مقالة منهجية

تصوير هجرة العدلات في جلد الفأر للتحقيق في إعادة تشكيل الغشاء تحت الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63581

⸱

مايو 10, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC-Chapel Hill

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تعتمد هجرة العدلات على إعادة التشكيل السريع والمستمر لغشاء البلازما استجابة للجاذب الكيميائي وتفاعلاته مع البيئة المكروية خارج الخلية. الموصوف هنا هو إجراء يعتمد على الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم للتحقيق في ديناميكية إعادة تشكيل الغشاء في العدلات المحقونة في أذن الفئران المخدرة.

الملخص

كانت دراسة تجنيد الخلايا المناعية ووظيفتها في الأنسجة مجالا نشطا للغاية على مدى العقدين الماضيين. العدلات هي من بين الخلايا المناعية الأولى التي تصل إلى موقع الالتهاب وتشارك في الاستجابة المناعية الفطرية أثناء العدوى أو تلف الأنسجة. حتى الآن ، تم تصور هجرة العدلات بنجاح باستخدام أنظمة تجريبية مختلفة في المختبر تعتمد على التحفيز المنتظم ، أو الهجرة المحصورة تحت الأغاروز ، أو قنوات السوائل الدقيقة. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لا تلخص البيئة المكروية المعقدة التي تواجهها العدلات في الجسم الحي. يوفر تطوير التقنيات القائمة على الفحص المجهري متعدد الفوتونات (MPM) ، مثل الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم (ISMic) ، أداة فريدة لتصور ديناميكيات العدلات والتحقيق فيها بدقة تحت الخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية. على وجه الخصوص ، توفر أذن الفأر الحي المخدر ميزة تجريبية لمتابعة الهجرة الخلالية للعدلات في الوقت الفعلي نظرا لسهولة الوصول إليها وقلة التعرض الجراحي. يوفر ISMic الدقة البصرية والسرعة وعمق الاستحواذ اللازم لتتبع كل من العمليات الخلوية ، والأهم من ذلك ، العمليات تحت الخلوية في 3D بمرور الوقت (4D). علاوة على ذلك ، يمكن إجراء التصوير متعدد الوسائط للبيئة الدقيقة الخلالية (أي الأوعية الدموية والخلايا المقيمة والمصفوفة خارج الخلية) بسهولة باستخدام مجموعة من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامات فلورية مختارة ، ووضع العلامات الخارجية عبر مجسات الفلورسنت ، والتألق الجوهري للأنسجة ، والإشارات التوافقية الثانية / الثالثة. يصف هذا البروتوكول 1) تحضير العدلات للنقل بالتبني إلى أذن الفأر ، 2) إعدادات مختلفة للتصوير شبه الخلوي الأمثل ، 3) استراتيجيات لتقليل القطع الأثرية للحركة مع الحفاظ على الاستجابة الفسيولوجية ، 4) أمثلة على إعادة تشكيل الغشاء التي لوحظت في العدلات باستخدام ISMic ، و 5) سير عمل للتحليل الكمي لإعادة تشكيل الغشاء في العدلات المهاجرة في الجسم الحي.

المقدمة

تعد هجرة الخلايا الموجهة حدثا بالغ الأهمية يحدث أثناء العمليات الفسيولوجية والمرضية المختلفة ، بما في ذلك التطور والاستجابة المناعية وإصلاح الأنسجة وبدء الورم وتقدمه ونشره 1,2. تعتمد هذه العملية على إشارات كيميائية محددة خارج الخلية تستشعرها مستقبلاتها المشابهة في غشاء البلازما ثم يتم تحويلها إلى إشارات معقدة داخل الخلايا. هذه المسارات ، بدورها ، تنشط هجرة الخلايا من خلال سلسلة من الاستجابات ، بما في ذلك التنشيط المحلي للهيكل الخلوي ، والاتجار بالغشاء وإعادة تشكيله ، واستقطاب الخلايا3. تم تمييز نوعين متميزين من هجرة الخلايا بشكل جيد: اللحمة المتوسطة والأميبات4. الهجرة الوسيطة بطيئة نسبيا (<1 ميكرومتر / دقيقة) ، وتعتمد على الالتصاق قوي بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتعتمد على تدهور المصفوفة الناجم عن الميتالوبروتياز. في المقابل ، فإن هجرة الأميبويد ، وهي سمة من سمات الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للإشارات الالتهابية ، تكون أسرع (>10 ميكرومتر / دقيقة) وتستخدم التصاقات ضعيفة للتنقل عبر ECM. بغض النظر عن الطريقة ، تتطلب هجرة الخلايا إعادة تشكيل مستمرة لغشاء البلازما مما يؤدي إلى توليد هياكل بارزة في الحافة الأمامية للخلايا ، والتي يتم تنسيقها بإحكام مع تراجع الغشاء في الخلف1.

لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات دون الخلوية ، من الضروري تصور ديناميكيات الأغشية في الخلايا المهاجرة بدقة زمنية ومكانية مناسبة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن إعادة تشكيل الغشاء تتأثر بشدة بخصائص البيئة الدقيقة للأنسجة المحيطة بالخلايا المهاجرة ، فمن الأهمية بمكان تصوير هذه العملية مباشرة في الأنسجة الأصلية ، داخل الحية. يتم تحقيق ذلك باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم (IVM)5. تم إجراء أول تصوير IVM ~ منذ 200 عام ، عندما تم تصور تسرب كريات الدم البيضاء باستخدام مجهر بسيط عبر الإضاءة6 وبعد ذلك تم استخدام IVM بشكل أساسي على الكائنات النموذجية شبه الشفافة ، مثل الزرد وذبابة الفاكهة 7,8. في العقدين الماضيين ، تم استخدام IVM بنجاح للتحقيق في العمليات الخلوية في الفئران والجرذان والثدييات الأكبر مثل الخنازير 5,9. أصبح هذا ممكنا بسبب 1) التطورات المهمة في الفحص المجهري متحد البؤر ومتعدد الفوتونات (MP) و 2) زيادة تقنية تحرير الجينات مثل CRISPR-Cas9 ، والتي سمحت بالهندسة السريعة لمجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية للتعبير عن البروتينات والمراسلين الموسومين بالفلورسنت. إلى جانب ذلك ، أصبح تصور الخلايا الفردية وبيئتها المكروية أثناء عمليات مثل بدء الورم وهجرة الخلايا والاستجابة المناعية ممكنا من خلال كل من الأشكال الأخرى من العلامات الخارجية ، مثل الإدخال النظامي للأصباغ لتسمية الأوعية الدموية10,11 ، وإثارة الجزيئات الداخلية ، مثل الكولاجين من خلال الجيل التوافقي الثاني (SHG) 10 ، 12 والألياف العصبية من خلال الجيل التوافقي الثالث (THG) 11,13. أخيرا ، أدى التحسن في تقنيات تقليل القطع الأثرية الحركية بسبب ضربات القلب والتنفس إلى تطوير الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم (ISMic) ، والذي سمح للباحثين بتصوير والتحقيق في العديد من الأحداث تحت الخلوية مباشرة في الحية بمستوى دقة مماثل لتلك التي لوحظت في المختبر14،15،16،17. تشمل أمثلة ISMic التحقيق في ديناميكيات الهيكل الخلوي أثناء الإخراج الخلوي14،15،16،17 وendocytosis 15 ، وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي الديناميكي أثناء هجرة الخلايا17،18 ، وتوطين الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي19،20 ، وإشارات الكالسيوم في الدماغ21.

يفصل هذا البروتوكول الخطوات والإجراءات المختلفة للتحقيق في إعادة تشكيل غشاء الخلية بدقة تحت خلوية أثناء هجرة العدلات في جلد الأذن للفأر الحي باستخدام ISMic. يعتمد هذا النهج على البروتوكولاتالموصوفة سابقا 22,23 وتم تكييفها لتحقيق دقة مكانية وزمانية أعلى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب والإجراءات على من قبل المعهد الوطني للسرطان (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية) لجنة رعاية واستخدام (بروتوكولات LCMB-031 و LCMB-035) وكانت متوافقة مع جميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 2 و 6 أشهر في التجارب. mT / mG والفئران المضيفة من النوع البري (WT) في خلفية FVB / NJ بينما الفئران LyzM-Cre x mTmG في خلفية C57BL / 6.

1. المواد وإعداد الكواشف والأدوات

  1. أنابيب معطف ، أطباق ، وإبر / محاقن مع PBS + 1٪ BSA (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) بين عشية وضحاها تحت الإثارة.
  2. نظف بعناية الأسطح والأدوات / الأدوات لاستخدامها في العمل الحيواني باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ أو عن طريق التعقيم.
    1. لتنقية العدلات ، قم بإعداد ما يلي: أنابيب 3 × 15 مل ، طبق 1 × 60 مم ، أنبوب 1 × 1.5 مل ؛ HBSS التي تحتوي على 10 mM HEPES (درجة الحموضة 7.3) ؛ محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (ACK) ؛ هيستوباك 1077 ؛ وهيستوباك 1119.
  3. لحقن العدلات ، قم بإعداد ما يلي: 1 × حقنة منخفضة الحجم (10 ميكرولتر) ، 1 × 33 جم إبرة مشطوفة ، إيزوفلوران ، ومحلول تخدير (الكيتامين ، زيلازين ، والأسيبرومازين عند 80 مجم · كجم -1 ، 2 مجم · كجم -1 و 4 مجم · كجم -1 ، على التوالي ، في محلول ملحي).

2. تنقية العدلات من فأر مانح

  1. القتل الرحيم للفأر المتبرع وفقا للوائح المؤسسية المحلية.
  2. اجمع العظام الطويلة من (عظم الفخذ والساق والعضد) ، مع الانتباه إلى الحفاظ على سلامة العظام وتجنب قطع رؤوس العظام أثناء الجمع24.
  3. في طبق 60 مم مطلي بطبقة BSA ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية. قطع رؤوس العظام للوصول إلى النخاع ، ثم شطف وتجانس نخاع العظم باستخدام حقنة (إبرة 27 جم) مملوءة ب HBSS.
  4. قم بتصفية المحلول في أنبوب مطلي ب BSA سعة 15 مل باستخدام مصفاة 40 ميكرومتر وطرده مركزيا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من ACK لمدة 30 ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء ، ثم أضف 9 مل من HBSS لوقف التحلل. جهاز طرد مركزي الحل في 400 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
  6. قم بإعداد تدرج خطوة الكثافة في أنبوب مطلي ب 15 مل BSA عن طريق وضع 4 مل من 1119 Histopaque برفق في الجزء السفلي من الأنبوب ، ثم وضع طبقات 4 مل من 1077 Histopaque برفق في الأعلى. توخ الحذر الشديد لتجنب خلط الطبقتين.
  7. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من HBSS. ضع المحلول برفق فوق تدرج الخطوة المعد أعلاه. قم بالدوران عند 1000 × جم لمدة 30 دقيقة عند RT بأقل سرعة تسارع وتباطؤ ممكنة ("يفضل عدم استخدام الفرامل").
  8. من أعلى الأنبوب ، قم بنضح نصف طبقة 1077 Histopaque برفق. اجمع النصف المتبقي من طبقة 1077 Histopaque والنصف العلوي من طبقة 1119 Histopaque في أنبوب جديد مطلي ب BSA. يحتوي تعليق الخلية الغائمة بين طبقتي الكثافة في الغالب على العدلات.
  9. أضف HBSS للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 15 مل واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. تدور بسرعة 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  10. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق وغسل حبيبات الخلية ب 10 مل من HBSS وقم بتدويرها عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الإجراء ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 15 مل من HBSS لتحديد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. أخيرا ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في 1 مل من HBSS ونقلها إلى أنبوب مطلي ب BSA سعة 1.5 مل.
  11. بعد التنقية ، احتفظ بتعليق العدلات في الأنبوب المطلي ب BSA تحت تحريض لطيف لمدة 30 دقيقة على دوار الأنبوب في RT حتى وضع العلامات و / أو الحقن.
    ملاحظة: ينتج عن التنقية الناجحة 10-20 × 106 عدلات لكل فأر بنقاوة 95٪. يتم تقييم النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام علامات العدلات الموصوفة مسبقا (Ly6G + و Ly6C- و Gr1 + و CD11b +) 25,26.
    ملاحظة: بروتوكولات تنقية العدلات من الدم المحيطي البشري ونخاع عظم الفأر متوفرة سابقا24،27.

