مقالة منهجية

صياغة وتوصيف نظام ناقل الدوبامين القائم على الإكسوسوم

DOI:

10.3791/63624

⸱

أبريل 4, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، كنا نهدف إلى الحصول على تركيبة عن طريق تحميل الدوبامين للإكسوسومات المعزولة للخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون. يتم وصف عزل وتوصيف الإكسوسوم ، وتحميل الدواء في الإكسوسومات الناتجة ، والنشاط السام للخلايا للتركيبة المطورة في هذا البروتوكول.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل الإكسوسومات التي يتراوح حجمها بين 40 و 200 نانومتر أصغر مجموعة فرعية من الحويصلات خارج الخلية. تلعب هذه الحويصلات النشطة بيولوجيا التي تفرزها الخلايا دورا نشطا في الشحن والتواصل بين الخلايا. توجد الإكسوسومات في الغالب في سوائل الجسم مثل البلازما والسائل النخاعي والبول واللعاب والسائل الأمنيوسي واللبأ وحليب الثدي وسائل المفاصل والسائل المنوي وحمض الجنب. بالنظر إلى حجم الإكسوسومات ، يعتقد أنها قد تلعب دورا مهما في أمراض الجهاز العصبي المركزي لأنها يمكن أن تمر عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB). ومن ثم ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام ناقل نانوي قائم على الإكسوسوم عن طريق تغليف الدوبامين في إكسوسومات معزولة من الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون (WJ-MSCs). تم تحضين الإكسوسومات التي اجتازت عملية التوصيف بالدوبامين. تم إعادة توصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين في نهاية الحضانة. تم التحقيق في الإكسوسومات المحملة بالدوبامين في إطلاق الدواء ومقايسات السمية الخلوية. أظهرت النتائج أنه يمكن تغليف الدوبامين بنجاح داخل الإكسوسومات وأن الإكسوسومات المحملة بالدوبامين لم تؤثر على صلاحية الخلايا الليفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes ، الحويصلات النشطة بيولوجيا مع ميزات كبيرة ، تتراوح في الحجم من 40 نانومتر إلى 200 نانومتر. تنشأ الإكسوسومات من غشاء الخلية وتتشكل بسبب إطلاق الإندوسومات1. تعمل هذه الهياكل كمحاورات من خلية إلى خلية وتتفاعل مع الخلايا المجاورة لتسهيل نقل الجزيئات النشطة. يمكن عزل الإكسوسومات من العديد من المصادر المختلفة. وتشمل هذه سوائل الجسم مثل البلازما والبول والسائل النخاعي واللعاب ، وكذلك خطوط الخلايا المزروعة في ظل ظروف المختبر . تلعب الإكسوسومات دورا مهما في القضاء على تلف الأعصاب ، وذلك بفضل الجزيئات الحيوية التي تحتوي عليها ، مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية2. تقوم Glia ، وهي الخلايا الداعمة للجهاز العصبي3 ، بنقل البروتينات والحمض النووي الريبي الصغير إلى محاور الخلايا العصبية عبر exosomes4.

يتم أيضا إطلاق الدهون التي تشكل غمد المايلين ، والتي تعد سمة مميزة في التوصيل العصبي ، من الخلايا قليلة التغصن عبر exosomes 4,5. تشارك الإكسوسومات أيضا في عمليات مثل اللدونة المشبكية ، واستجابة الإجهاد العصبي ، والتواصل بين الخلايا الخلوية ، وتكوين الخلايا العصبية في الدماغ 6,7. حقيقة أن الإكسوسومات تمتلك أبعادا نانوية تمكنها من المرور عبر BBB. هناك طريق انتقال خاص من السائل الخلالي إلى السائل النخاعي بعد اختراق هذا الغشاء8. بفضل خواص سطحها ، يمكن أن تتفاعل الإكسوسومات بكفاءة مع الخلايا المستهدفة كنظام لتوصيل الدواء وتوصيل الأدوية المحملة بنشاط.

