يوفر التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات وصولا غير مدمر وخالي من الملصقات إلى ديناميكيات ps-ns للبروتينات ومياه ترطيبها. يتم تقديم سير العمل مع دراستين حول بروتينات الأميلويد: حول ديناميكيات الليزوزيم التي تم حلها زمنيا أثناء التجميع وعلى ديناميكيات الماء المائية لتاو عند تكوين الألياف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر تشتت النيوترونات إمكانية سبر الديناميكيات داخل العينات لمجموعة واسعة من الطاقات بطريقة غير مدمرة وبدون تسمية بخلاف الديوتيريوم. على وجه الخصوص ، يسجل التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات إشارات التشتت بزوايا تشتت متعددة في وقت واحد وهو مناسب تماما لدراسة ديناميكيات الأنظمة البيولوجية على مقياس ps-ns الزمني. من خلال استخدام D2O - وربما مكونات عازلة متوقفة - تسمح الطريقة بمراقبة كل من انتشار مركز الكتلة وحركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية (الديناميات الداخلية) للبروتينات في الحالة السائلة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات مياه الترطيب عن طريق استخدام مساحيق من البروتينات المثبطة المرطبة ب H2O. تقدم هذه الورقة سير العمل المستخدم على الأداة IN16B في معهد Laue-Langevin (ILL) للتحقيق في ديناميكيات البروتين والماء المائي. يتم شرح تحضير عينات المحلول وعينات مسحوق البروتين المائي باستخدام تبادل البخار. يتم وصف إجراء تحليل البيانات لكل من ديناميات البروتين والماء الإماهة لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات (الأطياف شبه المرنة أو عمليات المسح ذات النافذة الثابتة) التي يمكن الحصول عليها على مطياف التشتت العكسي للنيوترونات.
يتم توضيح الطريقة من خلال دراستين تتضمنان بروتينات الأميلويد. يظهر أن تجميع الليزوزيم إلى مجاميع كروية بحجم ميكرومتر - يشار إليها بالجسيمات - يحدث في عملية من خطوة واحدة على النطاق المكاني والزمني الذي تم فحصه في IN16B ، بينما تظل الديناميكيات الداخلية دون تغيير. علاوة على ذلك ، تمت دراسة ديناميات ماء الترطيب في تاو على مساحيق رطبة من البروتين perdeuteated. يتبين أن الحركات الانتقالية للماء يتم تنشيطها عند تكوين ألياف الأميلويد. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول كيفية وضع تشتت النيوترونات فيما يتعلق بدراسة الديناميات فيما يتعلق بالطرق الفيزيائية الحيوية التجريبية الأخرى.
المقدمة
النيوترون هو جسيم ضخم بدون شحنة تم استخدامه بنجاح على مر السنين لفحص العينات في مختلف المجالات من الفيزياء الأساسية إلى علم الأحياء1. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يتم استخدام تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة ، وتشتت النيوترونات غير المرن ، وعلم البلورات النيوتروني وقياس الانعكاس على نطاق واسع2،3،4. يوفر تشتت النيوترونات غير المرن قياسا متوسطا للديناميكيات دون الحاجة إلى وضع علامات محددة في حد ذاتها ، وجودة إشارة لا تعتمد على الحجم أو البروتين5. يمكن إجراء القياس باستخدام بيئة معقدة للغاية للبروتين قيد الدراسة الذي يحاكي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المخزن المؤقت deuterated للبروتينات في الحالة السائلة
- حل جميع مكونات المخزن المؤقت في D2O النقي.
- إذا تمت معايرة قطب الأس الهيدروجيني في H2O ، فاضبط pD وفقا للصيغة pD = pH + 0.4 باستخدام NaOD أو DCl34.
ملاحظة: قد يؤثر استخدام D 2O بدلا من H2O على قابلية ذوبان البروتين وقد تحتاج الظروف العازلة إلى التكيف (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير طفيف في تركيز الملح).
2. تحضير مساحيق H2O المائية من البروتين perdeuterated
- تحضير حامل العينة.