3. وسم العدلات

ملاحظة: لتصور العدلات ، تم تنقيتها من الفئران LyzM-Cre mT / mG ، حيث تعبر الخلايا النخاعية عن ببتيد مستهدف بالغشاء يندمج مع GFP. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف العدلات المنقاة من الفئران البرية (WT) في المختبر. تصف الخطوات التالية الإجراء المستخدم لتسمية العدلات المنقاة بصبغة فلورية خضراء تجارية منفذة للخلايا ويمكن تكييفها مع أي مسبار فلوري آخر متوافق مع MPM من اختيارك.

  1. أضف صبغة الفلورسنت الخضراء (التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة ؛ هنا ، 1 ميكرومتر) إلى تعليق العدلات (المنقى من ماوس WT) في أنبوب مطلي ب BSA سعة 1.5 مل. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT تحت التحريض اللطيف في أنبوب الدوار.
  2. اغسل ثلاث مرات باستخدام HBSS ، وقم بتدويره عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من HBSS.
  3. احتفظ بتعليق العدلات في الأنبوب المطلي ب BSA تحت تحريض لطيف في دوار الأنبوب في RT حتى إجراء الحقن.
    ملاحظة: يفضل بشدة حقن العدلات الموسومة التي يتم إجراؤها مباشرة بعد وضع العلامات. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن إبقاء العدلات الموسومة تحت الهياج لمدة 10-15 دقيقة إضافية بعد وضع العلامات دون المساس بسلامة استجابة العدلات في الجسم الحي. سيؤدي التحريض طويل المدى (أكثر من 60 دقيقة بعد وضع العلامات) إلى التكتل وموت العدلات والملاحظات المضللة في الجسم الحي.
  4. قبل الحقن مباشرة ، أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي للوصول إلى كثافة 2-5 × 106 خلايا لكل 20 ميكرولتر.

4. حقن العدلات

ملاحظة: يجب إجراء التخدير باتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية المحلية.

  1. ضع في غرفة مغلقة وقم بتطبيق 3٪ -5٪ إيزوفلوران (معدل تدفق 2 لتر / دقيقة) باستخدام مبخر معاير متصل بمكثف أكسجين.
  2. تقييم ما إذا كان فاقدا للوعي عن طريق اختبار منعكس انسحاب المخلب عند الضغط على وسادة القدم الخلفية. ثم انقل إلى وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة جسمه. استمر في تطبيق الأيزوفلوران (1٪ -2٪ ؛ معدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة) من خلال مخروط الأنف.
    ملاحظة السلامة: للحد من تعرض الأفراد للأيزوفلوران السام ، يوصى باستخدام نظام موزع مجهز بوحدة ترشيح لاستعادة الإيزوفلوران المتداول.
  3. لتحسين جودة التصوير ، قم بإزالة الشعر من الأذن باستخدام أداة تشذيب دقيقة. يمكن أيضا تنفيذ هذا الإجراء قبل يوم أو يومين من التجربة.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام كريم إزالة الشعر لأنه من المعروف أنه يؤدي إلى تفاقم الاستجابة الالتهابية في جلد الفأر وإدخال القطع الأثرية التصويرية.
  4. ضع على جانبه. باستخدام الشريط الجراحي ، أمسك حافة الأذن ، وقم بتسويتها على طول وسادة الاحترار. ضع الشريط برفق لمنع أي ضرر للأذن.
  5. املأ حقنة مجهزة بإبرة 33 G مع تعليق العدلات (2-5 × 106 خلايا لكل 20 ميكرولتر) وقم بتركيبها على جهاز micromanipulator.
    ملاحظة: يجب أن تكون زاوية الحقن بين الإبرة والأذن على وسادة التدفئة بين 10 درجات و 30 درجة لتقليل تلف الأنسجة وزيادة نجاح حقن الخلايا.
  6. حرك الإبرة برفق (مع شطبة لأعلى) نحو الأذن ، واخترق الجلد ببطء. بمجرد دخول الإبرة إلى الجلد ، ادفع المكبس ببطء وقم بتوصيل 2-3 ميكرولتر من تعليق الخلية.
    ملاحظة: يجب تجنب المناطق ذات الأوعية الدموية المرئية لأن تلف الأوعية الدموية يؤدي إلى استجابة مناعية غير مرغوب فيها ومعقدة للحقن ومشاكل في التصوير.
  7. كرر الحقن في 2-3 مناطق مختلفة من الأذن ، ويفضل أن تكون على بعد 2-3 مم. لا "تملأ" الأذن بتعليق الخلية.
    ملاحظة: يجب إجراء الحقن في وسط الأذن. محيط الأذن رقيق ويجب التعامل معه بحذر لأنه يمكن أن يتلف بسهولة ، في حين أن الجزء المركزي أكثر سمكا يحتوي على أوعية دموية أكبر وعدد أقل من بصيلات الشعر ، ويمكنه تحمل أحجام حقن أكبر.
  8. قم بإزالة الشريط الجراحي بعناية ودع يستعيد وعيه تحت الإشراف. اسمح للحيوان بالراحة لمدة 1 ساعة قبل التصوير للسماح للأنسجة والخلايا بالتعافي من إجراء الحقن.