بسبب التعبير عن البروتينات اللاصقة المختلفة (tetraspanins و integrins) على سطح exosomes ، يمكن لهذه الحويصلات خارج الخلية أن تتفاعل بسهولة وتندمج مع أغشية الخلايا المضيفة9. يعتقد أنه يمكن استخدام exosomes كنظام لتوصيل الأدوية ، خاصة في علاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بسبب قدرتها على اختراق BBB وخصائصها السطحية. الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لديها خطر أقل للرفض المناعي مقارنة بالعلاجات الخلوية الخيفية ، وفي هذا الصدد ، يمكن أن تكون مكونا مهما في تطبيقات العلاج الخالية من الخلايا10.

الدوبامين هو جزيء نقصه في الدماغ هو السمة المميزة لمرض باركنسون (PD) ، ويزداد سوءا يوما بعد يوم11،12،13. من المعروف أن PD يرتبط بانحطاط الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء للدماغ المتوسط وفقدان وظائف الخلايا العصبية الحركية14,15. موت الخلايا العصبية الدوبامين يمنع توريد الدوبامين الناقل العصبي إلى مخطط الدماغ. وهذا بدوره يؤدي إلى ظهور أعراض خاصة بمرض باركنسون16. هذه الأعراض من PD هي بطء الحركة ، وعدم الاستقرار الوضعي ، والصلابة ، وخاصة الهزة يستريح12،13. على الرغم من أن مرض باركنسون قد تم وصفه لأول مرة منذ أكثر من قرنين من الزمان ، إلا أن الدراسات لفهم أمراض المرض ومسبباته لا تزال جارية ومن المقبول حاليا أن مرض باركنسون مرض جهازي معقد17. من المتوقع أن يحدث نقص الدوبامين ، وتلاحظ أعراض PD السريرية عندما تتدهور أكثر من 80 ٪ من الخلايا العصبية18. في علاج المرض ، يفضل مكملات الدوبامين غير المكتملة لتقليل الأعراض الحركية. أظهرت الدراسات في الجسم الحي أن التسريب المباشر للدوبامين في الدماغ يقلل بشكل كبير من الأعراض في الحيوانات19. تستخدم سلائف الدوبامين مثل L-DOPA (L-3،4-dihydroxyphenylalanine) وأدوية مستقبلات الدوبامين في العيادة لأن التسريب المباشر للدوبامين في الدماغ غير ممكن في البشر ولا يمكن للدوبامين الذي يدخل النظام عبور BBB20. هذه الأنواع من الأدوية تفقد فعاليتها بمرور الوقت. ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن نهج علاجي علاجي لمرض باركنسون. وبالتالي ، هناك ضرورة كبيرة لتطوير استراتيجيات علاجية وطرق علاج جديدة للكشف عن الفيزيولوجيا المرضية للمرض وتقليل تأثير مرض باركنسون على المرضى.

جذبت الدراسات القائمة على الإكسوسوم الانتباه مؤخرا لجمع المعلومات حول كل من الأساليب العلاجية وأمراض أمراض الجهاز العصبي. لقد ثبت أن الإكسوسومات المشتقة من MSC تقلل الالتهاب في تلف الأعصاب وتساهم في تجديد الخلايا العصبية21،22،23. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن إفرازات exosome المشتقة من MSC تقلل من موت الخلايا المبرمج من خلال إظهار تأثيرات التغذية العصبية والوقائية العصبية ، خاصة على الخلايا العصبية الدوبامينية24,25. تسارعت الأبحاث على المنصات التي تستخدم فيها الإكسوسومات كأنظمة لتوصيل الأدوية العلاجية بشكل مكثف في السنوات الأخيرة. في العديد من الدراسات ، لوحظ أنه يمكن تغليف الأدوية ذات الصلة بسهولة في exosomes وتسليمها بأمان إلى الخلايا والأنسجة والأعضاء المستهدفة26,27. يمكن استخدام طرق مختلفة مثل الحضانة ، ودورات التجميد / الذوبان ، والصوتنة ، والبثق لتحميل الدواء في exosomes28.

