يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63602

⸱

مارس 21, 2022

 ,  , 
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات باستخدام بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان من الخلايا في ظل ظروف صارمة غير مسخ وتغيير طبيعة .

الملخص

Ubiquitination هو نوع من التعديل بعد الترجمة الذي ينظم ليس فقط الاستقرار ولكن أيضا توطين ووظيفة بروتين الركيزة. تحدث عملية الانتشار في كل مكان داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم جميع العمليات البيولوجية الخلوية الأساسية تقريبا. تساعد تنقية البروتينات في كل مكان على التحقيق في دور الوجود في كل مكان في التحكم في وظيفة بروتينات الركيزة. هنا ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات مع بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف صارمة غير تغيير طبيعة وتغيير الطبيعة. تم تنقية إجمالي بروتين p53 الخلوي الموسوم بالعلم باستخدام الأغاروز المترافق بالأجسام المضادة للعلم في ظل ظروف غير طبيعية. بدلا من ذلك ، تم تنقية البروتين الخلوي الكلي الموسوم في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم الكشف بنجاح عن بروتينات p53 في كل مكان في الشطف بأجسام مضادة محددة. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين.

المقدمة

Ubiquitin هو بروتين محفوظ تطوريا من 76 من الأحماض الأمينية1،2،3. يوبيكويتين يربط تساهميا بقايا ليسين على البروتينات المستهدفة من خلال الشلالات التي تنطوي على تنشيط (E1) ، واقتران (E2) ، وإنزيمات ligase (E3). يتم تنشيط Ubiquitin أولا بواسطة إنزيم E1 ثم يتم نقله إلى إنزيمات الاقتران E2. بعد ذلك ، تتفاعل أربطة يوبيكويتين E3 مع كل من إنزيمات E2 المحملة باليوبيكويتين وبروتينات الركيزة وتتوسط في تكوين رابطة إيزوببتيد بين الطرف C من يوبيكويتين وبقايا ليسين في الركيزة1،2،3،4،5. يتضمن الوجود في كل مكان ربط شقوق ubiquitin ببقايا اللايسين على بروتينات الركيزة أو على نفسها ، مما يؤدي إلى أحادي البروتين أو تعدد البيئات. تحدث عملية الانتشار هذه داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية. يؤدي الوجود في كل مكان إلى تدهور بروتينات الركيزة عبر نظام يوبيكويتين بروتيازوم1،2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، يعدل الانتشار في كل مكان توطين البروتين تحت الخلوي ، وتكوين مركب البروتين ، والاتجار بالبروتين في الخلايا 3,5. يمكن إزالة شقوق Ubiquitin المرتبطة ببروتينات الركيزة عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs)6,7. والجدير بالذكر أن الطرق المختلفة التي يتم بها تجميع سلاسل ubiquitin توفر عددا لا يحصى من الوسائل لتنظيم العمليات البيولوجية المختلفة 1,5. لا تزال الأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة بروتين الركيزة غير مفهومة بشكل كامل حتى الآن. يساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توضيح آثار انتشار البروتين في كل مكان على مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.

