مقالة منهجية

تحديد نشاط انحلال الدم والفوسفوليباز في المستخلصات الخام من شقائق النعمان البحرية عن طريق المقايسات الحيوية المباشرة

DOI:

10.3791/63630

⸱

مارس 29, 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Micro y Nanotecnologías, Instituto de Ciencias Aplicadas y Tecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على مستخلص السم الخام من شقائق النعمان البحرية والكشف عن نشاطه الانحلالي والفوسفوليباز.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن تكوين سم شقائق النعمان البحرية جزيئات متعددة الببتيد وغير البروتينات. تتمتع مكونات التحلل الخلوي بإمكانات عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي لتصميم أدوات جزيئية جديدة. يقع سم شقائق النعمان البحرية في الخلايا الغدية من الأديم الخارجي والهياكل دون الخلوية التي تسمى الأكياس الخيطية ، وكلاهما موزع في جميع أنحاء جسم شقائق النعمان في البحر. هذه الخاصية تنطوي على تحديات لأنه يجب تحليل الخلايا والكيس الخيطي لإطلاق مكونات السم مع جزيئات أخرى غير سامة. لذلك ، أولا ، يتم اشتقاق السم من مستخلص خام (خليط من جزيئات مختلفة ومتنوعة وحطام الأنسجة). الخطوة التالية هي الكشف عن الببتيدات المتعددة ذات الأنشطة الحيوية المحددة. هنا ، نصف استراتيجية فعالة للحصول على مستخلص خام شقائق النعمان البحرية والفحص الحيوي لتحديد وجود السيتوليسين. تتضمن الخطوة الأولى تقنيات غير مكلفة ومباشرة (دورة التحريك والتجميد والذوبان) لإطلاق السيتوليسينات. حصلنا على أعلى نشاط تحلل الخلايا والبروتين (~ 500 ملغ من البروتين من 20 غرام من الوزن الجاف). بعد ذلك ، تم تحليل تعقيد الببتيد المتعدد للمستخلص بواسطة SDS-PAGE gel للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 kDa و 250 kDa. في فحص الانحلال ، استخدمنا خلايا الدم الحمراء للأغنام وحددنا HU50 (11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل). في المقابل ، تم تحديد وجود الفوسفوليباز في المستخلص الخام باستخدام صفار البيض كركيزة في وسط صلب مع الأغاروز. بشكل عام ، تستخدم هذه الدراسة بروتوكولا فعالا وغير مكلف لإعداد المستخلص الخام وتطبق مقايسات حيوية قابلة للتكرار لتحديد السيتوليسين ، والجزيئات ذات الاهتمامات التكنولوجية الحيوية والطبية الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحيوانات البحرية هي مصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا. في العقود الأخيرة ، اجتذب تكوين سم شقائق النعمان البحرية اهتماما علميا لأنه يضم مجموعة متنوعة من الببتيدات المتعددة مع الانحلالية ، السامة للخلايا ، الأنزيمية (الفوسفوليباز ، البروتياز ، الكيتيناز) ، والنشاط السام للأعصاب والتأثيرات المثبطة على النشاط البروتيني1. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الببتيدات المتعددة هي مصادر محتملة لتطوير الأدوات الجزيئية في التكنولوجيا الحيوية والاستخدام العلاجي 2,3.

هناك عدد قليل من التقارير حول سم شقائق النعمان البحرية ومكوناته الجزيئية بسبب تعقيد الحصول على السم ، وحتى العزل ، وتوصيف السموم. تضمنت طرق الاستخراج المستخدمة في التقارير التحلل وإفراغ محتويات الخلايا ذات الصلة وغير المرتبطة بإنتاج السم1.

ومن الخصائص الخاصة في جميع cnidarians عدم وجود نظام لإنتاج وإطلاق السم مركزي في منطقة تشريحية واحدة. بدلا من ذلك ، فإن الأكياس الخيطية هي هياكل تحافظ على السم 4,5. أنواع أخرى من الخلايا ، تسمى خلايا غدة البشرة ، تفرز أيضا السموم ويتم توزيعها أيضا في جميع أنحاء الجسم من شقائق النعمان البحرية6.