يسمح Coincubation مع exosomes أو الحويصلات الشبيهة بالإكسوسوم بتغليف الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي في أنظمة التوصيل هذه28،29،30. على وجه الخصوص ، تم تحميل جزيئات مختلفة مثل الكركمين 31 ، الكاتلاز 30 ، دوكسوروبيسين32 ، وباكليتاكسيل33 بشكل فعال في exosomes. وقد لوحظ أن exosomes المحتوية على الكاتلاز ، والتي لها نشاط مضاد للأكسدة ، تراكمت بكفاءة في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ وأظهرت أنشطة عصبية قوية30. في نفس الدراسة ، وجد أن الصابونين ، المضاف إلى المجمع لزيادة كفاءة التحميل ، يزيد من نسبة تحميل الدواء أثناء الحضانة30,34. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لوضع معايير لتحميل الدواء في exosomes.

تصف هذه الورقة تطوير نظام ناقل نانوي عن طريق تغليف الدوبامين في الإكسوسومات التي تم عزلها من WJ-MSCs. يتم شرح جميع الخطوات ، بما في ذلك زراعة WJ-MSCs ، وعزل وتوصيف الإكسوسومات ، وتجارب تحميل الأدوية ، وتوصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين بتقنيات مختلفة ، وتحليل السمية الخلوية في المختبر بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون وحفظها بالتبريد

  1. قم بإزالة WJ-MSCs (من ATCC) من الفريزر -80 درجة مئوية. بذر الخلايا في دورق يحتوي على وسط DMEM-F12 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). احتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2.
  2. تغيير وسط الثقافة كل 2 أيام. مرور الخلايا عندما تصل إلى التقاء 80٪. اغسل الخلايا المراد تمريرها ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: يضمن الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني قبل إضافة التربسين سهولة فصل الخلايا عن سطح القارورة.
  3. قم بإزالة PBS وإضافة 5 مل من محلول التربسين-EDTA إلى القارورة. احتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2.
  4. اجمع المادة الطافية في الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من DMEM-F12 + 10٪ FBS إلى الأنبوب عن طريق الماصة.
  5. انقل الخلايا إلى قارورة أكبر واستمر في المزرعة بإضافة DMEM-F12 + 10٪ FBS حتى يتم الحصول على إكسوسومات كافية35.
    ملاحظة: يتم تجميد الخلايا المستزرعة بكثافة 1 مليون / مل مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

2. إنتاج الإكسوسومات من الخلايا الجذعية الوسيطة جيلي وارتون

ملاحظة: يتم عزل الإكسوسومات من WJ-MSCs المستزرعة. يتم إجراء عزل Exosome عندما تغطي الخلايا سطح القارورة وتصل إلى كثافة 80٪ تقريبا.

  1. قم بإزالة الوسط الطافي الذي يحتوي على 10٪ FBS من القارورة واغسل الخلايا ب 5 مل من PBS. أضف وسط DMEM-F12 الخالي من المصل إلى الخلايا بعد شطفه باستخدام برنامج تلفزيوني. احتضان قوارير لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. بعد الحضانة ، اجمع الوسط الخالي من المصل في الأنبوب واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: في الخطوة 2.1 ، يتم جمع 180 مل من الوسط الخالي من المصل وتخزينه عند -20 درجة مئوية. بعد الذوبان ، تبدأ عملية الطرد المركزي على دفعات ، كما هو موضح أدناه.
  2. عزل الإكسوسومات
    1. أجهزة الطرد المركزي الوسط الخالي من المصل الذي تم جمعه عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية. اسحب بعناية المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب آخر.
    2. أجهزة الطرد المركزي المادة الطافية المجمعة عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية. اسحب بعناية المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب آخر.
    3. جهاز طرد مركزي تم تجميع المادة الطافية عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة عند +4 درجة مئوية. اسحب بعناية المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب آخر.
    4. نقل المادة الطافية المجمعة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة وأجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 110000 × جم لمدة 130 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية ببطء وأضف 1 مل من PBS إلى الحبيبات.
    5. دوامة الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 110000 × جم لمدة 70 دقيقة عند +4 درجة مئوية36 (الشكل 1). قم بإزالة المادة الطافية ببطء وأضف 1 مل من PBS إلى الحبيبات.
      ملاحظة: بعد اكتمال خطوات الطرد المركزي الفائق ، يمكن تخزين الإكسوسومات التي تم الحصول عليها عند -80 درجة مئوية. الحبيبات التي تم الحصول عليها جاهزة الآن للتوصيف.