5. التخدير ل IVM

ملاحظة: يعمل التخدير الأعمق على تحسين جودة التصوير بشكل كبير عن طريق تقليل آثار الحركة بسبب ضربات القلب والتنفس. تخضع الفئران المحقونة بالعدلات للتخدير الكيميائي ، والذي يوفر تخديرا أعمق من التخدير الناجم عن الغاز. يجب إجراء التخدير باتباع إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية المحلية.

  1. بعد ساعة واحدة من الشفاء من حقن العدلات ، قم بتخدير عن طريق حقنة تحت الجلد تحتوي على خليط من زيلازين / كيتامين / أسيبرومازين (80 مجم كجم -1 ، 2 مجم · كجم -1 ، و 4 مجم · كجم -1 ، على التوالي) في محلول ملحي.
    ملاحظة: لضمان استنساخ النتائج وموثوقيتها ، يجب أن تبقى دافئة من وقت التخدير حتى نهاية التجربة باستخدام وسادة تدفئة أو وسادة تدوير المياه متصلة بمضخة التدفئة.
  2. للحفاظ على التخدير بعد ساعة واحدة، يتم حقن خليط من الكيتامين/الأسيبرومازين (40 ملغ·كغ-1، و2 ملغ·كغ-1 على التوالي) تحت الجلد كل 40 دقيقة. راقب الفئران المخدرة بشكل دوري بحثا عن علامات الوعي عن طريق اختبار منعكس انسحاب المخلب.
  3. بالإضافة إلى ذلك ، لإجراءات التصوير التي تدوم أكثر من 1 ساعة ، ضع مرهما معقم للعيون غير دوائي على العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير والحفاظ على ترطيب الجسم عن طريق الحقن تحت الجلد من محلول ملحي (200 ميكرولتر كل ساعة).
    ملاحظة: بالتناوب ، يمكن استخدام نظام قائم على التروية يتم التحكم فيه رقميا لضمان الحقن الدوري والسلس لمحلول التخدير و / أو توفير السوائل. يمكن إعداد برنامج تشغيل حقنة آلي لتقديم الحجم المطلوب من المخدر وتوفير الترطيب لفترات أطول. تحقيقا لهذه الغاية ، يمكن إدخال إبرة ضخ مجنحة تحت الجلد في الجلد الظهري للحيوان وتأمينها بشريط جراحي.

6. التصوير

ملاحظة: تم تحسين الإعداد الحيواني ومعلمات التصوير الموصوفة هنا لمجهر متعدد الفوتونات مقلوب مزود بخط ليزر واحد لإثارة وجمع الانبعاثات من الفلوروفورات المختلفة في وقت واحد.

  1. قبل وضع المخدر على مرحلة المجهر ، تأكد من تشغيل المجهر وأن كل من المرحلة والعدسات مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتغطية الفتحة الموجودة على المسرح بغطاء زجاجي (سمك # 1 أو 1.5) محاذ للعدسة الساخنة.
  2. انقل إلى المسرح بعناية. إذا تم التخطيط للتصوير لفترة طويلة (>1 ساعة) ، ضع مرهما للعين وقم بتأمين نظام التروية المجنح القائم على التسريب كما هو موضح أعلاه.
  3. ضع قطرة من المحلول الملحي في وسط غطاء الغطاء وضع الأذن المحقونة بالعدلات فوقها. قم بتسطيح الأذن برفق باستخدام قطعة قطن معقمة عبر منتصف غطاء الغطاء لإزالة الجيوب الهوائية.
    ملاحظة: يقلل تطبيق المحلول الملحي (أو PBS) بين الأذن وغطاء الغطاء من انكسار الضوء بسبب الجيوب الهوائية ، وبالتالي ضمان معامل انكسار متساو وجودة تصوير فائقة.
  4. قم بتأمين الأذن عن طريق الضغط برفق على عصا خشبية (إزالتها من قطعة القطن) إلى جانب الأذن بالقرب من رأس وقفله باستخدام شريط (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: تقلل العصا الخشبية المثبتة من آثار الحركة بسبب ضربات القلب والتنفس وتزيد من جودة التصوير بشكل كبير. الأهم من ذلك ، يجب تثبيت العصا الخشبية بما يكفي لتثبيت الأذن دون إعاقة تدفق الدم.
  5. باستخدام عدسة المجهر ، ابحث عن منطقة اهتمام ، ثم قم بالتبديل إلى وضع اكتساب الفوتونات المتعددة.
  6. اضبط الطول الموجي للإثارة بالليزر على 900-930 نانومتر للسماح بالاستحواذ المتزامن على صبغة GFP / الفلورسنت الخضراء ، mTomato وكذلك الكولاجين-I (عبر SHG).
  7. اضبط مجموعة مناسبة من المرايا ومجموعة المرشحات على أجهزة الكشف لجمع الضوء المنبعث (مرشحات تمرير النطاق: أزرق = 410-460 نانومتر ، أخضر = 495-540 نانومتر ، أحمر = 580-640 نانومتر).
    ملاحظة: تظهر العدلات المحقونة ، عند تمييزها بصبغة فلورية خضراء ، مضانا أخضر قويا يجعلها مرئية تحت عدسة المجهر حتى لو تم حقنها في أجزاء أعمق من الأذن.
  8. تحديد الإعداد الأنسب لتكوين الأجهزة. حتى إذا كان من الممكن تتبع الخلايا المهاجرة بفاصل زمني يتراوح من 30 ثانية إلى 1 دقيقة ، فقم بتصوير الأحداث تحت الخلوية بسرعة أعلى (فاصل زمني <10 ثوان على الأقل). في المثال أدناه ، يتم تقديم إعدادين مختلفين للتصوير لإظهار الفرق بين IVM الكلاسيكي و ISMic.
    1. في نهج IVM الكلاسيكي لتتبع هجرة الخلايا والتحقيق في أنسجة الفأر المضيف (الشكل 1) ، استخدم عدسة 30x وماسح ضوئي galvo بحجم صورة 512 × 512 بكسل (حجم بكسل 0.83 ميكرومتر) ، واضبط إزاحة المحور z باستخدام المرحلة الآلية بحجم خطوة 2 ميكرومتر ، مما يسمح بتصوير حجم عميق 30 ميكرومتر كل 30 ثانية.
    2. في نهج ISMic لإعادة عرض الغشاء الديناميكي للغاية للصورة عند تكبير ودقة أعلى (الشكل 2) ، استخدم عدسة 40x وماسح ضوئي رنين بمتوسط 3x وحجم صورة 512 × 512 بكسل (حجم بكسل 0.25 ميكرومتر) ، واضبط إزاحة المحور z باستخدام بيزو بحجم خطوة 1 ميكرومتر ، السماح بتصوير حجم عميق 20 ميكرومتر كل 4-5 ثوان.
  9. تحفيز هجرة العدلات عن طريق إحداث إصابة ليزر معقمة. ركز ليزر الإثارة بقوة عالية كافية للوصول إلى 80 ميجاوات22 على الأقل ، على مساحة ضيقة من الأنسجة (20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر) لمدة 10 ثوان.
  10. حدد الإصابة التي يسببها الليزر من خلال إشارات الفلورسنت الذاتي القوية التي تظهر في جميع القنوات والتغيير الناتج في ترتيب الكولاجين (الشكل 1 د).
    ملاحظة: للحصول على نتائج موثوقة ، يجب دائما إحداث الإصابة قدر الإمكان من الأوعية الدموية. في حالة تمزقها ، ستؤثر خلايا الدم التي يتم إطلاقها في الأنسجة على جودة التصوير بالإضافة إلى رد فعل مناعي قوي بشكل عام.
  11. احفظ البيانات في نهاية التجربة لمزيد من التحليلات.
  12. القتل الرحيم للحيوان وفقا للإرشادات المؤسسية المحلية. إذا لزم الأمر ، يمكن جمع الأنسجة للتثبيت والمعالجة الإضافية.