التحدي الأول والأكثر أهمية في الحصول على السم هو توليد مستخلص مع التلاعب الكافي في العمليات اللاحقة ، دون تعطيل أو تدهور البروتينات اللابيلية. بعد ذلك ، يجب تحليل الخلايا ، والمكونات - في هذه الحالة ، يجب استخراج الببتيدات المتعددة بكفاءة وسرعة ، وتجنب التحلل البروتيني والتحلل المائي مع القضاء على المكونات الخلوية الأخرى7.

تستخدم طرق مختلفة للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية. بعضها ينطوي على التضحية بالكائن الحي بينما يسمح البعض الآخر بإبقائه على قيد الحياة. تسمح الطرق التي تنطوي على استخدام جسم الكائن الحي بالكامل بإطلاق معظم السموم من السم8 ، مقارنة بالطرق التي تبقي الكائنات الحية على قيد الحياة ، والتي تستخرج فقط بعض مكونات السم9. يتطلب تحضير المستخلص تقييم وجود وفعالية مادة ذات أهمية من خلال فحص حيوي محدد ، والذي يتضمن استراتيجيات لمراقبة الآثار الدوائية عن طريق الطرق في الجسم الحي أو في المختبر 10.

يحتوي سم شقائق النعمان البحرية على بولي ببتيدات محللة للخلايا ، وسموم تشكل المسام (PFTs) 11 ، وفوسفوليباز12 ؛ هذه الجزيئات هي نماذج في دراسة التفاعل بين البروتين والدهون ، والأدوات الجزيئية في علاج السرطان ، وأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على المسام النانوية3. يتم تصنيف PFTs شقائق النعمان البحرية وفقا لحجمها أو وزنها الجزيئي ، من 5 kDa إلى 80 kDa. إن 20 kDa PFT ، الأكثر دراسة والمعروفة باسم الأكتينوبورين11 ، له أهمية خاصة لإمكاناته الطبية الحيوية في تطوير أدوات جزيئية للتطبيقات المحتملة مثل أجهزة الاستشعار الحيوية المضادة للسرطان ومضادات الميكروبات والمسام النانوية. وهناك سيتوليسين آخر، بما في ذلك الفوسفوليباز، وتحديدا الفوسفوليباز A2 (PLA2)13، يطلق حمضا دهنيا مستحقا ويتحلل الدهون الفوسفاتية، مما يزعزع استقرار غشاء الخلية. بسبب آلية العمل هذه ، يعد PLA2 بأن يكون نموذجا أساسيا للدراسة والتطبيقات في الأمراض الالتهابية. يمكن أن يكون بمثابة نموذج لدراسات سلوك الدهون في غشاء الخلية14.

هنا ، نصف بروتوكولا فعالا للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii Verrill ، 1869 ، والكشف عن الهيموليسين والفوسفوليباز. كلاهما سموم ذات صلة يمكن استخدامها كقالب لتصميم أدوات جزيئية جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع شقائق النعمان البحرية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الوطنية لتربية الأحياء المائية ومصايد الأسماك والأغذية التابعة للحكومة الفيدرالية للمكسيك (رقم التصريح PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا التابعة لمعهد التكنولوجيا الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك على جميع التجارب على شقائق النعمان البحرية. تم شراء عينة دم الأغنام من مركز التدريس العملي والبحوث في الإنتاج الحيواني وصحة الحيوان (CEPIPSA ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك).

1. جمع الكائنات الحية

  1. جمع شقائق النعمان البحرية A. dowii.
    ملاحظة: هنا، تم جمع الكائنات الحية خلال فترات المد المنخفض في منطقة المد والجزر قبالة ساحل إنسينادا باجا، كاليفورنيا، المكسيك (الشكل 1A، B).
  2. نقل الكائنات الحية إلى المختبر في حاويات بها مياه البحر (الشكل 1 ج).
  3. في المختبر ، قم بتنظيف الكائنات الحية بالماء المقطر باليد لإزالة جزيئات الركيزة الكبيرة الملتصقة بالجسم.
  4. قم بتجميد الكائنات الحية على الفور عند -80 درجة مئوية في الفريزر الفائق لمدة 72 ساعة.
  5. ضع الكائنات الحية في أكواب خاصة للتجفيف بالتجميد ، مع ظروف التجفيد من -20 درجة مئوية ، 0.015 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 48 ساعة.
  6. تخزين الكائنات الحية المجمدة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. ترطيب الأنسجة