يعد بروتين p53 أحد أهم البروتينات المثبطة للورم ويظهر طفرات جينية أو تعطيلا في جميع أنواع السرطان البشرية تقريبا8،9،10،11. يتم تنظيم استقرار ونشاط P53 بدقة في الجسم الحي من خلال تعديلات ما بعد الترجمة ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، والفسفرة ، والأستيل ، والمثيلة12،13. يحتوي بروتين p53 على عمر نصف قصير يتراوح من 6 دقائق إلى 40 دقيقة في خلايا مختلفة ، والذي ينتج بشكل رئيسي عن تعدد الجزيئات والتحلل البروتيني اللاحق10,12. الماوس المزدوج الدقيقة 2 (Mdm2) هو E3 ubiquitin ligase من p53 الذي يرتبط بنهاية N من p53 لمنع نشاطه النسخي12،14،15. يعزز Mdm2 تعدد البائن والتدهور البروتيني ل p53 للتحكم في استقراره ويحث على تعدد p53 لتسهيل تصديره النووي12،14،15،16. هنا ، يتم استخدام انتشار p53 بوساطة Mdm2 كمثال لتقديم طريقة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات بالتفصيل. يمكن تحديد المنظمين الذين يؤثرون على حالة انتشار البروتينات المستهدفة في كل مكان باستخدام مقايسة الانتشار في الجسم الحي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط أو هدمها / إخراجها في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتينات في كل مكان كركائز لمقايسة deubiquitination في المختبر. يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لتحديد DUBs محددة للبروتينات المستهدفة عن طريق احتضان ركائز موجودة في كل مكان مع DUBs الفردية. قد تعمل البروتينات الموجودة في كل مكان كسقالة لتجنيد بروتينات الإشارات في الخلايا. يمكن تنقية مركب البروتين المستهدف في كل مكان عن طريق الترسيب المناعي المتسلسل في ظل ظروف التنقية الأصلية وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن استخدام البروتوكول الحالي على نطاق واسع للتحقيق في البروتينات الخلوية التي ينظمها الوجود في كل مكان.

تم إنشاء عدة طرق لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان ، والتي تشمل استخدام يوبيكويتين الموسومة بالتقارب ، والأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، والمجالات المعزولة المرتبطة باليوبيكويتين (UBDs)17. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام يوبيكويتين الموسوم بالتقارب كوسيط لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات. يوفر استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة مزايا على الطرق الأخرى. يتم تنقية البروتينات في كل مكان في وجود مسخ قوي ، مما يقلل من الارتباط غير المحدد بالراتنج المشحون بالنيكل عن طريق خطي البروتينات الخلوية وتعطيل تفاعلات البروتين والبروتين. في المقابل ، فإن استخدام الأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، و UBDs المعزولة كوسطاء لا يمكن أن يستبعد بشكل فعال شركاء الربط من البروتين المستهدف لأن التنقية تحتاج إلى إجراء في ظل ظروف أقل صرامة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التنقية أيضا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير ذات الصلة باستخدام هذه الوسطاء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ميل ملزم لأنواع ربط ubiquitin المختلفة بالإضافة إلى أحادي ومتعدد الوجود بواسطة بروتينات ملزمة لليوبيكويتين أو UBDsالمعزولة 17. يساهم استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة في سحب جميع البروتينات الخلوية في كل مكان. بدلا من ذلك ، فإن استخدام الأغاروز المقترن بالأجسام المضادة للعلم أو الأجسام المضادة لحمض الهيمونيك المتاح تجاريا يجعل من السهل ترسيب البروتينات المستهدفة واسعة النطاق التي تحمل علامة العلم أو HA في ظل ظروف غير مسخة. يمكن استخدام خطوة تنقية ثانية ، على سبيل المثال ، عن طريق راتنج مشحون بالنيكل يستهدف يوبيكويتين بولي هيس ، للحصول على بروتينات مستهدفة في كل مكان ذات نقاوة عالية للتجارب النهائية. والجدير بالذكر أنه يمكن تكييف استراتيجية تنقية علامات الخاتمة عندما لا يمكن الحصول على جسم مضاد معين لترسيب البروتينات المستهدفة بشكل فعال. أخيرا ، فإن تنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات ، مقارنة بالتنقية في المختبر ، تحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم توفير خلايا H1299 من قبل بنك الخلايا الجذعية ، الأكاديمية الصينية للعلوم وثبت أنها سلبية للتلوث الميكوبلازما.