figure-protocol-1
الشكل 1: عزل الجسيمات الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. توصيف الإكسوسومات

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    ملاحظة: يتم إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد حجم وتركيز الإكسوسومات المعزولة. يجب أن تكون الأقراص المستخدمة في محلول 1x PBS في حدود درجة الحموضة 7.3-7.5. يحتوي 1x PBS Solution على 10 mM فوسفات عازلة ، و 137 mM كلوريد الصوديوم ، و 2.7 mM كلوريد البوتاسيوم. يتم تحضير المحلول بإضافة 1 قرص PBS في 100 مل من الماء المقطر. يتم تعقيم هذا الحل المحضر عن طريق التعقيم.
    1. تمييع exosomes 100 أضعاف عن طريق إضافة 990 μL من PBS إلى 10 μL من exosomes. خذ التعليق المخفف في حقنة يمكن التخلص منها.
    2. قم بتشغيل جهاز NTA وقم بتوصيل الكمبيوتر. افتح البرنامج.
    3. قم بحقن العينة في المحقنة في الأنبوب الموجود في قسم الكاسيت بالجهاز. أغلق غطاء الدرج الخاص بالجهاز.
    4. في البرنامج الذي يفتح ، انقر فوق الزر "بدء التحليل ". احفظ النتائج التي تم الحصول عليها بالضغط على زر التسجيل .
  2. تحليل تشتت الضوء الديناميكي
    ملاحظة: يتم أيضا تخفيف الإكسوسومات المعزولة لقياس جهد زيتا وحجمها بنفس الطريقة المستخدمة في تحليل NTA.
    1. أضف 980 ميكرولتر من PBS إلى 20 ميكرولتر من الإكسوسومات.
    2. افتح جهاز تحجيم زيتا والكمبيوتر المتصل. افتح البرنامج.
    3. أضف التعليق من الخطوة 3.2.1 إلى كوفيت القابل للتصرف. افتح غطاء الجهاز ، ضع الكوفيت في الكاسيت ، وأغلق الغطاء.
    4. حدد نوع كوفيت في برنامج الجهاز. انقر فوق الزر "بدء التحليل " لتحليل إمكانات زيتا والأبعاد.
      ملاحظة: يتم إجراء التحليلات بشكل منفصل لتحليل الأبعاد وجهد زيتا.

4. تحميل الدوبامين في exosomes

ملاحظة: بعد الانتهاء من توصيف الإكسوسومات WJ-MSCs ، تم الحصول على الإكسوسومات المحملة بالدوبامين كنظام لتوصيل الدواء. يتم تنفيذ تحميل المخدرات في exosomes باستخدام طريقة الحضانة.

  1. أضف 3 مل من PBS إلى معلق exosome من الخطوة 2.2.5. تعقيم التعليق المخفف عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. نقل 500 ميكرولتر من تعليق exosome المعقم إلى أنبوب آخر.
  2. تحضير محلول الدوبامين (0.5 مجم / مل) بالماء المقطر. أضف 500 ميكرولتر من محلول الدوبامين إلى الأنابيب التي تحتوي على الإكسوسومات.
  3. أضف الصابونين إلى التعليق في الخطوة 4.2. احتضان معلق إكسوسوم الدوبامين المحضر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز تركيز الصابونين 0.002٪ من المحلول الكلي.
  4. أجهزة الطرد المركزي الفائقة التعليق عند 90000 × جم لمدة 70 دقيقة لإزالة الدوبامين والصابونين الحر من الوسط. قم بتخزين الإكسوسومات المعزولة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام لمزيد من التحليل37.
    ملاحظة: أضف 0.02٪ حمض الأسكوربيك لاستقرار محلول الدوبامين المحضر.

5. توصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    ملاحظة: يتم إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد حجم وتركيز الإكسوسومات المعزولة.
    1. اتبع الخطوات 3.1.1-3.1.4 لتخفيف الإكسوسومات وإجراء NTA.
  2. تحليل تشتت الضوء الديناميكي
    ملاحظة: يتم أيضا تخفيف الإكسوسومات المعزولة لقياس جهد زيتا وحجمها بشكل مشابه لتحليل NTA.
    1. اتبع الخطوات 3.2.1-3.2.4 لتخفيف الإكسوسومات وإجراء تحليل ديناميكي لتشتت الضوء.
      ملاحظة: يتم تحليل الحجم وإمكانات زيتا لكل محلول (سابونين ، دوبامين ، إكسوسوم دوبامين) بشكل منفصل.

6. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC)

ملاحظة: يتم قياس كميات الدوبامين المحملة في exosomes بواسطة طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). للكشف عن وجود الدوبامين داخل التركيبة التي تم الحصول عليها ، يتم تفجير exosomes بواسطة عملية خاصة.

  1. ضع التركيبة في سخان 75 درجة مئوية لتتبخر. أضف الأسيتونيتريل (نسبة 50:50) إلى التعليق والدوامة. قم بتسخين المحلول لمدة 10 دقائق.
  2. جهاز طرد مركزي الحل لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. تحليل جميع التحليلات باستخدام عمود C18 عند 30 درجة مئوية بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة (المرحلة المتنقلة H2O / acetonitrile). قياس الامتصاص عند 230 نانومتر38.

7. قياس قدرة تحميل الدواء (DL) وحركية إطلاق الدواء في المختبر

  1. قدرة تحميل الدواء (DL)
    ملاحظة: يتم تحديد كمية الدوبامين المحملة في الإكسوسومات باستخدام التحليل الطيفي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية. تتم قراءة الامتصاص عند 280 نانومتر. تستخدم المواد الطافية التي تم جمعها أثناء التوليف لقياس كمية الدواء المفرغ. يتم تحديد تركيز الدوبامين في المادة الطافية عبر منحنى معايرة قياسي للدوبامين.
    1. تحضير محلول مخزون من 1 ملغ / مل من الدوبامين. تحضير تركيزات 0.05 و 0.1 و 0.2 و 0.3 و 0.4 و 0.5 ملغم / مل من محلول المخزون باستخدام الماء المقطر.
      ملاحظة: أضف 0.02٪ حمض الأسكوربيك لاستقرار محلول الدوبامين المحضر.
    2. قم بإنشاء منحنى معايرة قياسي عن طريق قياس امتصاص كل تخفيف للدوبامين عند 280 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
    3. قياس امتصاص الطافد عند 280 نانومتر.
    4. حساب قدرة تحميل الدواء للدوبامين باستخدام مكافئ (1) 39.
      DL (٪) = figure-protocol-2 100 (1)
      ملاحظة: يتم إجراء التحليل في ثلاث نسخ.
  2. حركية إطلاق المخدرات في المختبر
    ملاحظة: يتم إجراء حركية إطلاق الدواء من exosomes المحملة الدوبامين باستخدام غشاء غسيل الكلى. يستخدم PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، كوسيط إطلاق لمحاكاة البيئة المكروية الفسيولوجية.
    1. أضف 1 مل من الإكسوسومات المحملة بالدوبامين إلى غشاء غسيل الكلى. ضع الغشاء في كأس زجاجية. أضف 15 مل من PBS إلى الكأس الزجاجية.
    2. عينة 1 mL من وسط الإطلاق في كأس زجاجية عند 0.5 و1 و2 و4 و6 و8 ساعات. في كل نقطة زمنية ، استبدل حجم العينة ببرنامج تلفزيوني جديد. تحليل العينات المأخوذة على فترات زمنية محددة عند 280 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة المرئية وفوق البنفسجية.
    3. احسب النتائج باستخدام مكافئ (2) 40.
      الإصدار (٪) = figure-protocol-3 100 (2)
      ملاحظة: يتم إعداد منحنى معايرة لتحديد حركية إطلاق الدواء في المختبر . يتم تحضير محلول الدوبامين بتركيزات 0.5 و 1 و 1.5 و 2 و 2.5 و 3 و 3.5 و 4 و 4.5 و 5.0 مجم / مل. يتم تحديد قيمة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لكل تركيز عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية.