  1. إعادة تشكيل 20 جم من الوزن الجاف للكائنات الحية المجففة بالتجميد مع 60 مل (1/3 واط / ف) من 50 مللي متر من العازل فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، وقرص كوكتيل مثبط واحد (جدول المواد).
  2. في التحريك المغناطيسي ، حرك العينة باستمرار عند ~ 800 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية ، لمدة 12 ساعة.

3. الافراج عن السموم

  1. للحث على تحلل الخلايا وتصريف الكيس الخيطي ، قم بتجميد العينة عند -20 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، ثم ضع الحاوية في الماء في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تذوب بنسبة تصل إلى 90٪. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
    ملاحظة: العينة لا تذوب بنسبة 100٪. من الأهمية بمكان الحفاظ على العينة عند ~ 4 درجات مئوية لمنع تدهور البروتين.
  2. راقب الكيسة الخيطية التي تم تفريغها تحت المجهر البؤري. خذ 10 ميكرولتر من العينة على شريحة وضع غطاء فوقها. راقب تحت المجهر البؤري عند تكبير 100x و 60x. هنا صبغة لم تكن ضرورية.
  3. معالجة الصور التي تم التقاطها في المجهر البؤري في برنامج ImageJ (الإصدار 1.53c، واين راسباندر، المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية، https://imagej.nih.gov/ij).
  4. إذا كان النبيب داخل الكيسة الخيطية غير لفائف وكان في الخارج ، يتم تفريغ الأكياس الخيطية. ثم تابع الخطوة التالية. خلاف ذلك ، قم بإجراء دورة تجميد ذوبان مرة واحدة فقط.
  5. لتوضيح المستخلص ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 25400 × g لمدة 40 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، واستعاد السوبرنات ، وقم بطرده المركزي مرة أخرى. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات.
  6. استعادة supernatant والتخلص من الكرية. يحتوي المستخلص الفائق أو الخام على مكونات السم (السموم) وجزيئات الخلايا الأخرى ، مثل الدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية.

4. كمية البروتين الكلي

  1. تحديد تركيز البروتين من المستخلص الخام باستخدام مجموعة مقايسة برادفورد اللونية التجارية15 (جدول المواد).
  2. تمييع كاشف الصبغة (جزء واحد من الصبغة مع أربعة أجزاء من الماء المقطر).
  3. تحضير محلول زلال مصل البقر (BSA) Fraction V (جدول المواد) بتركيز 1 مجم / مل في المخزن المؤقت للفوسفات (50 mM فوسفات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5).
  4. قم بإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1 في ثلاثة أضعاف.
  5. امزج بقوة كل محلول في شاكر لمدة 4 ثوان.
  6. احتضان العينات لمدة 5 دقائق في RT ، دون اهتزاز.
  7. قياس الامتصاص (AU) عند 595 نانومتر.
  8. ارسم متوسطات امتصاص BSA للعينة (AU مقابل تركيز البروتين)، وأوجد معادلة الرسم البياني (المعادلة 1).
    figure-protocol-1     المعادلة 1
    حيث y هو الامتصاص ، m هو ميل الخط ، x هو تركيز البروتين ، و b هو اعتراض y. لحساب تركيز مستخلص النفط الخام، حل ل x على النحو التالي:
    figure-protocol-2     المعادلة 2