1. ثقافة الخلية

  1. بالنسبة للمزرعة الأولية ، ضع 1 × 106 خلايا من خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري ، H1299 في طبق بتري 10 سم مع 10-12 مل من وسط RPMI 1640 مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ مضاف جلوتامين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، ومضادات حيوية (100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2. قم بتقسيم الخلايا كل 2-3 أيام اعتمادا على وقت وصولها إلى 80٪ -90٪ التقاء.
  2. قبل يوم واحد من النقل ، قم بإعداد 6-9 × 106 خلايا لثلاثة أطباق بتري وطبق 2-3 × 106 خلايا في طبق بتري واحد 10 سم يحتوي على 10-12 مل من الوسط لتحقيق التقاء 70٪ -90٪ أثناء النقل.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خلايا HEK293T لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان نظرا لكفاءتها العالية في النقل ومستوى تعبير البروتين.

2. نقل البلازميد

  1. أضف 1.5 مل من وسط المصل المختزل في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
  2. أضف الحمض النووي البلازميد الجاهز للنقل إلى كل أنبوب لعمل التخفيفات على النحو التالي. الأنبوب 1: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 12 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 2: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، و 3 ميكروغرام من بلازميد His-HA-Ub (HH-Ub) ، و 9 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 3: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 3 ميكروغرام من بلازميد HH-Ub ، و 9 ميكروغرام من بلازميد Mdm2. أضف ما مجموعه 0.2 ميكروغرام من بلازميد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى كل أنبوب لمراقبة كفاءة النقل.
    ملاحظة: يجب إجراء تجربة تجريبية لتحديد الكميات المثلى من البلازميدات اللازمة لتحقيق تعبير البروتين المستهدف الفعال في الخلايا.
  3. أضف 78 ميكرولتر من كاشف نقل الجسيمات الشحمية إلى 4.5 مل من وسط المصل المختزل في أنبوب طرد مركزي آخر لتخفيف الجسيمات الشحمية. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. أضف 1.5 mL من محلول الجسيمات الشحمية المخففة إلى كل أنبوب من الخطوة 2.2 التي تحتوي على 1.5 mL من محلول الحمض النووي المخفف. امزج جيدا واربط البلازميدات بالليبوزومات لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. استخدم الحمض النووي البلازميدي: نسبة الجسيمات الشحمية 1: 2 (ميكروغرام: ميكرولتر) لكل عملية نقل.
  5. تخلصي من الوسط الأصلي من أطباق بتري وأضيفي 9 مل من وسط المصل المختزل إلى كل طبق. أضف 3 مل من خليط الحمض النووي الشحمي إلى كل طبق واخلط المحلول عن طريق هز الطبق برفق ذهابا وإيابا 3x ، ثم اليسار واليمين 3x لتوزيع الخليط بالتساوي في الطبق.
  6. زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استبدل الوسط بعد 4-6 ساعات واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24-36 ساعة.

3. جمع الخلايا

  1. بعد 24-36 ساعة ، عالج الخلايا ب MG132 بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر لمدة 4-6 ساعات.
    ملاحظة: MG132 هو ألدهيد الببتيد الذي يمنع بكفاءة النشاط المحلل للبروتين لمركب البروتيازوم 26S. يمكن زيادة كميات البروتينات الموجودة في كل مكان مع سلاسل البولي يوبيكويتين المرتبطة بالليسين -48 (K48) بعد معالجة الخلايا ب MG132 أو مثبطات البروتيازوم الأخرى.
  2. تخلص من الوسط ، واغسل الخلايا 2x (مع الحرص على عدم طرد الخلايا) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، واستنشاق الخلايا باستخدام ماصات مصلية.
  3. أضف 1 مل من PBS إلى الطبق ، وقم بإزالة الخلايا عن طريق الكشط باستخدام مكشطة نظيفة ، ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي بسرعة 700 × جم لمدة 5 دقائق لجمع كريات الخلايا.