- قم بتنظيف حامل عينة الألمنيوم المسطح تماما باستخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء تجميع الليزوزيم في الجسيمات عند 90 درجة مئوية بتركيز بروتين 50 مجم / مل في مخزن مؤقت مقسم (0.1 M NaCl عند pD 10.5). يتم تشغيل تكوين الجسيمات من خلال زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية ويحدث في غضون 6 ساعات (الشكل التكميلي S8). تم الحصول على البيانات على IN16B ، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه (يتم تنسيق البيانات بشكل دائم بواسطة ILL ويمكن الوصول إليها في http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
تم الحصول على طيف QENS عند 7 درجات مئوية لتوصيف الحالة الأولية بشكل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التحليل الطيفي النيوتروني هو الطريقة الوحيدة التي تسمح بفحص ديناميكيات ps-ns ذات المتوسط الجماعي لعينات البروتين بغض النظر عن حجم البروتين أو تعقيد المحلول عند استخدام deuteration6. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في الانتشار الذاتي لمجموعات البروتين في المحلول ، يمكن تحديد الحجم الهيدروديناميكي لهذه التجميعات بشكل لا لبس فيه. ومع ذلك ، فإن الطريقة محدودة عادة بسبب التدفق النيوتروني المنخفض ، مما يعني أوقات اكتساب طويلة ومتطلبات كميات عالية من العينة (عادة 100 ملغ من البروتين) للحصول على نسبة إش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لميكايلا زامبوني من مركز يوليش لعلوم النيوترون في هاينز ماير لايبنيتز سنتروم ، جارشينج ، ألمانيا ، لجزء من تجارب تشتت النيوترونات التي أجريت على أداة SPHERES. وقد استفاد هذا العمل من أنشطة اتحاد مختبرات Deuteration (DLAB) الذي يموله الاتحاد الأوروبي بموجب العقدين HPRI-2001-50065 و RII3-CT-2003-505925 ، ومن النشاط الممول من مجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية في المملكة المتحدة (EPSRC) داخل معهد Laue Langevin EMBL DLAB بموجب المنح GR / R99393/01 و EP / C015452 / 1. الدعم المقدم من المفوضية الأوروبية في إطار البرنامج الإطاري السابع من خلال الإجراء الرئيسي: تعزيز منطقة البحوث الأوروبية ، يتم الاعتراف بالبنى التحتية البحثية [العقد 226507 (NMI3....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عينة الألومنيوم | غير متوفر تجاريا. إما أن توفر جهة الاتصال المحلية على الأداة أو يمكن تصنيعها بناء على رسم فني يمكن توفيره من قبل جهة الاتصال المحلية. | ||
| كلوريد الديوتيريوم، 35 بالوزن في D2O، > 99 ذرة ٪ D | سيجما ألدريتش | < br / > 543047 | |
| أكسيد الديوتيريوم (د ، 99.9٪) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning شحم السيليكون عالي الفراغ | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| الإيثانول 96٪ ، EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| مجفف زجاج | VWR | 75871-660 | |
| لوحة مجفف زجاج ، 140 مم | VWR | 89038-068 | |
| سلك إنديوم ، 1.0 مم (0.04 بوصة) ضياء ، Puratronic ، 99.999٪ | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| ليزوزيم من بياض بيض الدجاج المحالة ، المجفف بالتجميد ، مسحوق ، ~ 100،000 U / mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | انظر github.com/kpounot/nPDyn ، وظائف النموذج لتركيب المدرجة أيضا في برنامج | |
| توازن OHAUS AX324 Adventurer ، المعايرة الداخلية | Dutscher | 92641 | |
| خامس أكسيد الفوسفور ، ReagentPlus ، 99٪ | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipette ErgoOne 0.5-10 & mu ؛ L | Starlab | S7100-0510 | |
| ماصة ErgoOne 100-1,000 & L | Starlab | S7100-1000 | |
| ماصة ErgoOne 20-200 & L | Starlab | S7100-2200 | |
| طرف الماصة TipOne 1,000 & L | Starlab | S1111-6001 | |
| طرف الماصة TipOne 10 & mu ؛ L | Starlab | S1111-3200 | |
| طرف ماصة TipOne 200 & mu ؛ L | Starlab | S1111-0206 | |
| محلول ديوتريوكسيد الصوديوم ، 40 بالوزن ٪ في D2< / sub>O ، 99.5 ذرة ٪ D | سيجما ألدريتش | 372072 |
المراجع
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