5. تحديد تعقيد سم الببتيد المتعدد

  1. قم بتجميع الحاوية الزجاجية للرحلان الكهربائي الهلامي العمودي وفقا للدليل.
  2. تحضير مزيج الأكريلاميد (30 ٪): 29.2 غرام من الأكريلاميد ، 0.8 غرام من ثنائي الأكريلاميد ، الحجم النهائي من 100 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام غشاء 0.45 ميكرومتر. تخزين الحل في زجاجة مظلمة في 4 درجة مئوية. ثم ، قم بإعداد الخليط لهلام الحل (الجدول 2).
  3. يتكون جل SDS-PAGE من هلام حل وهلام تكديس. تحضير المواد الهلامية وفقا لأحجام المحلول المحددة في الجدول 2. أثناء التحضير ، تأكد من الحفاظ على كل مزيج عند 4 درجات مئوية لتقليل وقت البلمرة.
    ملاحظة: يختلف حجم كل خليط تبعا للعلامة التجارية للمعدات المستخدمة؛ لهذا البروتوكول ، تتوافق الأحجام مع إعداد هلام أكريلاميد بنسبة 15٪ ، بسماكة 0.75 مم ، لغرفة الرحلان الكهربائي الرأسي (جدول المواد).
  4. بعد أن يتبلمر الأكريلاميد ، ~ 10 دقائق ، أضف خليط هلام التراص.
  5. تحضير الخليط لهلام التراص ، وإضافته على الفور إلى الألواح الزجاجية ، ووضع مشط لتشكيل الآبار لتحميل العينات.
  6. بمجرد أن يتبلمر هلام التراص (~ 15 دقيقة) ، قم بإزالة المشط ووضع الحاوية الزجاجية في غرفة للرحلان الكهربائي الرأسي.
  7. ضع 200 مل من المخزن المؤقت للقطب الكهربائي (0.25 M Tris ، 0.192 M glycine ، 0.1٪ SDS) في غرفة الرحلان الكهربائي.
  8. تحليل المستخلص الخام: امزج 30 ميكروغرام من المستخلص الخام مع 5 ميكرولتر من مخزن البروتين العازل لتحميل البروتين (25٪ جلسرين ، 15٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 25٪ 2-ميركابتوإيثانول ، 0.125 mM Tris pH 7 ، بروموفينول أزرق 0.1 مجم / مل) لتشويه البروتينات. يجب أن يكون الحجم النهائي <50 ميكرولتر.
  9. سخن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وبارد، وجهاز طرد مركزي لمدة 3 ثوان عند 1400 × جم.
  10. قم بتحميل العينات في آبار هلام التراص. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي القياسي.
  11. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 25 مللي أمبير ثابت لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة.
  12. قم بإزالة الحاويات الزجاجية من غرفة الرحلان الكهربائي للمضي قدما في تلطيخ بروتينات الهلام.

6. تلطيخ البروتين

  1. شطف الجل في 50 مل من الماء المقطر لإزالة الحطام من القطب العازل.
  2. تخلص من الماء.
  3. لتجنب انتشار بروتينات الجل ، أضف محلول التثبيت (60 مل من الإيثانول ، و 20 مل من حمض الخليك ، و 20 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 100 مل). احتضن في RT لمدة 40 دقيقة مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. صب الحل.
  4. أضف محلول الربط المتقاطع للبروتين (15 مل من الإيثانول ، 0.25 مل من الجلوتارالدهيد ، 50 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 65.25 مل) ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في RT مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. قم بإزالة الحل.
  5. اغسل الجل ب 100 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة الماء. كرر هذا الإجراء أربع مرات.
  6. قم بإجراء تلطيخ البروتين باستخدام 50 مل من محلول Coomassie الأزرق اللامع R-250 المصفى (40٪ ميثانول ، 10٪ حمض الخليك ، 50٪ ماء مقطر ، صبغة 0.1٪ ، الحجم النهائي 100 مل) ، مع التحريك عند 60 دورة في الدقيقة في مذبذب دوار مختبري في RT لمدة 15 دقيقة.
  7. استعادة الحل ، والتي يمكن استخدامها لتلطيخ المواد الهلامية الأخرى.
  8. للقضاء على الصبغة الزائدة ، أضف محلول إزالة البقع (40 مل من الميثانول ، 10 مل من حمض الخليك ، 50 مل من الماء المقطر). استمر في التحريك (80 دورة في الدقيقة) في RT حتى تتصور الأشرطة (البروتينات الملطخة).
  9. احتفظ بالجل في 50 مل من الماء المقطر وامسح الصورة ضوئيا في نظام توثيق Gel.