7. تحليل البيانات التمثيلية

ملاحظة: يمكن تصور البيانات وتحليلها إما باستخدام برنامج المجهر أو برامج الجهات الخارجية أو البرامج المخصصة. ويعتمد الإجراء والأدوات المستخدمة على الاحتياجات المحددة للمحققين. يوضح هنا أحد الأمثلة على سير العمل لتحديد انحناء الغشاء وتغيرات المنطقة المحلية عند الحافة الأمامية ومؤخرة العدلات المهاجرة.

  1. افتح ملفات التصوير باستخدام Imaris أو Fiji لتصور هجرة العدلات في 4D وتحديد جودة التجربة.
    ملاحظة: يمكن ل Imaris و Fiji قراءة تنسيق التصوير للعديد من العلامات التجارية للمجهر.
  2. قم بمعالجة البيانات بالخطوات التالية عن طريق تشغيل البرامج النصية لتعليمات MATLAB البرمجية المخصصة. اقرأ ملفات التصوير المحددة باستخدام حزمة Bio-Format28 ل MATLAB. قسم كل إطار من وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد باستخدام خوارزمية Otsu29 لتحديد الخلايا الفردية.
  3. تتبع الكائنات المحددة بناء على معيار الحد الأدنى للإزاحة30.
  4. تحديد الخطوط والحدود النشطة للكائن.
    1. قم بإنشاء إسقاط أقصى لكل كائن محدد في إطار زمني.
    2. قم بتطبيق دالة bwboundaries في MATLAB على الحد الأقصى للإسقاط لكل كائن محدد من الخطوة 7.2 لإنشاء 100 نقطة حدود.
    3. قم بتحسين نقاط الحدود المحددة باستخدام خوارزمية الكنتور الديناميكي لتحقيق دقة البكسل الفرعي31 (الشكل 3A) باستخدام الوظائف الموجودة في حزمة MATLAB التي تم تنزيلها عبر http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/.
    4. تراكب حدود الكائن ومؤشر مسار الكائن الذي يحدده التتبع في الخطوة 7.3 مع الحد الأقصى لإسقاط الصورة الأصلية لإنشاء إخراج فيلم متراكب ثنائي الأبعاد للتصور والفحص اليدوي.
  5. في الفيلم المتراكب، حدد يدويا كل الكائنات المحددة كخلايا ترحيل باستبعاد كائنات غير خلوية، كائنات لامسة، وكائنات ذات حدود غير مكتملة. سجل مؤشرات التتبع وإطارات البداية والنهاية لكل مسارات خلية في ورقة انتشار لاستخدامها كمدخل للخطوات التالية التي تنفذها البرامج النصية لتعليمات MATLAB البرمجية.
  6. تتبع نقاط حدود الخلية من كل إطار إلى الإطار التالي وفقا لمعيار الحد الأدنى للإزاحة. استخدم دالة Polyarea في MATLAB لحساب المنطقة التي تحتها نقاط الحدود المجاورة في إطارين زمنيين متتاليين (الشكل 3C). إذا تحركت حدود الخلية المحلية للخارج من الخلية، فقم بتعيين إشارة موجبة لتغيير المنطقة. إذا تحركت حدود الخلية المحلية إلى الداخل إلى الخلية، فقم بتعيين علامة سالبة لتغيير المنطقة.
  7. قم بقياس انحناء الغشاء المحلي عند كل نقطة حدودية لكل إطار عن طريق تركيب نقاط حدود جاره في دائرة (5 لكل جانب ؛ المجموع 11) 32 (الشكل 3 ب).
  8. قم بإنشاء صور كيموجرافية باستخدام وظيفة imagesc في MATLAB (الأشكال 3D ، E) لإظهار التغييرات في الميزات تحت الخلوية بمرور الوقت وتتعلق بموضع الخلية.

