يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء المواد العضوية من الأسنان البشرية كأداة قوية نحو البحث الميكانيكي والعلاج التجديدي

4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63671

⸱

أبريل 13, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven), 2Biomedical Research Institute (BIOMED), UHasselt, Hasselt University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا لتطوير الثقافات العضوية الظهارية بدءا من الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وتلخص الخلايا الجذعية الظهارية للسن ، بما في ذلك قدرتها على تمايز الأرومة المينيلولوجية. يوفر النموذج العضوي الفريد أداة واعدة لدراسة بيولوجيا الأسنان البشرية (الخلايا الجذعية) مع وجهات نظر لنهج تجديد الأسنان.

الملخص

الأسنان ذات أهمية رئيسية في الحياة ليس فقط للمضغ الغذائي والكلام ولكن أيضا للرفاهية النفسية. المعرفة حول تطور الأسنان البشرية والبيولوجيا نادرة. على وجه الخصوص ، لا يعرف الكثير عن الخلايا الجذعية الظهارية للسن ووظيفتها. نجحنا في تطوير نموذج عضوي جديد يبدأ من أنسجة الأسنان البشرية (أي جريب الأسنان ، المعزول عن أسنان العقل المستخرجة). المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وعلى المدى الطويل وتلخص حجرة الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية المقترحة من حيث التعبير عن العلامة وكذلك النشاط الوظيفي. على وجه الخصوص ، فإن المواد العضوية قادرة على الكشف عن عملية تمايز الأرومة النخلية كما تحدث في الجسم الحي أثناء تكوين الأميلوجينيا. سيوفر هذا النموذج العضوي الفريد أداة قوية لدراسة ليس فقط تطور الأسنان البشرية ولكن أيضا أمراض الأسنان ، وقد يمهد الطريق نحو العلاج التجديدي للأسنان. يمكن أن يكون استبدال الأسنان المفقودة بسن بيولوجي يعتمد على هذا النموذج العضوي الجديد بديلا جذابا للزرع القياسي الحالي للمواد الاصطناعية.

المقدمة

الأسنان لها أدوار أساسية في المضغ الغذائي والكلام والرفاهية النفسية (الصورة الذاتية). يتكون السن البشري من أنسجة معدنية عالية الكثافة والصلابة متفاوتة1. مينا الأسنان ، المكون الرئيسي لتاج الأسنان ، هو أعلى الأنسجة المعدنية في جسم الإنسان. أثناء تكوين المينا (تكوين المينا) ، عندما تتطور الأسنان ، تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان (DESCs) إلى خلايا مكونة للمينا (الخلايا المينائية). بمجرد تشكيله ، نادرا ما يتم إصلاح المينا أو تجديدها بسبب فقدان الاستماتة للخلايا النخلية في بداية ثوران الأسنان1. يتم حاليا استعادة أنسجة المينا التالفة ، كما هو ناجم عن الصدمة أو الأمراض البكتيرية ، باستخدام مواد اصطناعية ؛ ومع ذلك ، فإن هؤلاء منزعجون من أوجه القصور المهمة مثل التسرب الدقيق ، والتكامل العظمي السفلي والمرساة ، والعمر الافتراضي المحدود ، وعدم وجود إصلاح يعمل بكامل طاقته2. وبالتالي ، فإن وجود ثقافة قوية وموثوقة من DESCs البشرية مع القدرة على توليد الخلايا النخلية والقدرة على إنتاج الأنسجة المعدنية سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام في مجال تجديد الأسنان.

المعرفة حول النمط الظاهري البشري DESC والوظيفة البيولوجية نادرة3،4،5. ومن المثير للاهتمام ، تم اقتراح وجود DESCs من الأسنان البشرية في مساند الخلايا الظهارية في Malassez (ERM) ، وهي مجموعات الخلايا الموجودة داخل بصيلات الأسنان (DF) ، والتي تحيط بالأسنان غير المنفجرة ، وتظل موجودة في الرباط اللثوي حول الجذر بمجرد أن تندلع السن1. تم العثور على خلايا ERM المستزرعة بالاشتراك مع لب الأسنان للتمييز إلى خلايا تشبه الأرومة النخلية وتوليد أنسجة تشبه المينا6. ومع ذلك ، كانت الدراسات العميقة للدور المحدد لخلايا ERM في توليد المينا (إعادة) محدودة بسبب عدم وجود نماذج دراسة موثوقة7. يتم إعاقة أنظمة ERM الحالية في المختبر بسبب العمر الافتراضي المحدود والخسارة السريعة للنمط الظاهري في ظروف 2D المستخدمة بشكل قياسي 8,9,10,11,12. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى نظام قابل للسحب في المختبر لتوسيع ودراسة وتمييز DESCs البشرية بأمانة.