7. تحضير محلول خلايا الدم الحمراء

  1. استخراج 1 مل من الدم من الوريد الوداجي للأغنام.
  2. قم بإزالة الإبرة من المحقنة وقم بتصريف الدم على الفور في أنبوب يحتوي على 50 مل من محلول Alsever (0.002 M حمض الستريك ، 0.07 M NaCl ، 0.1 M سكر العنب ، و 0.027 M سترات الصوديوم كمضاد للتخثر ، درجة الحموضة 7.4).
  3. عكس الحل ببطء ثلاث مرات.
  4. يحفظ في 4 درجات مئوية لنقله إلى المختبر.
  5. جهاز طرد مركزي عند 804 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
  6. أعد تعليق الكريات في 30 مل من محلول Alsever. أضف المحلول عن طريق تحريكه على طول الجدران الداخلية للأنبوب ، وباستخدام ماصة بلاستيكية باستور ، أعد تعليق الخلايا ببطء. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 804 × g لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. كرر هذا الإجراء حتى يتم توضيح supernatant.
  7. أضف 15 مل من محلول Alsever ؛ أعد تعليق الكريات ببطء باستخدام ماصة بلاستيكية باستور.
  8. الحفاظ على الحجم النهائي لمحلول Alsever لتحقيق تركيز 2 × 106 خلايا / مل ، تقريبا. ثم استخدم غرفة نيوباور أو مقياس الدم لحساب الخلايا.
    ملاحظة: عد كريات الدم الحمراء في شريحة مقياس الدم (Neubauer المحسن). الشريحة عبارة عن شريحة 30 مم × 70 مم × 4 مم. يحتوي المركز على لوحين فضيين (الشكل 2A) (شبكة علوية واحدة وشبكة سفلية) ، كل منهما 3 مم × 3 مم ، وقناتين على جانبي الشبكة. توجد خلايا العد في مربعات الزاوية والوسط (المربعات الحمراء في الشكل 2B). يجب أن يكون التركيز الأمثل للخلايا للعد في ترتيب 106 خلايا. تبلغ مساحة الصندوق المركزي 0.1 سم2 ، وهو ما يعادل 0.0001 مل.
  9. ضع غطاء فوق الشريحة.
  10. ضع 10 ميكرولتر من العينة بين الشريحة والغطاء وانتظر حتى يتم صرف العينة.
  11. في المجهر الضوئي (التكبير 60x)، قم بإجراء العد في المربع المربع الأول. عد فقط الخلايا الموجودة في الشبكة المركزية وتلك التي تلمس الهامش العلوي أو الأيسر للمربع.
  12. أوجد تركيز الخلية باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-3المعادلة 3
    إذا كانت العينة مركزة للغاية وكان التخفيف مطلوبا ، فاستخدم المعادلة التالية:
    figure-protocol-4المعادلة 4
    ملاحظة: عند أخذ محلول كريات الدم الحمراء لاختبار انحلال الدم ، قم بتجانس المحلول ببطء باستخدام ماصة باستور البلاستيكية.
  13. نفذ الخطوات في ثلاثة أضعاف لتقليل الخطأ.