4. تنقية البروتينات في كل مكان في ظل ظروف غير تغيير طبيعة

  1. تحضير مخزن تحلل العلم (50 مللي مول Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9) ، 137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 1 مللي مول حمض رباعي الخليك ثنائي الأمين الإيثيلين (EDTA) ، 1٪ Triton X-100 ، 0.2٪ ساركوسيل ، و 10٪ جلسرين) مكمل طازجا بكوكتيل مثبط للبروتياز قبل الاستخدام.
  2. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخلايا الموجودة في كل أنبوب ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، ثم احتضن الخليط على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تخضع الخليط إلى 5-10 نبضات قصيرة من الموجات فوق الصوتية. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. احتضان الخليط على دوار بسرعة 40 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي للعينات بالموجات فوق الصوتية عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  5. حصة 80 ميكرولتر (1/10) من مستخلص الخلية وتخلط مع 20 ميكرولتر من 5x كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) تحميل المخزن المؤقت. تغلى العينات على حرارة 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم هذه العينات كمجموعة إدخال لمراقبة تعبير البروتين.
  6. أضف 30 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة M2 المترافقة (Flag / M2) المضادة للعلم إلى مستخلصات الخلايا المتبقية واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل أو طوال الليل.
  7. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخرز واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
  8. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. كرر الخطوة 4.7 لمدة 4-6 مرات.
  9. أضف 40 ميكرولتر من ببتيدات العلم بتركيز نهائي قدره 200 نانوغرام / ميكرولتر إلى الخرز واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لتقشير البروتينات المرتبطة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  11. أضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x ، وغلي الخليط عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنه في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف من الخطوة 4.10 مباشرة عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.
    ملاحظة: يمكن زيادة كمية البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق زيادة عدد الخلايا وكميات البلازميدات المنقولة. يمكن تكييف استراتيجية وضع العلامات على epitope لتنقية المجمعات الخلوية التي ترتبط على وجه التحديد ب p53 في كل مكان في ظل ظروف التنقية الأصلية. من خلال التعبير المشترك عن Flag-p53 و mdm2 و HA-ubiquitin ، قد يتم ترسيب مركب بروتين p53 في كل مكان بواسطة الأغاروز المتتابع Flag و HA المترافق بالأجسام المضادة من خلايا الثدييات. للحفاظ على شركاء الربط لبروتينات p53 في كل مكان ، يجب استخدام محلول تحلل BC100 الأقل صرامة (20 mM Tris-HCl (pH 7.9) ، 100 mM NaCl ، 10٪ glycerol ، 0.2 mM EDTA ، 0.2٪ Triton X-100 ، و 1x مثبط الأنزيم البروتيني) أثناء عملية التنقية. يخضع الشطف من ببتيد HA لقياس الطيف الكتلي لتحديد جميع الشركاء الذين يرتبطون على وجه التحديد ب p53 في كل مكان.

