نقدم بروتوكولا لتطوير الثقافات العضوية الظهارية بدءا من الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وتلخص الخلايا الجذعية الظهارية للسن ، بما في ذلك قدرتها على تمايز الأرومة المينيلولوجية. يوفر النموذج العضوي الفريد أداة واعدة لدراسة بيولوجيا الأسنان البشرية (الخلايا الجذعية) مع وجهات نظر لنهج تجديد الأسنان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء المواد العضوية من الأسنان البشرية كأداة قوية نحو البحث الميكانيكي والعلاج التجديدي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأسنان ذات أهمية رئيسية في الحياة ليس فقط للمضغ الغذائي والكلام ولكن أيضا للرفاهية النفسية. المعرفة حول تطور الأسنان البشرية والبيولوجيا نادرة. على وجه الخصوص ، لا يعرف الكثير عن الخلايا الجذعية الظهارية للسن ووظيفتها. نجحنا في تطوير نموذج عضوي جديد يبدأ من أنسجة الأسنان البشرية (أي جريب الأسنان ، المعزول عن أسنان العقل المستخرجة). المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وعلى المدى الطويل وتلخص حجرة الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية المقترحة من حيث التعبير عن العلامة وكذلك النشاط الوظيفي. على وجه الخصوص ، فإن المواد العضوية قادرة على الكشف عن عملية تمايز الأرومة النخلية كما تحدث في الجسم الحي أثناء تكوين الأميلوجينيا. سيوفر هذا النموذج العضوي الفريد أداة قوية لدراسة ليس فقط تطور الأسنان البشرية ولكن أيضا أمراض الأسنان ، وقد يمهد الطريق نحو العلاج التجديدي للأسنان. يمكن أن يكون استبدال الأسنان المفقودة بسن بيولوجي يعتمد على هذا النموذج العضوي الجديد بديلا جذابا للزرع القياسي الحالي للمواد الاصطناعية.
المقدمة
الأسنان لها أدوار أساسية في المضغ الغذائي والكلام والرفاهية النفسية (الصورة الذاتية). يتكون السن البشري من أنسجة معدنية عالية الكثافة والصلابة متفاوتة1. مينا الأسنان ، المكون الرئيسي لتاج الأسنان ، هو أعلى الأنسجة المعدنية في جسم الإنسان. أثناء تكوين المينا (تكوين المينا) ، عندما تتطور الأسنان ، تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان (DESCs) إلى خلايا مكونة للمينا (الخلايا المينائية). بمجرد تشكيله ، نادرا ما يتم إصلاح المينا أو تجديدها بسبب فقدان الاستماتة للخلايا النخلية في بداية ثوران الأسنان1. يتم حاليا استعادة أنسجة المينا التالفة ، كما هو ناجم عن الصدمة أو الأمراض البكتيرية ، باستخدام مواد اصطناعية ؛ ومع ذلك ، فإن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات للأبحاث UZ / KU Leuven (13/0104U). تم الحصول على الأضراس الثالثة المستخرجة (ضرس العقل) بعد موافقة المرضى المستنيرة.
1. التحضيرات
- قم بتسخين صفيحة استزراع 48 بئرا لمدة 15-20 ساعة في حاضنة CO2 بنسبة 1.9٪ عند 37 درجة مئوية.
- تسييل Matrigel aliquot (انخفاض عامل النمو ؛ خالية من الفينول الأحمر ؛ يشار إليها أيضا باسم مصفوفة الغشاء السفلي. BMM) على الجليد (4 درجات مئوية) لمدة لا تقل عن ساعتين قبل الخطوة 2.1.
ملاحظة: تجنب دورات التجميد/الذوبان في BMM. تسييل BMM لمدة 15-20 ساعة على الجليد و aliquot في 1 مل في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تطور الأسنان العضوية
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء ثقافات عضوية من أنسجة DF البشرية المكتسبة بعد استخراج ضرس العقل (الشكل 1A). يتم فصل DF المعزول إنزيميا وميكانيكيا. يتم استزراع الخلايا التي تم الحصول عليها داخل BMM في الوسائط التي تم تعريفها تجريبيا من أجل التطور والنمو العضوي الأمثل (وسط عضوي للأسنان; توم)19.