8. فحص انحلال الدم

  1. تحضير مخاليط الحل (في ثلاثة أضعاف) المشار إليها في الجدول 3 في لوحات مخروطية 96 بئرا.
    ملاحظة: اخلطي كريات الدم الحمراء ببطء للحفاظ على تعليق متجانس.
  2. احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، دون أن تهتز.
  3. جهاز طرد مركزي في لوحة في 804 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. استرجع السوبرناتانت في طبق آخر من 96 بئرا بقاع مسطح.
  5. إذا كان المستخلص الخام يحتوي على السيتوليسين ، فإن كريات الدم الحمراء سوف تتحلل وتطلق الهيموغلوبين. اقرأ الامتصاص عند 415 نانومتر.
  6. احسب النسبة المئوية لانحلال الدم، باستخدام المعادلة التالية:
    ٪ انحلال الدم = ((المخزن المؤقت للمستخلص الخام-AAlsever) / (AH2O-AAlsever)) × 100
    ملاحظة: المستخلص الخام ، المخزن المؤقت AAlsever ، و AH2O يتوافق مع امتصاص كريات الدم الحمراء مع المستخلص الخام ، وامتصاص محلول Alsever ، وامتصاص الماء المقطر ، على التوالي.
  7. قم بإجراء اختبار انحلال الدم قبل وبعد كل دورة تجميد وذوبان مع 50 ميكروغرام من البروتين الكلي من المستخلص الخام.
  8. تحديد عدد دورات التجميد والذوبان المطلوبة للوصول إلى نشاط انحلالي 100٪.
  9. حساب كمية المستخلص الذي ينتج انحلال الدم في 50 ٪ من كريات الدم الحمراء (HU50) ؛ اتبع نفس البروتوكول الموصوف في الجدول 3 ، وقم بزيادة كمية مستخلص شقائق النعمان البحرية الخام ، وصمم المخطط باستخدام تعديلات سيجمية باستخدام برنامج مناسب (على سبيل المثال ، الأصل ، جدول المواد).

9. فحص الفوسفوليباز

  1. اغسل بيضة دجاج واحدة مع 1٪ SDS في الماء المقطر.
  2. افصل صفار البيض عن بياض البيض في ظل ظروف معقمة.
  3. قم بإعداد 50 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.86٪ ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. ثم ، قم بإعداد المحلول A: أضف 12 مل من صفار البيض و 36 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.86٪.
  4. تحضير الحل B: مزيج 300 ملغ من الأغاروز في 50 مل من المخزن المؤقت (50 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.5) ، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. سخني المحلول في الميكروويف حتى الغليان. تبرد في الماء الدافئ لتصل إلى 43-45 درجة مئوية.
  5. تحضير الحل C: تحضير 10 mM CaCl2 وتصفيته بمرشح 0.22 ميكرومتر.
  6. تحضير الحل D: 10 ملغ من الرودامين 6G في 1 مل من الماء المقطر.
  7. في ظل الظروف المعقمة (غطاء التدفق الرقائقي) ، أضف 500 ميكرولتر من المحاليل A و C إلى المحلول B و 100 ميكرولتر من المحلول D ، واخلط ، صب 25 مل في كل طبق بتري (90 × 15 مم).
  8. انتظر حتى يتصلب المحلول تحت ظروف معقمة (30 دقيقة).
  9. اصنع آبارا (قطرها ~ 2-3 مم) بأنبوب رفيع.
  10. أضف ما مجموعه 20 ميكرولتر من الفوسفات العازل (التحكم السلبي) في بئر واحد و 20 ميكرولتر من الفوسفوليباز المحدد (التحكم الإيجابي) في بئر آخر.
  11. ضع كميات مختلفة من بروتين المستخلص الخام ، 5 ، 15 ، 25 ، 35 ، 45 ميكروغرام ، في الآبار المتبقية ، كل منها في حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر.
  12. انتظر حتى يمتص الأجار جميع العينات (30 دقيقة).
  13. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
  14. إذا تشكلت هالة حول البئر ، فهذا يشير إلى نشاط الفوسفوليباز. قياس الهالة التي تشكلت مع الفرجار vernier.
    ملاحظة: قم بإجراء التجربة في ثلاث خطوات (خطوات من 9.1-9.14).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت النتائج التمثيلية للبروتوكول المستخدم للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية أن الجمع بين تقنيتين (الإثارة ودورات التجميد والذوبان) أدى إلى تصريف فعال للأكياس الخيطية، وكانت الكمية الإجمالية للبروتين 500 ملغ (8 ملغم/مل) (الشكل 3).