النتائج

هنا ، يتم تقديم مجموعتين مختلفتين من النتائج لتوضيح IVM و ISMic الكلاسيكيين اللذين يوفران دقة خلوية وشبه خلوية ، على التوالي. في المثال الأول ، تم تنقية العدلات من فأر من النوع البري (WT) ، المسمى ب Cell Tracker Green لتلطيخ السيتوبلازم ، وحقنه في فأر معدل وراثيا يعبر عن بروتين فلوري يستهدف غشاء البلازما (mTomato mouse mouse ، المعروف أيضا باسم mT / mG33 ، الشكل 1 والفيلم 1 والفيلم 2). مكن هذا الماوس المتلقي من تصور السمات الهيكلية في أنسجة الأذن مثل الأوعية الدموية والخلايا المقيمة وبصيلات الشعر (الشكل 1C والفيلم 1) عبر النهج القائم على IVM (الخطوة 6.8.1). تم ترتيب ألياف الكولاجين ، التي تم الكشف عنها عن طريق SHG (تم اكتشافها بنصف الطول الموجي للإثارة) ، في شبكة معقدة في الأدمة ، حيث تم حقن العدلات. على طول حافة بصيلات الشعر (HF) ، لوحظت طبقة من الخلايا الظهارية (أي الخلايا الكيراتينية). في بعض الأحيان ، تم تصور القطع الأثرية من الشعر المتبقي مما أدى إلى انخفاض موضعي للجلد (H). تم تصور الإصابات التي يسببها الليزر بسهولة بسبب مضانها الذاتي القوي المكتشف في جميع القنوات ومن خلال تعديلات ترتيب الكولاجين (الشكل 1 د). يمكن تقدير رؤية أكثر اكتمالا للبنية ثلاثية الأبعاد للجلد وتوطين العدلات المحقونة في الفيلم 1 ، الذي يصور كومة Z من الجلد من الطبقات الخارجية إلى الطبقات الداخلية وعرض حجم 3D. أظهر التصوير بفاصل زمني أن العدلات تأخذ عينات من جلد الأذن وتتفاعل مع ECM والأنسجة المضيفة (الفيلم 2). يسمح التصوير بهذه الدقة والحصول على مكدس Z كل 30 ثانية بإجراء تتبع الخلايا وقياس معلمات الحركة (أي السرعة والاتجاه) ، ولكن التحليل الدقيق والمفصل لإعادة تشكيل الغشاء يمثل تحديا في هذا القرار.

في المثال الثاني ، تم تقييم إعادة تشكيل الغشاء عبر نهج ISMic (الخطوة 6.8.2) باستخدام العدلات المعبرة عن mGFP المنقاة من الفئران LyzM-cre mT / mG وحقنها في WT (الشكل 2A ، مخطط انسيابي تجريبي). باستخدام بروتوكول ISMic (الفيلم 3 والصور الثابتة في الشكل 2B) وعند إصابة الليزر ، لوحظ إعادة تشكيل ديناميكي لغشاء البلازما أثناء الهجرة ، ويتم تصور تكوين نتوءات الغشاء عند الحافة الأمامية وتراجع الجزء الخلفي من الخلايا بوضوح (الشكل 2 والفيلم 3). تكشف تسلسلات الفاصل الزمني التي تم إبرازها في الفيلم 3 عن تعقيد التفاعلات مع ECM. في الواقع ، هاجرت العدلات عبر الفضاء الخلالي تتحرك إما على طول الألياف أو في الفراغات بينهما. أخيرا ، تم تحديد الجوانب الكمية مثل التغيرات في الانحناء وتغيرات المنطقة في مقدمة ومؤخرة الخلايا لكل نقطة زمنية. باستخدام الخلية الموصوفة في الشكل 2B كمثال ، تم تحليل الديناميات المحلية لغشاء البلازما باستخدام خط أنابيب خوارزمية (انظر الخطوة 7) بناء على تحديد 100 نقطة حدودية تحت سطح الخلية (الشكل 3 أ). تم حساب التغيرات في الانحناء المحلي (الشكل 3B) وفي المنطقة التي تحتها نتوءات غشاء البلازما (الشكل 3C) لكل نقطة حدودية وتم الإبلاغ عنها لكل إطار زمني كأجهزة قياس كيوموجراف (الشكل 3D ، E). يحافظ كل من الجزء الأمامي والخلفي من الخلايا على انحناء أعلى من جانب الخلايا (الشكل 3 د) ؛ تكون تغيرات المنطقة السلبية (التراجعات ، المناطق الزرقاء) أكثر وضوحا في الجزء الخلفي من الخلايا منها في الحافة الأمامية حيث تكون تغيرات المنطقة الإيجابية أكثر بروزا (نتوءات ، مناطق حمراء) (الشكل 3E).