5. تنقية البروتينات في كل مكان تحت ظروف تغيير طبيعة

  1. أضف 1 مل من PBS المثلج إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3 واخلطها بالتساوي. القسمة 100 ميكرولتر (حجم 1/10) من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق كعينة إدخال.
  2. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع كريات الخلية. أضف 80 ميكرولتر من مخزن تحلل العلم إلى عينة الإدخال ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، وقم بتحليل الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة.
  3. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حاصل 80 ميكرولتر من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  4. أضف 20 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x إلى الطافي ، ثم غليه عند 98 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع حبيبات الخلية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت يوبيكويتين 1 (المخزن المؤقت UB 1 ؛ 6 M guanidine-HCI ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و0.2٪ Triton X-100 ، مكمل حديثا ب 10 mM β-mercaptoethanol و 5 mM imidazole) إلى كريات الخلية واخلطها عدة مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لتوزيع الخلايا بالتساوي.
    ملاحظة: قد يختلف تركيز إيميدازول من 5 مليمول إلى 20 مليمول لتقليل ارتباط البروتين غير النوعي بالراتنج المشحون بالنيكل. يحتوي المخزن المؤقت Ubiquitin على هيدروكلوريد جوانيدين ، الذي يعطل كل من الأربطة و DUBs. β-mercaptoethanol هو سائل واضح عديم اللون مع رائحة قوية غير سارة تشبه البيض الفاسد. سوف يتسبب المحلول عالي التركيز في أضرار جسيمة للغشاء المخاطي والجهاز التنفسي العلوي والجلد والعينين. ارتداء القفازات والنظارات الواقية والعمل في غطاء الدخان.
  6. تخضع الخلية المحللة إلى 10-20 جولات من الموجات فوق الصوتية حتى الحل لم يعد لزجا. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. جهاز طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة في RT ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  7. أضف 30 ميكرولتر من الراتنج المشحون بالنيكل إلى المادة الطافية واحتضانها على دوار مضبوط على 15 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات أو طوال الليل في RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز.
  8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت UB 1 ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين في RT لجمع الخرز.
  9. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ubiquitin 2 (المخزن المؤقت UB 2 ؛ 8 M اليوريا ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و0.2٪ Triton X-100) إلى الخرز ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
  10. إلى الخرز ، أضف 1 مل من PBS ، واحتضن بالتناوب في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
  11. قم بإذابة البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرز ب 40 ميكرولتر من الإيميدازول بتركيز نهائي قدره 0.5 M لمدة 1 ساعة عند RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند RT.
  12. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 5x SDS ، ثم غليها عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنها في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف غير المعالج عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.

6. الكشف عن البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق النشاف الغربي