خلال العقد الماضي ، تم تطبيق تقنية قوية لزراعة الخلايا الجذعية الظهارية في المختبر بنجاح على عدة أنواع من الأنسجة الظهارية (البشرية) لدراسة بيولوجيتها وكذلك المرض13،14،15،16. تمكن هذه التقنية الخلايا الجذعية الظهارية للأنسجة من التطور الذاتي إلى إنشاءات خلايا 3D (أي عضويات) عند زرعها في مصفوفة خارج الخلية (ECM) - تحاكي السقالة (عادة ، Matrigel) وتزرع في وسط محدد يكرر إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة في الأنسجة و / أو تكوين الجنين. تشمل عوامل النمو النموذجية اللازمة لتطوير العضوية عامل نمو البشرة (EGF) ومنشطات موقع تكامل MMTV بدون أجنحة (WNT)14،15،16. تتميز المواد العضوية الناتجة عن ذلك بالإخلاص الدائم في محاكاة الخلايا الجذعية الظهارية الأصلية للأنسجة ، بالإضافة إلى قابلية عالية للتوسع مع الحفاظ على نمطها الظاهري وخصائصها الوظيفية ، وبالتالي التغلب على توافر الأنسجة البشرية الأولية المحدودة في كثير من الأحيان كما تم الحصول عليها من العيادة. لإنشاء المواد العضوية ، لا يلزم عزل الخلايا الجذعية الظهارية عن الأنسجة غير المتجانسة (أي التي تضم أنواعا أخرى من الخلايا مثل الخلايا الوسيطة) قبل الزراعة لأن الخلايا الوسيطة لا تلتصق ب ECM أو تزدهر فيه ، مما يؤدي في النهاية إلى عضويات ظهارية بحتة13،16،17،18،19 . وقد أدت هذه التكنولوجيا الواعدة ومتعددة الاستخدامات إلى تطوير نماذج عضوية متعددة من مختلف الأنسجة الظهارية البشرية. ومع ذلك ، فإن المواد العضوية المشتقة من الأسنان البشرية ، ذات القيمة للدراسة العميقة لتطور الأسنان وتجديدها ومرضها ، لم يتم إنشاؤها بعد20,21. لقد نجحنا مؤخرا في تطوير مثل هذا النموذج العضوي الجديد بدءا من أنسجة DF من الأضراس الثالثة (ضرس العقل) المستخرجة من المرضى المراهقين19.

هنا ، نصف بروتوكول تطوير الثقافات العضوية الظهارية من الأسنان البشرية البالغة (أي من DF للأضراس الثالثة) (الشكل 1A). تعبر المواد العضوية الناتجة عن علامات الجذع المرتبطة ب ERM بينما تكون قابلة للتوسع على المدى الطويل. ومن المثير للاهتمام ، على عكس معظم النماذج العضوية الأخرى ، أن EGF المطلوب عادة زائد عن الحاجة لتطوير ونمو عضوي قوي. ومن المثير للاهتمام ، أن المواد العضوية الجذعية تظهر خصائص تمايز الأرومة النمائية ، وبالتالي تحاكي ميزات وعمليات ERM / DESC التي تحدث في الجسم الحي. يسمح النموذج العضوي الجديد والفريد من نوعه الموصوف هنا باستكشاف بيولوجيا DESC واللدونة والقدرة على التمايز ويفتح الباب لاتخاذ الخطوات الأولى نحو نهج تجديد الأسنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات للأبحاث UZ / KU Leuven (13/0104U). تم الحصول على الأضراس الثالثة المستخرجة (ضرس العقل) بعد موافقة المرضى المستنيرة.