figure-results-1
الشكل 1: IVM من العدلات في جلد أذن الفأر. (أ) رسم تخطيطي لإعداد الأذن على مرحلة المجهر. (ب) مخطط انسيابي تجريبي. (ج) صورة تمثيلية لجلد أذن فأر mTomato محقون بالعدلات الموسومة بالفلورسنت ، مع نتوءات مختلفة. بصيلات الشعر (HF) ، الأوعية الدموية (BV) ، البشرة (E) ، الأدمة (D) ، طبقة الخلايا القاعدية (BCL) ، وقطعة أثرية للشعر (بسبب الشعر المتبقي على سطح الجلد ، H). (د) صورة تمثيلية لجلد الفأر بعد إصابة ليزر معقمة: قناة زرقاء (يمين) ، قنوات خضراء وحمراء (وسط) ، صورة مدمجة (يسار). تظهر الإصابة على يسار الصورة من خلال انبعاث تألق ذاتي قوي في كل من القنوات الخضراء والحمراء بالإضافة إلى اضطراب في ECM لوحظ من خلال تكوين ثقب في ألياف الكولاجين-I. في C و D ، الأخضر: العدلات. الأحمر: أنسجة مضيف الفأر. سماوي: الكولاجين-I SHG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الفاصل الزمني للعدلات mGFP المهاجرة في أذن فأر WT. (أ) مخطط انسيابي تجريبي. (ب) صور ثابتة تمثيلية من الفيلم 3. (ج) تجسيد حجم الخلية نفسها لتصور تنظيم الغشاء 3D. يتم توضيح منطقة ديناميكيات الغشاء العالية بواسطة سهم (أحمر للتراجع والأزرق للنتوء). (د) التصور عن قرب والإمالة لحجم الخلية المعروضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: خط أنابيب التحليل للقياس الكمي لديناميات الغشاء التي تم جمعها باستخدام ISMic. (أ) تحديد كفاف الخلية وإعادة تقسيم نقاط الحدود (100 نقطة حدودية) بين إطارين متتاليين للعدلات mGFP الموصوفة في الشكل 2B. (ب) تمثل الحدود الملونة تكور الغشاء المحلي المحدد لكل نقطة حد. (C) تتغير المساحة المحلية بين إطارين متتاليين (التيار: أزرق ، والتالي: أحمر). تمثل المناطق الخضراء نتائج تتبع حركة الغشاء المحلي. تشير الأسهم الصفراء إلى الاتجاه العام لإزاحة الغشاء. د: مخطط كيموجراف تكور الحدود للخلية بمرور الزمن. يمثل المحور الرأسي مؤشرات نقاط الحدود حيث يمثل 1 و 100 الجزء الخلفي من الخلية وفقا لاتجاه هجرتها. (ه) تغيير المنطقة المحلية كيموغراف يعكس بروز الغشاء (أحمر) وتراجع الغشاء (أزرق) للخلية بمرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1: العدلات ذات العلامات الخضراء المرئية في أذن فأر mTomato باستخدام IVM. الأحمر: mTomato أنسجة الفأر المضيف. سماوي: الكولاجين-I SHG ؛ الأخضر: العدلات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 2: IVM من العدلات المهاجرة في جلد أذن فأر mTomato . مقاطع الفيديو هي إسقاطات قصوى الكثافة لمكدس صور تم الحصول عليه لمدة 27 دقيقة بمعدل إطارات يبلغ 5 إطارات / ثانية. الأحمر: mTomato أنسجة الفأر المضيف. سماوي: الكولاجين-I SHG ؛ الأخضر: العدلات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 3: ISMic لإعادة تشكيل الغشاء أثناء هجرة العدلات في أذن فأر WT. مقاطع الفيديو هي إسقاطات قصوى الكثافة لمكدس صور تم الحصول عليه لمدة 8 دقائق بمعدل إطارات يبلغ 10 إطارات / ثانية. الأحمر: mTomato أنسجة الفأر المضيف. سماوي: الكولاجين-I SHG ؛ الأخضر: mGFP العدلات. أخضر فاتح: العدلات المقدمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.

المناقشة

على الرغم من عقود من التقدم في مجال هجرة الخلايا وإعادة تشكيل الأغشية ، فقد استخدم عدد قليل جدا من الدراسات IVM لتصور السمات الخلوية الفرعية في الحية. توفر الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول أداة قوية لاكتساب رؤى جديدة حول هجرة العدلات في الحية وبشكل أكثر تحديدا حول إعادة تشكيل غشاء البلازما خلال هذه العملية. هذا النهج يجعل من الممكن التحقيق في هجرة العدلات في ظل الظروف الفسيولوجية بالنظر إلى التعقيد المتأصل في البيئة المكروية للأنسجة. في الواقع ، يتيح استخدام MPM تصور ميزات متعددة داخل الأنسجة المضيفة باستخدام مجموعة من سلالات الماوس التي تعبر عن علامات الفلورسنت المختارة ، ووضع العلامات على الأنسجة الخارجية ، وإثارة التألق الداخلي ، والإشارات المتولدة من خلال SHG أو THG12,13.

إحدى المشكلات المحتملة التي يجب مراعاتها في هذا الإجراء هي التلف الضوئي. على الرغم من أن MPM أكثر أمانا بشكل عام من الفحص المجهري متحد البؤر فيما يتعلق بالتبييض الضوئي والسمية الضوئية ، يجب توخي الحذر عند تصوير الأنسجة الحية34. يمكن أن تعيق السمية الضوئية النتائج بشكل كبير إما عن طريق إنشاء قطع أثرية تصويرية تتراوح من بقع صغيرة ساطعة إلى مناطق أكبر من الأنسجة التالفة أو تثبيط / تحفيز مجموعة متنوعة من المسارات داخل الخلايا. لمنع السمية الضوئية ، يجب الحفاظ على طاقة الليزر عند الحد الأدنى ويجب تصميم الضوابط المناسبة للتحقق من الحفاظ على الظروف الفسيولوجية (على سبيل المثال ، قياس تدفق الدم ، وتحقيقات الإجهاد التأكسدي)35,36. علاوة على ذلك ، في هذا الإجراء المحدد ، الذي يتضمن الجلد ، يوصى بشدة باستخدام سلالات ألبينو لأن الميلانين الموجود في ذات الطلاء الداكن أكثر حساسية للسمية الضوئية36،37،38.

من بين القيود الرئيسية لهذا الإجراء نظام المجهر المستخدم وطبيعة العدلات. على الرغم من أن استخدام MPM يزيد بشكل كبير من عمق تصوير الأنسجة عند مقارنته بتقنيات الفحص المجهري الضوئي الأخرى (على سبيل المثال ، القرص البؤري ، القرص الدوار) ، فإن القدرة على تصور ديناميكيات تحت الخلية في الأذن تقتصر على الطبقات الخارجية للأنسجة (80-100 ميكرومتر). ويرجع ذلك إلى تشتت الضوء الشديد الناتج عن طبقة ECM السميكة مما يجعل من الصعب التحقيق في الهجرة في الطبقات العميقة. ومن القيود الأخرى حقيقة أن العدلات قصيرة العمر للغاية ولا يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لفترة كافية لأداء تقنيات تحرير الجينات. يمكن التغلب على ذلك عن طريق هندسة الفئران لإنتاج العدلات التي تفتقر إلى جينات محددة أو تأوي طفرات مختارة ، مما يزيد بالطبع من تكاليف البحث ومدته.

