة القرنية.
- استخدم سكين التشريح الدقيق لتمزيق القرنية مرة أخرى في نفس مكان الشق الأول 2x أكثر (على سبيل المثال ، ثلاثة جروح إجمالية ، مع قطع 2 وقطع 3 تحدث جنبا إلى جنب مع نفس الوضع في القرنية مثل القطع 1)11. سوف يجتاز التمزق الثاني الغشاء السفلي ، والثالث سوف يخترق السدى الأمامي.
ملاحظة: إذا استقر الجنين تحت CAM التشريح ، فيمكن للمرء استخدام ملقط قزحية منحني معقم لتحريك الرأس بعناية من تحت CAM. ضع ملقط القزحية المنحني أسفل الرأس ، مع ملامسة الجانب الأيسر من الرأس. احمل الرأس بالكامل فوق ملقط القزحية المنحني المغلق وارفع الرأس برفق حول الكاميرا وفوقها. للمساعدة في الجدوى، استخدم تقنية مماثلة مع ملقط القزحية المنحني لثني الجنين مرة أخرى تحت CAM بعد الجراحة لتعزيز النمو السليم ل CAM.
- استخدم سكين التشريح الدقيق لتمزيق القرنية مرة أخرى في نفس مكان الشق الأول 2x أكثر (على سبيل المثال ، ثلاثة جروح إجمالية ، مع قطع 2 وقطع 3 تحدث جنبا إلى جنب مع نفس الوضع في القرنية مثل القطع 1)11. سوف يجتاز التمزق الثاني الغشاء السفلي ، والثالث سوف يخترق السدى الأمامي.
- أضف 3-4 قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- أعد إغلاق فتحة النافذة بشريط شفاف والعودة إلى الحاضنة ، تاركا البيضة أفقية. اسمح للجنين بالتطور ولجرح القرنية بالشفاء للفترة المطلوبة (على سبيل المثال ، 0.5-11 يوما) ، ثم قم بالقتل الرحيم للجنين إنسانيا عن طريق قطع الرأس.
- استخدم ملقط القزحية المنحني لحصاد العين من جنين تم قتله الرحيم يطفو في طبق بتري من محلول رينجر الملحي عن طريق الإمساك بالعين بلطف على جانبها الخلفي ، حيث تلتقي العين وأنسجة الوجه ، ورفع العين بالكامل بعناية بعيدا وخالية من أنسجة الوجه.
- استخدم ملقط ناعم لكزة ثقب صغير (3-5 سم) في الجزء الخلفي من العين بأكملها وإصلاح العين بأكملها في 4٪ بارافورمالديهايد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع إثارة خفيفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد التشريح السابق ل ACM و CAM في E5.5 لفضح منطقة الجمجمة للجنين النامي ، تم إجراء سلسلة من التمزقات التي امتدت عبر القرنية المركزية E7 في البويضة (الشكل 1). يحدث الجرح المثالي لدراسة تجديد القرنية بعد ثلاثة تمزقات ، كل منها مصنوع في نفس موقع القرنية. يجتاز التمزق الأول ظهارة القرنية ، بينما يخترق التمزقان الثاني والثالث الغشاء السفلي الأساسي والسدى الأمامي ، على التوالي. لتحقيق جرح مثالي ، من الأهمية بمكان استخدام سكين تشريح دقيق حاد (انظر جدول المواد) وتطبيق الكمي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الفرخ هو نظام نموذجي مثالي لدراسة إصلاح جرح القرنية الجنيني الخالي من الندوب. على عكس الثدييات ، يمكن الوصول بسهولة إلى الفرخ طوال فترة التطوير باستخدام استراتيجيات ovo 8 أو ex ovo 24. قرنية الفرخ الجنينية أكبر بكثير من قرنية القوارض ، مع ما يقرب من 50 ٪ من حجم الجمجمة المخصصة للعين25 ، مما يجعلها قابلة للغاية للتلاعبات الجسدية مثل الجرح. وعلاوة على ذلك، فإن بيض الدجاج متاح بسهولة على مدار السنة، وغالبا ما يكون من المزارع المحلية، و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة فيما يتعلق بالمعلومات المقدمة في هذه المخطوطة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة التطوير الفني والعلمي من خلال جامعة إلينوي ويسليان إلى TS وبتمويل جزئي من NIH-R01EY022158 (PL).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 18 جرام إبرة تحت الجلد | فيشر Scientific | 14-826-5D | |
| 30 درجة بزاوية سكين | أدوات العلوم الدقيقة | 10056-12 | |
| 4 & prime ؛ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | المجسات الجزيئية | D1306 | |
| 5 مل حقنة | فيشر Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor الأجسام | المضادة الثانوية المسمىالمجسات | ||
| هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>-H 2< / sub>0) صواني | Sigma | C8106 | |
| GQF | O246 | ||
| ملقط تشريح ، طرف ناعم ، مقص | VWR | 82027-408 | |
| مقص تشريح ، طرف حاد | VWR | 82027-578 | |
| قزحية 1 × 2 أنسجة أسنان ملقط ، VWR منحني | كامل 100494-908 | ||
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| مقص تشريح دقيق | VWR | 470315-228 | |
| الفأر المضاد للفيبرونكتين (IgG1) | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | B3 / D6 | |
| الفأر المضاد لللامينين (IgG1) | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | 3H11 | |
| الفأر المضادة للخلايا العصبية الخاصة بيتا توبولين (Tuj1 ، IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| الفأر المضاد للتيناسين (IgG1) | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | M1-B4 | |
| بارافورمالديهايد | سيجما | 158127 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | سيجما | P4333 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | سيجما | P5405 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر | Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 حاضنة البيض | GQF | 1502 | |
| تمزق بالتغليف اليدوي (عرض 1.88 بوصة) | سكوتش | غير |
المراجع
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
- Waldvogel, J. A. The bird's eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