1. التحضيرات

  1. قم بتسخين صفيحة استزراع 48 بئرا لمدة 15-20 ساعة في حاضنة CO2 بنسبة 1.9٪ عند 37 درجة مئوية.
  2. تسييل Matrigel aliquot (انخفاض عامل النمو ؛ خالية من الفينول الأحمر ؛ يشار إليها أيضا باسم مصفوفة الغشاء السفلي. BMM) على الجليد (4 درجات مئوية) لمدة لا تقل عن ساعتين قبل الخطوة 2.1.
    ملاحظة: تجنب دورات التجميد/الذوبان في BMM. تسييل BMM لمدة 15-20 ساعة على الجليد و aliquot في 1 مل في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. تبريد جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد الوسائط وتصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تستند المجلدات التالية إلى جمع DFs من جميع الأضراس الأربعة الثالثة المستخرجة عادة في وقت واحد.
    1. تحضير 20 مل من وسط جمع DF (الجدول 1): الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي (αMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 0.5٪ أمفوتريسين B و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين. انقل 4 مل من وسط جمع DF إلى أنبوب 15 مل وانقل الأنابيب على الجليد.
      ملاحظة: أنبوب واحد سعة 15 مل يكفي لكل مريض لجمع العينات (أي لأربعة أضراس ثالثة).
    2. جعل 20 مل من وسط الأسنان العضوية (يشار إليها أيضا باسم TOM; الجدول 2) باستخدام وسيط محدد خال من المصل (SFDM; الجدول 3). تخزين TOM في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 أسابيع.
    3. تحضير 8 مل من وسط التفكك (الجدول 4) ، أي محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على الكولاجيناز السادس (3 ملغ / مل) و dispase II (4 ملغ / مل). قم بتسخين وسط التفكك مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الاستخدام وانقله إلى أنبوبين سعة 15 مل (4 مل لكل أنبوب) لفصل أربعة أنسجة DF.
    4. قم بإعداد صفيحة غسيل (12 بئرا) تحتوي على: ثلاثة آبار مع 70٪ EtOH ، وثلاثة آبار مع PBS ، وثلاثة آبار مع وسيط جمع DF.
    5. جعل 15 مل من المتوسط A لكل عينة (أي 5 مل لكل اثنين من DFs لكل مريض ؛ الجدول 5).
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة.