يمكن ملاحظة تعقيد البروتين في المستخلص الخام من 10 كيلو دال وأكبر من 250 كيلو دالتون من خلال الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن cytolysins في منطقة الوزن الجزيئي من 15 kDa و 20 kDa ، وهي مجموعة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى ارتفاع الطلب على المركبات الجديدة ذات التطبيقات في مختلف مجالات العلوم والصناعة إلى دراسة السم. يمثل السم مصدرا غنيا بالجزيئات التي تعمل كقالب لتوليد أدوات جزيئية جديدة. ومع ذلك ، فإن تعقيد هذه السموم يتطلب تنفيذ والجمع بين الأساليب المختلفة للحصول عليها ودراستها.

هنا ، نعرض طريقة للحصول على وتحليل سم شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii ، Verrill 1869 ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف سم أنواع شقائق النعمان البحرية الأخرى بدءا من العينات المجففة بالتجميد ، ثم الاستخلاص الخام obt...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة منافسة فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) ، مع رقم منحة IT200819. يعترف المؤلفون لتوم موسلمان ، Rock Paper Editing ، LLC ، للتحقق من قواعد اللغة الإنجليزية لهذه المخطوطة ؛ والمساعدة التقنية المقدمة من سامانتا خيمينيز (CICESE، إنسينادا)، وخوان مانويل باربوسا كاستيلو (معهد العلوم الاجتماعية، بعثة الأمم المتحدة في أفغانستان). كما نشكر الدكتور أوغستو سيزار ليزارازو تشابارو (CEPIPSA) على حصوله على دم الأغنام. ونشكر بصفة خاصة الدكتور خوسيه سانيغر بيزا، من معهد المحاسبين القانونيين المعتمدين - بعثة الأمم المتحدة لتقديم المساعدة إلى أفغانستان، على التسهيلات التي وفرها في مختبره لتسجيل الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 15 ملكورنينج430766
2-بروموفينول أزرقسيجماB75808
2-mercaptoetanolSigma-AldrichM6250-100ML
50 مل أنابيب طرد مركزي مخروطيةكورنينج430828
حمض الخليك الجليديJT Baker9515-03
أكريلاميدPromegaV3115
AgarosePromegaV3125
BisacrylamidePromegaV3143
الأبقار الألبومين الكسر VSigmaA3059-100G
برادفورد البروتين فحوصاتBio-Rad5000006
كلوريد الكالسيومSigma-AldrichC3306
لوحات زراعة الخلايا 96 جيدا، V-bottomCorning3894
أجهزة الطرد المركزيEppendorf5804R
أنابيب الطرد المركزيCorningCLS430829
ChemiDoc MP نظامBio-Rad1708280
حامض الستريكSigma-Aldrich251275
Clear flat.bottom 96-WellPlates Thermo Scientific3855
Coomassie Brilliant Blue G-250Bio-Rad# 1610406
Coomassie أزرق لامع R-250Bio-Rad1610400
سكر العنبJT Baker1916-01
ضميمة بدون مجاريالهواء Labconcoعموديةhttps://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
جل دوك EZBio Rad.نظام توثيق الجل
GlycerolSigma-AldrichG5516-4L
مقياس الدمMarienfeld650030
ImageJ (البرنامج) المعاهدالوطنية للصحة ، الولايات المتحدةالأمريكية الإصدار 1.53c
حاضنة 211LabnetI5211 DS
ميثانولJT Baker9049-03
خليةرباعية بروتينية صغيرةBio-Rad1658000EDU
Na2HPO4JT Baker3824-01
NaClJT Baker3624-01
NaH2PO4. H2< / sub>OJT Baker3818-05
برنامجOrigin 9لتصميم المؤامرة بتعديلات سيني
PetridishFalcon 351007
Pipetman kitGilsonF167380
صغير مسبقة الصبBioRad1658004
البروتين PrestainedThermo Scientific26620
مثبط البروتيازروش11836153001
مركز كاشف صبغة فحص البروتينBio-Rad5000006
الرودامين 6Gسيجما ألدريتش252433
SDSسيجما ألدريتشL4509
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتجي تي بيكر3646-01
مقياس الطيف الضوئيTHERMO SCIENTIFICG10S UV-VIS
تريس بيسسيجما-ألدريتش77-86-1
فولت مزود الطاقةHoeferPS300B
مصل إصدار جل سلم كوكتيل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539(2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897(2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418(2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة