حصل هذا البروتوكول على موافقة أخلاقية من لجنة رعاية واستخدامه في مستشفى تشونغشان بجامعة فودان ، ويتبع توصيات دليل رعاية واستخدام المختبر (رقم 85-23 ، تمت مراجعته 2011 ؛ المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية).
ملاحظة: أجريت تجارب على على ذكور الفئران C57BL / 6J > عمر 10 أسابيع. يجب أن يكون الجراح في هذا البروتوكول ماهرا في التلاعب بتخطيط صدى القلب في الفئران ، قبل إجراء عملية الواقع المعزز في الفأر. ومع ذلك ، في معظم المؤسسات البحثية ، يتم تشغيل تخطيط صدى القلب للقوارض الصغيرة بواسطة منشأة أساسية ، لذلك يمكن للجراح التعاون عن كثب مع الخبراء الأساسيين ، إن لم يكن جراحا متمرسا في تخطيط صدى القلب. تجربة قياس ديناميكا الدم الغازية في الفأر ميزة إضافية.
1. التحضير للتصوير بالموجات فوق الصوتية (إلزامي) وقياس ديناميكا الدم الغازي (اختياري)
- ابدأ تشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية المتصل بمسبار 30 ميجاهرتز. اضبط منصة الموجات فوق الصوتية التي يتم التحكم في درجة حرارتها في وضع عرض قوس الأبهر ، حيث يتم إمالة الجانب الأيمن من الماوس لأعلى.
ملاحظة: يوصى بوضع الطرف الجمجفي لمنصة الموجات فوق الصوتية باتجاه الجراح. ومع ذلك ، يجب أن يعتمد ما إذا كانت نهاية الجمجمة أو النهاية الذيلية تجاه الجراح على أيهما يشعر الجراح براحة أكبر معه.
- قم بتوصيل مقياس الضغط الصغير (قسطرة الضغط) بجهاز الحصول على البيانات والمحول التناظري / الرقمي. اغمر كوفيت معايرة الميكرومانومتر في محلول ملحي لمعايرة المحلول الملحي.
ملاحظة: إذا سمحت الحالة بذلك ، يمكن أيضا استخدام قسطرة حجم الضغط. نستخدم قسطرة الضغط لأن جهاز الحصول على بيانات الضغط في المختبر يجمع بيانات الضغط فقط وليس لديه القدرة على جمع البيانات المتعلقة بالحجم ، على الرغم من أن نتائج تخطيط صدى القلب في الدراسة الحالية يمكن أن تحدد أيضا أحجام الجهد المنخفض.
2. تخدير الفئران وإعداد الأجهزة الجراحية وعزل RCCA
ملاحظة: يجب تعقيم الأدوات الجراحية وتعقيمها قبل الاستخدام. يوصى بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. يوصى أيضا بإجراء إزالة الشعر قبل يوم واحد لتوفير الوقت أثناء إجراء التصوير ، وتقليل استجابات الإجهاد غير المرغوب فيها المحتملة في الفئران ، والحفاظ على نظافة وجفاف الصدر والأطراف.
- قم بتخدير الفأر في حجرة الحث ، والتي يتم توصيلها بجهاز مبخر مضبوطة على 4٪ من الأيزوفلوران الممزوج ب 0.8 لتر / دقيقة من الأكسجين. عندما ينام الماوس أو يختفي منعكس قرصة الذيل ، أخرج من غرفة الحث.
- ضع في وضع ضعيف على صفيحة نحاسية يتم تسخينها بواسطة وسادة تدفئة. قم بتوصيل أنفه بمخروط الأنف ، حيث يتم توصيل 1.5٪ من الأيزوفلوران الممزوج ب 0.8 لتر / دقيقة من الأكسجين للحفاظ على مستوى ثابت من التخدير.
ملاحظة: يوصى باستخدام صفيحة نحاسية لأنها ملائمة للتنظيف ومقاومة للصدأ ، على الرغم من أنه يمكن استبدالها بنوع آخر من الألواح المعدنية.
- ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف تحت التخدير ولصق الأطراف على الصفيحة النحاسية. قم بإزالة الشعر من الرقبة والصدر باستخدام كريم إزالة الشعر وتنظيف المنطقة منزوعة الشعر بنسبة 75٪ من الإيثانول.
- قم بإعداد الأدوات الجراحية اللازمة ، بما في ذلك الملقط والمقصات المختلفة (الشكل 2 أ ؛ انظر جدول المواد).
- قم بعمل شق متوسط طولي ، حوالي 1 سم ، في الرقبة باستخدام ملقط إبهام منحني ومقص مستقيم ، بين الفك السفلي والقص.
- قم بتشريح الجزء الأيسر والأيمن من الغدة الدرقية بصراحة باستخدام زوجين من الملقط. باستخدام ملقط الإبهام الناعم المنحني ، افصل العضلة الجذعية والأنسجة الدهنية في المنطقة المجاورة للقصبة الهوائية اليمنى لفضح RCCA لأطول فترة ممكنة. تجنب إصابة العصب المبهم في جميع الأوقات ، حيث يمكن أن يسبب ذلك انخفاض ضغط الدم وبطء القلب والموت (الشكل 2 ب).
3. القسطرة من خلال RCCA والشريان الأورطي الصاعد تحت إشراف الموجات فوق الصوتية
- مرر خيطين من الحرير 6-0 ، حوالي 5 سم لكل منهما ، تحت الإناء. اربط RCCA البعيدة بعقدة ضيقة باستخدام خيط واحد وقم بتثبيت طرفي العقدة الضيقة بجوار رأس للحفاظ على التوتر الخفيف على RCCA. سيسهل هذا الإجراء القسطرة في الخطوات القادمة.
- ضع عقدة فضفاضة على RCCA القريب باستخدام الخيط الثاني. هذا يملأ المنطقة المغلقة من RCCA بالدم ، مما يسهل شقها.
- استخدم مقصا صغيرا لقطع فتحة على شكل إسفين ، 1-2 مم قريبة من العقدة الضيقة ، لفتح RCCA. تأكد من أن حجم الشق ليس صغيرا جدا بحيث لا يمكن إدخال قسطرة ، ولا كبير جدا بحيث لا ينكسر أثناء الإدخال.
ملاحظة: يوصى بشدة بالشق تحت المجهر. يعد ثقب ثقب ثقب صغير في الوعاء بإبرة 26 جم طريقة بديلة.
- قم بإعداد قسطرة بلاستيكية تحتوي على سلك معدني (الشكل 2 ج). قم بتمديد الشق باستخدام ملقط ربط منحني طويل اليد ، وأدخل القسطرة البلاستيكية التي تحتوي على السلك المعدني في RCCA ، وتحرك للأمام إلى العقدة السائبة.
- قم بتخفيف العقدة السائبة لدفع القسطرة والأسلاك حوالي 2 سم. انقل الصفيحة النحاسية التي تحتوي على إلى منصة الموجات فوق الصوتية ، وقم بتطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على عنق الفأر وصدره ، ثم قم بإعادة توجيه القسطرة والأسلاك بعناية عبر RCCA والشريان الأورطي الصاعد تحت توجيه الموجات فوق الصوتية.
4. ثقب الصمامات الأبهرية تحت توجيه الموجات فوق الصوتية
- اجمع بيانات الموجات فوق الصوتية القاعدية في وضع دوبلر الملون ووضع دوبلر الموجة النبضية قبل أن تصل القسطرة البلاستيكية والسلك المعدني إلى فتحة الأبهر.
- مع الموجات فوق الصوتية التي تظهر في وقت واحد وبوضوح الشريان الأورطي الصاعد ، ومسار التدفق المنخفض ، والقسطرة ، والسلك ، عندما تصل القسطرة والسلك إلى فتحة الأبهر ، يبرز طرف السلك من القسطرة ، وثقب الصمامات الأبهرية (الشكل 1).
ملاحظة: عندما يكون الصمام الأبهري مثقوبا ، يجب أن يكون الجراح قادرا على الشعور بهذا الكسر.
- اسحب القسطرة والسلك قليلا من فتحة الأبهر واجمع بيانات الموجات فوق الصوتية بعد الانثقاب في وضع دوبلر الملون ووضع دوبلر الموجة النبضية بعد ثقب الصمامات الأبهري. يكون تدفق القلس أحمر اللون أثناء الانبساط القلبي في وضع دوبلر الملون ويمكن تأكيده كميا في وضع دوبلر الموجة النبضية.