عادة ما تتطور المواد العضوية في غضون 2 أسابيع بعد بذر خلايا DF (P0; الشكل 2 ألف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول الجيل الفعال والقابل للتكرار من المواد العضوية بدءا من الأسنان البشرية. على حد علمنا ، هذه هي المنهجية الأولى لإنشاء العضوية ذات المفهوم الحالي (الظهارية) بدءا من أنسجة الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل وتعرض النمط الظاهري الظاهري للجذع الظهاري للأسنان ، مما يكرر DESCs التي تم الإبلاغ عنها سابقا في حجرة ERM في DF7. علاوة على ذلك ، تقوم المواد العضوية بتكرار خصائص DESC / ERM الوظيفية ، بما في ذلك الكشف عن عملية تمايز الأرومة النمائية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يضمن المؤلف المقابل أن جميع المؤلفين قد كشفوا عن أي وجميع تضارب المصالح.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لجميع موظفي جراحة الفم والوجه والفكين (MKA) في UZ Leuven ، وكذلك المرضى ، لمساعدتهم التي لا تقدر بثمن في جمع الأضراس الثالثة المستخرجة حديثا. نود أيضا أن نشكر الدكتورة رينهيلد جاكوبس والدكتورة إليزابيث تيجسكينز على مساعدتهما في جمع العينات. تم دعم هذا العمل من خلال منح من KU Leuven (BOF) و FWO-Flanders (G061819N). L.H. هو زميل دكتوراه FWO (1S84718N).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| ألواح قاع مسطحة 48 بئر | Corning | 3548 | |
| 50 مل أنبوب الطرد | المركزي Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| ألبومين بقري (درجة زراعة الخلايا) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX الجسم المضاد | سانتا كروز | sc-365284 | |
| أمفوتريسين ب | جيبكو | 15200018 | |
| B27 (بدون فيتامين أ) | جيبكو | 12587-010 | |
| كاسيت | VWR | 7202191 | |
| كاتالاز من كبد البقر | سيجما ألدريتش | C100 | |
| CD44 الجسم المضاد | Abcam | ab34485 | |
| مصفاة الخلايا ، 40 & micro ؛ m | Falcon | 352340 | |
| الكوليرا | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| حمض الستريك | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 الجسم المضاد | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| غطاء زجاجي | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما ألدريتش | D2650 | |
| Dispase II | سيجما ألدريتش | D4693 | |
| DMEM 1: 1 F12 بدون Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| مسحوق DMEM عالي الجلوكوز | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| مصل الحمار | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| محطة عمل التضمين ، 220 إلى 240 فولت تيار متردد | ثيرمو فيشر العلمي | 12587976 | |
| الإيثانول المطلق ، & ge ؛ 99.8٪ (EtOH) فيشر | كيميكال | E / 0650DF / 15 | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | سيجما ألدريتش | F7524 | |
| FGF10 | بيبروتك | 100-26 | |
| FGF2 (= FGF أساسي) | R & D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | يتضمن 1٪ & بيتا ميركابتو إيثانول مذاب في عازلة التحلل |
| باستور ماصة | نيكو | آليات 170-40050 | |
| جلايسين | VWR | 101194M | |
| HEPES | سيجما ألدريتش | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (مثبط ROCK ، RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| الأنسولين من البنكرياس البقري | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 الأجسام المضادة | سيجما ألدريتش | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (عامل النمو المخفض ؛ خالي من الفينول باللون الأحمر) | شريحة مجهر 15505739 | ||
| Corning Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | ||
| Millex-GV وحدة تصفية حقنة ، 0.22 ؛ مو m | Millipore | SLGV033R | |
| الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي (α MEM) | سيجما ألدريتش | M4526 | |
| الماوس IgG (Alexa 555) الجسم المضاد الثانوي | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| نيكوتيناميد | سيجما ألدريتش | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| الجسم المضاد P63 | Abcam | ab124762 | |
| قلم عنق | الرحم Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | قلم الوسم |
| Paraformaldehyde (PFA) ، 16٪ | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| البنسلين الستربتومايسين (قلم / Strep)طبق | جيبكو | 15140-122 | |
| بتري | كورنينج | 353002 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | ماصة Gibco | 10010-015 | |
| (P20 ، P200 ، P1000) | Eppendorf أو غيرها | 2231300006 | |
| ماصة نقل البلاستيك (3.5 & nbsp ؛ مل) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) الجسم المضاد الثانوي | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| مشرط (شفرة جراحية) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R & D Systems | 464-SH-200 | |
| قوالب السيليكون (كتلة التسخين) | VWR | 720-1918 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) BDH | 102415K | ||
| كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3) | ميرك | 106329 | |
| الصوديوم بيروفات (C3< / sub>H3< / sub>NaO3< / sub>) | سيجما ألدريتش | P-5280 | |
| SOX2 الأجسام المضادة | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR | |
| System Stericup-GP ، 0.22 & micro ؛ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP وحدة تصفية علوية لأنبوب الطرد المركزي المعقم ، 0.22 & mu ؛ م | ميليبور | SCGP00525 | |
| معقم 1000 مو ؛ أطراف ماصة L مع فلتر | Greiner | 740288 | |
| معقم 20 مو ؛ أطراف ماصة L مع فلتر | Greiner | 774288 | |
| معقم 200 مو ؛ أطراف ماصة L مع وبدون مرشح | Greiner | 739288 | |
| معقم H2< / sub>O | Fresenius | B230531 | |
| ملح كبريتات الستربتومايسين | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III أول حبلا تخليق سوبرميكس | Invitrogen | 11752-050 | طقم النسخ العكسي |
| معالج الأنسجة | الحراري العلمي | 12505356 | |
| ترانسفيرين | سيرفا | 36760.01 | |
| تريتون X-100 | سيجما | T8787-50ML | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield تركيب متوسط + DAPI | Labconsult NV | H-1200 | وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| الزيلين ، 99٪ ، للكيمياء الحيوية والأنسجة | VWR | 2،89،75،325 |
المراجع
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