2. تفكك بصيلات الأسنان

  1. بمجرد جمع الأضراس الثالثة مع DFs المرتبطة بها في وسط التجميع (على الجليد) ، انقل محتوى الأنابيب إلى طبق بتري.
  2. امسك السن باستخدام ملاقط واعزل DF بعناية باستخدام شفرة جراحية.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة ممارسة. كن حذرا مع الشفرة.
  3. لغسل الدم المتبقي من DFs ، ضع أنسجة DF لفترة وجيزة في البئر الأول من 70٪ EtOH (لوحة الغسيل) لمدة 20 ثانية ، ثم انقلها إلى بئر EtOH التالي لمدة 20 ثانية ، ثم إلى بئر EtOH الثالث (بحد أقصى 1 دقيقة في 70٪ EtOH في المجموع ؛ سيؤدي وقت الحضانة الأطول إلى انخفاض صلاحية الخلية).
  4. بعد ذلك ، استمر في الشطف في آبار PBS الثلاثة (بحد أقصى 2 دقيقة في المجموع).
  5. شطف DFs في الآبار الثلاثة المتبقية لجمع DF (بحد أقصى 20 دقيقة في المجموع).
  6. انقل DFs المغسولة إلى طبق بتري جديد.
  7. قطع قطعة صغيرة من أحد DFs (~ 5 مم2) لتثبيت paraformaldehyde (PFA) (انظر القسم 7) وتخزينها على الجليد (لمدة أقصاها 6 ساعات) في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط جمع DF حتى تثبيت PFA.
  8. افرم بقية DFs في قطع صغيرة (~ 1 مم2).
    ملاحظة: ينصح بمعالجة أنسجة DF المعزولة حديثا على الفور للحصول على التكوين العضوي الأمثل وكفاءة النمو ، بدلا من البدء من الأنسجة المحفوظة بالتجميد ، مما يؤدي إلى انخفاض الكفاءة. ومع ذلك، من الممكن حفظ أنسجة DF الأولية بالتبريد في هذه الخطوة (انظر وسيط الحفظ بالتبريد والبروتوكول في القسم 5).
  9. انقل DFs المفروم إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط التفكك المسخن مسبقا واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: أضف اثنين من DFs لكل 4 مل من وسط التفكك المحمى مسبقا (أنبوب واحد) لضمان التفكك الأمثل.
  10. كل 15 دقيقة ، قم بخلط وسط تفكك DF صعودا وهبوطا باستخدام ماصة باستور الزجاجية لتسريع تفكك الأنسجة. عندما لا يتم ملاحظة قطع DF (عادة بعد 1 ساعة) ، تابع فصل DF باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار ضيقة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل انفصال للاتجاه المباشر، قم بالتبديل إلى ماصة باستور التي تم تضييقها عن طريق تلميع النار في موعد لا يتجاوز 1 ساعة من عزل DF.
    1. في غضون ذلك ، قم بإعداد 10 مل من الوسط A يحتوي على 50 ميكرولتر من DNase (0.2 ملغ / مل; الجدول 5).
  11. أضف 5 مل من الوسط A (الذي يحتوي على DNase) إلى كل أنبوب مع DF منفصل ، واحتضنه لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  12. قم بتصفية تعليق الخلية (الذي يحتوي على خلايا مفردة وكتل خلايا صغيرة) من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة الشظايا الكبيرة المتبقية و (معظم) الأنسجة الليفية.
    1. الجمع بين عدة أنابيب مع DF منفصلة من مريض واحد في هذه الخطوة.
  13. شطف الفلتر مع 1 مل من A. الطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة في 200 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 1 مل من SFDM (الجدول 3) ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
  15. احسب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية آلي. إهمال كتل الخلايا المتبقية.
  16. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

3. إنشاء ثقافة الأسنان العضوية (الشكل 1A والشكل 2A)

  1. بناء على رقم الخلية الذي تم الحصول عليه ، احسب عدد الآبار التي يمكن زرعها. يجب أن تحتوي قطرة واحدة سعة 20 ميكرولتر على 20000 خلية. يتكون المزيج النهائي من تعليق الخلايا و BMM بنسبة 30:70.
  2. قم بإزالة الكمية المناسبة من supernatant وأعد تعليقها في BMM البارد للحصول على نسبة 70: 30 من BMM: تعليق الخلية للطلاء. على سبيل المثال ، عندما يتم الحصول على 200000 خلية ، قم بلوحة 10 قطرات من 20 ميكرولتر. وبالتالي ، قم بإزالة supernatant حتى يتم ترك 60 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وإضافة 140 ميكرولتر من BMM البارد المثلج والإنعاش.
    1. أعد التعليق ببطء لتجنب تكوين فقاعة الهواء. بمجرد إعادة تعليقه في BMM ، احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد.
      ملاحظة: يعد الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد أمرا بالغ الأهمية لتجنب تصلب BMM.
  3. ضع قطرات BMM سعة 20 ميكرولتر في وسط آبار لوحة الاستزراع المسخنة مسبقا المكونة من 48 بئرا.
  4. اقلب اللوحة رأسا على عقب ، وضعها في حاضنة 1.9٪ CO 2 (٪ CO2 وفقا للمخزن المؤقت SFDM) ، واتركها تتصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف مثبط ROCK (RI ؛ 10 ميكرومتر) والأمفوتريسين B (0.1٪) إلى TOM وقم بتسخين الوسط مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الأمفوتريسين B حساس للضوء.
  6. خذ الصفيحة المكونة من 48 بئرا من الحاضنة ، وضعها في وضع مستقيم وأضف 250 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا المحضر إلى كل بئر مع قطرات / خلايا BMM وأعد اللوحة إلى حاضنة CO2 بنسبة 1.9٪.
  7. لتحديث الوسط (يفضل كل 2-3 أيام) ، قم بإمالة اللوحة ذات ال 48 بئرا بزاوية 45 درجة ، وقم بإزالة الوسط السابق برفق مع تجنب لمس قطرة BMM ، وأضف 250 ميكرولتر من وسط TOM الجديد المسخن مسبقا.
    ملاحظة: يوصى بالتحديث ثلاث مرات على الأقل في الأسبوع لتجنب استنفاد العناصر الغذائية الرئيسية وعوامل النمو. يحتاج المثيل المحجوز فقط إلى إضافته إلى TOM عند البذر الأولي والأيام الأولى من كل عملية مرور (انظر القسم 4) لمنع موت الخلايا بواسطة anoikis وتعزيز النمو العضوي. يضاف الأمفوتريسين B فقط إلى الوسط أثناء الممر 0 (P0) لمنع التلوث الفطري المحتمل.