- ضع في اعتبارك أن السرعة القصوى للتدفق الانبساطي (PSVa) بين 300-500 مم / ثانية مرضية. إذا كانت درجة القلس في تدفق الدم غير مرضية، فكرر الخطوة 4.2.
- اختياري: ضع مقياس ضغط صغير قبل ثقب الصمامات الأبهرية وبعدها مباشرة لتأكيد وجود تدفق القلس. للتحقق ، يتم انخفاض ضغط نهاية الأبهر الانبساطي (AEDP) ، ويتم تعزيز ضغط النبض الأبهري بحوالي 20 مم زئبق.
ملاحظة: تم تقديم وصف مفصل لكيفية استخدام قسطرة مقياس الضغط الصغير لإجراء قياس ديناميكية الدم الغازية LV بأناقة في مكان آخر10،11.
5. سحب القسطرة البلاستيكية والأسلاك المعدنية ، والرعاية المحيطة بالجراحة
- قم بإزالة جل الموجات فوق الصوتية وجفف الماوس بشاش أو منديل معقم بعد التأكد من الثقب الناجح للصمامات الأبهرية ، ثم اسحب القسطرة البلاستيكية بعناية باستخدام السلك المعدني المركزي ، قبل ربط RCCA.
- أغلق الجلد باستخدام خياطة حريرية 5-0 بنمط خياطة مستمر وقم بتطبيق محلول بوفيدون اليود على موقع الخياطة. قم بتطبيق الفأر مع ميلوكسيكام (0.13 مجم) تحت الجلد لعلاج التسكين ووضع الفأر في قفص دافئ مسبقا تحت ضوء دافئ حتى يستيقظ تماما للشفاء.
6. جراحة الشام
- قم بتنفيذ الأقسام 1-3 كما هو موضح. بالنسبة للماوس الذي يتم تشغيله بالفأر الوهمي ، قم بإجراء إجراءات مماثلة كما في القسم 4 دون تعطيل الصمامات الأبهري.
- قم بتنفيذ القسم 5 كما هو موضح ، على الرغم من أن الواقع المعزز لا ينبغي أن يكون موجودا في أي من الفئران التي يتم تشغيلها بشكل زائف.
7. تقييم ثقب الصمام الأبهري ومورفولوجيا القلب ووظيفته باستخدام تخطيط صدى القلب وقياس ديناميكا الدم الغازية
- بعد 4 أسابيع من الواقع المعزز ، استخدم الوضع B لمخطط صدى القلب ، ووضع دوبلر الملون ، ووضع دوبلر الموجة النبضية لتقييم تدفق الدم في قوس الأبهر في عرض قوس الأبهر ، وقياس PDVa ، وفقا للخطوة 4.1 وفي أماكن أخرى1،12.
- استخدم تخطيط صدى القلب الوضع B والوضع M لتقييم أبعاد الجهد المنخفض والانقباض في عرض المحور الطويل للقص ، مع أبعاد الانبساطي النهائي LV (LVEDD) والانقباضي النهائي (LVESD) ، وسمك نهاية الجدار الخلفي (LVPWTd) والانقباضي النهائي (LVPWTs) ، وكسر طرد LV (LVEF) ، والتقصير الجزئي (LVFS) مشتقة.
ملاحظة: تم وصف وصف مفصل لكيفية استخدام جهاز الموجات فوق الصوتية والتلاعب بطرق عرض الموجات فوق الصوتية بأناقةسابقا 12.
- بعد تصوير تخطيط صدى القلب ، قم بإجراء قياس ديناميكا الدم الغازية ، بطريقة مشابهة للخطوة 4.3 وفي أي مكانآخر 10. سجل سرعة الانكماش والاسترخاء القصوى (+ dp / dt و −dp / dt). أدخل مقياس الضغط الصغير في الشريان السباتي المشترك الأيسر (LCCA ، وليس RCCA) ، حيث تم ربط RCCA بشكل دائم أثناء جراحة AR.
- بعد قياس ديناميكا الدم الغازية ، قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم. افتح الصدر ، واغسل القلب ب 10٪ فورمالين ، متبوعا بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ، واستئصال القلب عن طريق قطع الشريان الأورطي ، وقم بتقطيعه بشكل عرضي على مستوى الهامش السفلي للأذن الأيسر. الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري الضوئي.