يمكن تصميم الإجراءات الموصوفة هنا ، على الرغم من أنها مصممة للتحقيق في ديناميكيات الغشاء ، لمعالجة أي سؤال بيولوجي للخلية ليس فقط في العدلات ولكن أيضا في أنواع الخلايا المناعية الأخرى والخلايا المهاجرة. يمكن استكمال المعلومات التي تم جمعها من خلال IVM منخفض التكبير على السلوكيات الخلوية (على سبيل المثال ، النمط الظاهري للهجرة ، وسرعة الخلية ، والاتجاه22) وربطها بالمعلومات الميكانيكية المكتسبة من خلال ISMic حول إعادة وضع العضيات ، وإفراز البروتين ، و endocytosis ، والديناميات النووية ، وديناميات الكالسيوم ، وتنظيم الهيكل الخلوي ، و netosis. يمكن أن يسلط استخدام التلاعب الدوائي و / أو الجيني الضوء على دور المسارات الجزيئية المحددة في عملية الاهتمام مما يجعل هذا النهج فريدا وقويا للغاية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الداخلي للمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للسرطان ، ومركز أبحاث السرطان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 1.5 مل الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية4036-3204
أنابيب 15 مل Corning430766
1 مل حقنةCovidien8881501400
27 G إبرةكيندال827112
27 G مجموعة التسريب المجنحTerumoSV * 27EL
30x الموضوعيةأوليمبوسUPLSAPO30XS1.05 NA ، غمر زيت السيليكون
40x موضوعيأوليمبوسUPLSAPO40XS1.23 NA ، غمر زيت السيليكون
60 مم أطباقفالكون353002
6 مل حقنةكيندال8881516937
أسيبرومازين (10 مجم / مل)Vet one13985-587-50
ACK تحلل عازلةالجودة البيولوجية118-156-101
التوازنوEK-1200A
BSASigma AldrichA9647
مصفاة الخلية 40 وميكرو ؛ مسيجما ألدريتشCLS431750
فيجيImageJN / Aبرنامج تصور / تحليل الصور
برنامج Fluoview OlympusN / Aبرنامج الاستحواذ
FVB سلالة الماوسجاكسونN / AFVB خلفية
نظام التخدير الغازيباترسون البيطري07-8915712رابط 7 نموذج
الخلية الخضراء جهاز تعقبThermoC2925قابل للذوبان في درجة زراعة الخلايا DMSO للوصول إلى تركيز 1 ملي مولار (1000x)
كريم إزالة الشعرNairN / A
HBSS (بدون Ca2 + ، Mg2 +)Gibco14175-095
HEPES 1 M pH 7.3جودة بيولوجية118-089-721
Histopaque 1077Sigma Aldrich10771-100ML
Histopaque 1991Sigma Aldrich11191-100ML
ImarisBitplaneN / Aبرنامج تصور / تحليل الصور
IsofluraneVet واحد13985-528-40
كيتامين (100 مجم / مل) Vetone13985-584-10
LyzM-cre x mT / mGتم إنشاؤه في المختبرN / AC57BL / 6J خلفية
مناور دقيق يدويWPIM3301R
MATLABMatWorksN / Aبرنامج تحليل
mtomato سلالة الماوسالتي تم إنشاؤها في المختبرN / AmT / mG ، خلفية FVB
ليزر متعدد الفوتونأطياف الفيزياءالبصيرة DS +
مجهر متعدد الفوتونأوليمبوسMPE-RS
Nanofil 10 & L حقنةWPINANOFIL
Nanofil 33 G إبرةWPINF33BV-2
سخان موضوعيBioptechsN / A
وحدة تحكم سخان موضوعيةBioptechsمرهم
NDC 0904-6488-38
مكثف الأكسجينCaireVisionAire 5
PBS (بدون Ca2 + ، Mg2 +)جودة بيولوجية114-058-131
جودة المحلول الملحيالبيولوجية114-055-101
سخان المرحلةOkolabN / A
وحدة تحكم سخان المرحلةOkolabH401-T
شريط جراحي3M1538-1مضاد للحساسية
هارفارد جهازPHD Ultra
وسادات الاحترارباركلاند العلميةA2789B
مضخة الاحترارباركلاند العلميةTP-700
زيلازين (100 مجم / مل)طبيب بيطري واحد13985-704-10
العيون 150803 الرئيسي سائق حقنة

المراجع

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Oudin, M. J., Weaver, V. M. Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).
  3. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).
  4. Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells. International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).
  5. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  6. Wagner, R. Explanatory panels on physiology and development history 1839. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).
  7. Yaniv, K., et al. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).
  8. Vinegoni, C., et al. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).
  9. Sack, F. -U. Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs. Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).
  10. Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy. PloS One. 6 (11), 28237(2011).
  11. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1, 32-43 (2012).
  12. Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review. Cells. 10 (7), 1760(2021).
  13. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization. Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).
  14. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  15. Shitara, A., et al. Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals. Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).
  16. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  17. Subramanian, B. C., et al. The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation. The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).
  18. Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy. iScience. 16, 283-297 (2019).
  19. Porat-Shliom, N., et al. In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations. Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).
  20. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  21. Calvo-Rodriguez, M., et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 11, 2146(2020).
  22. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  23. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  24. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).
  25. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  26. Lakschevitz, F. S. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  27. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).
  28. MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html (2022).
  29. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  30. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  31. Xu, C., Prince, J. L. Snakes, shapes, and gradient vector flow. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).
  32. Driscoll, M. K., et al. Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell. Aging. 4 (2), 119-132 (2012).
  33. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  34. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  35. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), 104250(2014).
  36. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Wu, X. S., et al. Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المجهر الحيوي داخل الجسمالتصوير دون الخلويتصوير جلد الفئرانمجهر متعدد الفوتوناتديناميكيات الغشاء البلازمينموذج الإصابة بالليزرالتصوير بالفاصل الزمنيالتفاعل مع المصفوفة خارج الخلوية
تصوير هجرة العدلات في جلد الفأر للتحقيق في إعادة تشكيل الغشاء تحت الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.