4. تضخيم وتمرير ثقافة الأسنان العضوية (الشكل 1B والشكل 2B)

  1. مرور المواد العضوية بين 10 و 14 يوما من الثقافة.
    ملاحظة: تجنب الزراعة لفترة أطول لأن الثقافة المطولة قد تحد من إعادة نمو الأعضاء وقابليتها للمرور. فقط في التطوير الأولي (P0) يمكن استزراع المواد العضوية لمدة تصل إلى 20 يوما اعتمادا على معدل نموها (حتى يتم الوصول إلى أقصى قطر ±200 ميكرومتر).
  2. إزالة الوسط من الآبار مع المواد العضوية التي تحتاج إلى مرور. وفي إطار حالة استزراع واحدة، تجمع ما يصل إلى أربعة آبار متقاربة (انظر الشكل 2 جيم).
  3. لجمع المواد العضوية ، أضف 400 ميكرولتر من SFDM البارد في كل بئر مباشرة على قطرة BMM وقم بسحب الوسط مرارا وتكرارا لأعلى ولأسفل حتى يتم إزاحة قطرة BMM بأكملها.
    1. في حالة تجميع الآبار ، انقل 400 ميكرولتر من البئر الأول إلى البئر التالي (وما إلى ذلك) لإزاحة قطرات BMM المحتوية على الأعضاء العضوية لجميع الآبار التي تحتاج إلى تجميعها.
  4. انقل مجموعة BMM-organoid التي تم إزاحتها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وكرر الخطوة 4.3 مرة أخرى حتى يتم جمع جميع الهياكل العضوية من الآبار.
  5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. قم بتسخين أليكوت من TrypLE Express (مكمل ب RI عند 5 ميكرومتر) في حمام مائي 37 درجة مئوية. لكل أنبوب الطرد المركزي الدقيق من المواد العضوية ، هناك حاجة إلى حجم 400 ميكرولتر TrypLE Express.
  7. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في 400 ميكرولتر من TrypLE. احتضان التعليق في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
  8. أضف 400 ميكرولتر من SFDM البارد لتعطيل الإنزيم وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant.
  9. قم بتغطية طرف مسبقا (لمعرفة الحجم انظر أدناه) باستخدام SFDM البارد المثلج وأعد تعليق الكريات العضوية.
    1. لتجنب فقدان الأعضاء ، أعد استخدام نفس الطرف (المطلي مسبقا) قدر الإمكان دون تعريض العقم للخطر.
      ملاحظة: يعتمد حجم SFDM المطلوب لإعادة تعليق الكريات على عدد الهياكل العضوية التي تم الحصول عليها ورقم المقطع الحالي.
    2. كقاعدة عامة ، بالنسبة للمقاطع ، تستخدم P0 إلى P2-3 (التي لا تزال تنمو بشكل عام عددا منخفضا من المواد العضوية) حجما قدره 200 ميكرولتر SFDM. من المقاطع ، يستخدم P3-4 أو أعلى (ينتج عنه عموما عدد أكبر من المواد العضوية) حجما قدره 700 ميكرولتر من SFDM.
      ملاحظة: يشار إلى كلا الإجراءين بطريقتي "الممر المنخفض" و "الممر الأعلى"، على التوالي (انظر الخطوتين 4-10 و4-11). يعد تطبيق الطرق المتميزة بشكل صحيح أمرا بالغ الأهمية لتمرير المواد العضوية بكفاءة. مع طريقة المرور الأعلى ، يتم فقدان المواد العضوية بسهولة أكبر ولا ينبغي تطبيقها على أعداد منخفضة من المواد العضوية (أي في P0 إلى P2-3). ومع ذلك ، هناك حاجة إلى طريقة المرور الأعلى لفصل كميات أكبر من المواد العضوية بكفاءة.
  10. طريقة المرور المنخفض: إعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من SFDM البارد الجليدي. ادفع طرف الماصة المفرغ بالكامل على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتقليل قطره. تحقق مما إذا كان القطر صغيرا بما فيه الكفاية (شفط أبطأ ، التدفق منحرف ولكن ليس مسدودا). Pipet صعودا وهبوطا لمدة 5 دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا.
  11. طريقة المرور الأعلى: أعد تعليق الكريات في 700 ميكرولتر من SFDM البارد بطرف P1000. أضف طرف P200 (بدون فلتر) فوق طرف P1000 هذا وقم بتغطيته مسبقا باستخدام SFDM البارد المثلج. منع تكوين فقاعة الهواء عن طريق ضبط إعداد حجم الماصة من أجل التطلع إلى 90٪ على الأقل من الحجم المتوسط (مع المواد العضوية). Pipet صعودا وهبوطا لمدة 5 دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا.
  12. تحقق تحت المجهر الضوئي (عند تكبير 4x) إذا تم الحصول على خلايا مفردة بشكل أساسي مع (فقط) عدد قليل من الهياكل غير المشتتة.
  13. أضف 500 ميكرولتر من SFDM البارد إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلط بلطف خليط الخلايا المنفصلة مع SFDM الطازج عن طريق السحب.
  14. دع الهياكل الكبيرة غير المشتتة ترسب لمدة 10 دقائق عن طريق وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق عموديا على الجليد.
    ملاحظة: من الضروري إزالة الهياكل غير المشتتة لأنها تؤثر سلبا على قابلية المرور العضوية. لبدء العضوية (P0) ، ليست هناك حاجة إلى خطوة الترسيب هذه.
  15. جمع supernatant (~ 500-1000 ميكرولتر اعتمادا على طريقة المرور) التي تحتوي على خلايا مفردة ومجموعات خلايا صغيرة ؛ نقل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق ، وأجهزة طرد مركزي عند 190 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. احسب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية آلي. إهمال كتل الخلايا المتبقية.
  17. احسب عدد الآبار التي يمكن بذرها واحسب نسبة تعليق الخلية / BMM المناسبة كما هو موضح أعلاه (القسم 3).
  18. أضف 70٪ من BMM إلى حبيبة الخلية وحافظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد لتجنب تصلب BMM.
  19. تابع الخطوة 3.3 حتى 3.7 ومر مرة أخرى بين اليوم 10 واليوم 14 من الثقافة.