8. اختبار السمية الخلوية في المختبر

  1. تنشيط وثقافة الخلايا الليفية
    1. قم بإزالة الخلايا الليفية من الفريزر -80 درجة مئوية. زرع الخلايا في قارورة تحتوي على DMEM-F12 + 10٪ FBS.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2. تغيير وسط الثقافة كل 2 أيام.
    3. مرور الخلايا حتى تصل إلى التقاء 80 ٪. اتبع الخطوات من 1.3 إلى 1.5. بعد الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 مل من DMEM-F12 + 10٪ FBS ، وزرع 10000 خلية لكل بئر في 96 صفيحة بئر.
      1. أضف DMEM-F12 متوسط + 10٪ FBS واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2. تغيير وسط الآبار في نهاية الحضانة.
    4. تحضير مخزون تعليق exosome محمل الدوبامين. قم بتخفيف تركيبة الإكسوسوم المحملة بالدوبامين بوسط للحصول على تركيزات 100 ميكرولتر / مل ، 250 ميكرولتر / مل ، 500 ميكرولتر / مل ، و 1000 ميكرولتر / مل.
    5. أضف التركيزات المحضرة إلى الخلايا داخل كل بئر من لوحة 96 بئرا. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حاضنة تحتوي على 5٪ CO241.
  2. مقايسة جدوى خلية MTT
    ملاحظة: في نهاية الحضانة ، يتم تحديد نسب صلاحية الخلايا بواسطة اختبار MTT.
    1. تحضير محلول MTT (5 مجم / مل) باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 10 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر. احتضان لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    2. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بقياس قيم الامتصاص في قارئ ELISA عند 570 نانومتر42,43.
      ملاحظة: يتم إجراء اختبار جدوى MTT في ثلاث نسخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتوصيف الإكسوسوم
يتم استزراع الخلايا الجذعية لهلام وارتون وحضنها في وسط خال من المصل لمدة 48 ساعة عندما تصل الثقافة إلى كثافة كافية. بعد نهاية الحضانة ، يتم تخزين المادة الطافية عند -20 درجة مئوية. يتم تخفيف المواد الطافية المجمعة باستخدام PBS وتخضع للطرد المركزي الفائق (الشكل 1). يتم تحليل الحل الذي تم الحصول عليه بواسطة تحليلات NTA و DLS. يتم تعقيم الإكسوسومات بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. تم تحديد متوسط حجم الإكسوسومات التي تم الحصول عليها ليكون 98 نانومتر (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes عبارة عن حويصلات غشائية صغيرة بأبعاد 40-200 نانومتر تفرزها معظم أنواع الخلايا ، على سبيل المثال ، MSCs1. قادرة على تمكين التواصل بين الخلايا ، يمكن أن تدخل exosomes الخلايا بطرق مختلفة مثل التداخل الخلوي ، البلعمة ، كثرة الكريات الدقيقة ، الاستيعاب بوساطة الدهون ، والاندماج33,44. بالمقارنة مع أنظمة الناقل النانوي الأخرى ، فإن الدهون والكوليسترول الموجود على سطح الإكسوسوم يمنح القدرة على حمل كل من الجزيئات المحبة للماء والكارهة للم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل بشكل أساسي من خلال تمويل البحث المقدم من مشاريع البحث العلمي بجامعة يلدز التقنية (TSA-2021-4713).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ مرشح غشاء مAisimoيستخدم لعملية التعقيم