  1. حل العينات من الخطوتين 4.11 و 5.12 بواسطة كبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، ثم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المقابلة كما هو موضح18.
  2. باختصار ، احتضن الغشاء عن طريق غمر 20 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على مسحوق حليب defat بنسبة 5٪ في محلول TBST (15 mM Tris-HCI ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.6 ، 4.6 mM Tris-base ، 150 mM NaCI ، مكمل حديثا بنسبة 0.1٪ Tween-20 قبل الاستخدام) في RT لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 2 ساعة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم الأجسام المضادة التالية لكل مجموعة. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الأولية بتخفيف 1: 1000.
    1. الكشف عن إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
    2. الكشف عن بروتينات p53 في كل مكان مع الجسم المضاد لحمض الهيمونيك أو الجسم المضاد لليوبيكويتين بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
    3. اكتشف بروتينات p53 المنتشرة في كل مكان باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
    4. اكتشف البروتين الكلي في كل مكان باستخدام جسم مضاد مضاد لحمض الهيالورونيك أو جسم مضاد لليوبيكويتين بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
  3. احتضان الغشاء بأجسام مضادة ثانوية مترافقة من بيروكسيديز الفجل (HRP) في RT لمدة 1 ساعة بعد غسل 3x باستخدام محلول TBST لمدة 5 دقائق لكل منهما. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الثانوية بتخفيف 1: 3000. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام المخزن المؤقت TBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما بتحريض لطيف.
  4. بدء نظام التصوير الكيميائي للكشف عن الإشارات من النشاف الغربي. تحضير محلول الركيزة ل HRP عن طريق خلط المحاليل A و B بنسبة 1: 1.
  5. ضع غشاء النيتروسليلوز في الكاميرا الغامضة ووجهه لأعلى وقم بتغطية محلول الركيزة بالتساوي على الغشاء باستخدام مسدس ماص. حدد إجراء التعرض التلقائي لالتقاط إشارات الإضاءة الكيميائية وضبط وقت التعرض يدويا حتى يتم الحصول على إشارة مثالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الرسم التخطيطي بروتينات يوبيكويتين (HH-Ub) ذات العلامات المزدوجة (HH-Ub) (الشكل 1 أ). يلخص الشكل 1 ب الإجراءات المستخدمة لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان. يمكن ربط يوبيكويتين الموسومة بولي هيه لاستهداف البروتينات في خلايا الثدييات. يمكن تنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان باستخدام حبات Flag / M2 في ظل ظروف غير متغيرة أو عن طريق كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمدة (IMAC) في ظل ظروف تغيير الطبيعة (الشكل 1 ب). تم ترسيب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يلعب الوجود في كل مكان دورا مهما في جميع العمليات الخلوية الفسيولوجية والمرضية تقريبا2. في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في فهم الدور الجزيئي لليوبيكويتين في مسارات الإشارات وكيف تؤدي التغييرات في نظام يوبيكويتين إلى أمراض بشرية مختلفة2. تساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توفير نظرة ثاقبة للأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في هذه العمليات. يمكن تنقية مخاليط البروتينات المترافقة يوبيكويتين من الخلايا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة وتغيير طبيعة الأسنان. يمكن استخدام IMA...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81972624) إلى D.L.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
β-mercaptoethanolSangon BiotechM6250
Amersham ECL Mouse IgG ، AB كامل مرتبط ب HRP (من الأغنام)GE الرعاية الصحيةNA931الثانوية antibdoy
Amersham ECL Rat IgG ، HRP المرتبط ب كامل (من الحمار) GEالرعاية الصحيةNA935الثانوية antibdoy
المضادة للعلم M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220FLAG / M2 الخرز
الجسم المضاد أحادي القولون المضاد ل GFPسانتا كروزsc-9996الجسم المضاد الأولي
المضاد ل HA عالي التقاربRoche11867423001الجسم المضاد الأساسي
المضاد للجسم المضاد أحادي القولون MDM2 (SMP14)سانتا كروزsc-965الجسم المضاد الأساسي
المضاد للجسم المضاد أحادي القولون المضاد p53 (DO-1) سانتاكروزsc-126الجسم المضاد الأساسي
EDTASigma-AlddichE5134مذيب
مصل الأبقار الجنينيVivaCellC04001-500FBS
FLAG الببتيدSigma-AlddichF3290تحضير عازلة الشطف
GlutaMAXGibco35050-061مكمل
Guanidine-HCISangon BiotechA100287-0500المذيب
H1299بنك الخلايا الجذعية ، الأكاديمية الصينية برنامج Science
Image LabBio-rad
ImmidazoleSangon BiotechA500529-0100مذيب
Immobilon Western Chemiluminescent HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Lipofectamine 2000 كواشفInvitrogen11668019كاشف الإرسال
MG132MedChemExpressHY-13259مثبط البروتيازوم
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500المذيب
NaClSangon BiotechA610476-0005المذيب
NaFSigma-Alddich201154المذيب
NaH2PO4Sangon BiotechA501726-0500المذيب
Ni-NTA AgaroseQIAGEN30230راتنج مشحون بالنيكل
غشاء نشاف النيتروسليلوزGE الرعاية الصحية106000020.45 & micro ؛ م حجم المسام
Opti-MEM مصل منخفض متوسطGibco31985-070تعداء متوسط
PBSCorning21-040-cv
Penicillin-Streptomycin SolutionSangon BiotechE607011-0100
كوكتيل مثبط البروتيازالحيوي Sigma-AldrichP8340
RPMI 1640الصناعات البيولوجية01-100-1ACSمتوسط
SarkosylSigma-AlddichL5777المذيبات
SDS تحميل العازلةBeyotimeP0015L
بيروفات الصوديومGibco11360-070ملحق
Tris-baseSangon BiotechA501492-0005المذيب
Tris-HCISangon BiotechA610103-0250المذيب
Triton X-100Sangon BiotechA110694-0500كاشف
Tween-20Sangon BiotechA100777-0500
ملحق نظام التصوير الكيميائي عالي الحساسيةBio-radChemiDoc XRS +
UreaSangon BiotechA510907-0500المذيب
المضاد

المراجع

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

البروتينات الموبيكويتينيةبروتين p53بوبيكويتينة البروتينتنقية البروتينلطخة وسترنالترسيب المناعيظروف المسخراتنج النيكلوسم FLAG
تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.