0.45 & مرشح حقنة mAisimoيستخدم لعملية التعقيم
15 مل Falcon tubeNestيستخدم في زراعة الخلايا الخطوة
25 سم 2< / sup> قوارير زراعة الخلايا (Falcon ، قوارير زراعة أنسجة TPPعشتستخدم في زراعة الخلايا
الخطوة 50 مل عش أنبوبيستخدم في خطوة
زراعة الخلايا75 سم < sup > 2 < / sup> قوارير ثقافة الخلايا (Falcon ، قوارير زراعة أنسجة TPPعشتستخدم في زراعة الخلايا الخطوة
96 لوحة بئر (Falcon ، TPP microplates)Merck Milliporeتستخدم في خطوة زراعة
الخلايا AcetonitrileSigma271004-1Lتستخدم لتحليل HPLC
الأوتوكلافNUVE-OT 90Lالمستخدمة في عملية التعقيم
الخلية كابينة الثقافةهيرا الآمنة KSالمستخدمة في عملية زراعة الخلايا
الطرد المركزيهيتاشيCF16RNالمستخدمة في خطوة عزل الإكسوسوم
CO2< / sub> حاضنة مع خلية آمنة للأشعة فوق البنفسجيةباناسونيكتستخدم لعملية زراعة الخلايا
هيدروكلوريد الدوبامين H8502-10GSigmaH8502-10Gالمستخدمة في تحميل
الدوبامين الإكسوسومRNBJ7249 يستخدم خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل من Dulbecco - F12Sigmaكوسيط لزراعة
الخلايا مصل الأبقار الجنينية- FBSالجديFBS-16Aتم استخدامه عن طريق الإضافة إلى وسط زراعة الخلايا.
الفريزر -80 درجة ؛ CباناسونيكMDF-U5386S-PEلتخزين الخلايا والإكسوسومات الناتجة
ثلاجةباناسونيكMPR-215-PEتستخدم لتخزين زراعة الخلايا والمواد الأخرى
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء-HPLCAgilent Technologiesتم التحقيق في وجود الدوبامين من محتوى التركيبة التي تم الحصول عليها.
مجهر- بريموفرتزايسيستخدم لمراقبة الخلايا في زراعة الخلايا.
اختبار MTTBiomatikيستخدم لقياس صلاحية الخلية
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalيستخدم لتوصيف الإكسوسوم
Optima XPN-100 Ultra CentrifugeBeckman Coulterالمستخدم في خطوة عزل الإكسوسوم
PBS اللوحيBiomatik43602في تحضير محلول PBS
Penicilin / محلول الستربتومايسينالجديPB-Sتمت إضافته إلى الوسط لمنع التلوث في زراعة الخلايا.
Pipette AidIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMتستخدم في تحضير الحلول
Q500 SonicatorQsonica، LLCتستخدم لهضم الإكسوسومات في تحليل HPLC
SaponinSigma47036-50G-Fتم استخدامه عن طريق إضافته إلى المحلول الكلي في عملية تحميل الدوبامين الإكسوسوم.
Spectrostar-Nano-SpectrophototryBMG LABTECHالمستخدمة في تحليلات MTT وإطلاق المخدرات
SPSS 22برنامج الحزمة الإحصائية
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexتستخدم لخلط الحلول بشكل متجانس
حمام مائي 37 درجة ؛ C-SenovaSenovaالمستخدمة في خطوة زراعة الخلايا
وارتون s الخلايا الجذعية الهلامية الوسيطةATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSتستخدم لتوصيف الإكسوسوم
الصقر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Exosome Carrier SystemDopamine EncapsulationExtracellular VesiclesBlood Brain BarrierWharton s Jelly ExosomesNanoparticle TrackingSerial CentrifugationDrug Release AssayCytotoxicity AssayMTT Assay

مقالات ذات صلة