5. الحفظ بالتبريد للأسنان العضوية

  1. جمع وفصل المواد العضوية كما هو مذكور أعلاه للمرور (الخطوة 4). جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات في 1 مل من وسيط الحفظ بالتبريد الذي يحتوي على SFDM (70٪) و FBS (20٪) و DMSO (10٪).
  3. انقل التعليق إلى تبريد وضعه على الجليد. ضع الكريوفيالات في صندوق تبريد وانقلها إلى -80 درجة مئوية (لمدة 4 ساعات على الأقل).
  4. في غضون شهر واحد ، قم بنقل العينات المجمدة إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل (>12 شهرا).

6. ذوبان الأعضاء الأسنان المحفوظة بالتجميد

  1. قبل البدء في إجراء الذوبان ، ضع أنبوبا واحدا سعة 15 مل لكل مبرد على الجليد يحتوي على 10 مل من SFDM مع 20٪ FBS.
  2. إزالة المبرد من النيتروجين السائل ووضعه على الجليد.
    ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن وتجنب وقت ذوبان الجليد الطويل جدا (>5 دقائق) وكذلك الفواصل الزمنية الطويلة جدا بين الخطوات (>5 دقائق) ، لأن هذا الإطالة ستقلل من بقاء الخلية.
  3. ضع المبرد في حمام مائي دافئ (37 درجة مئوية) حتى يذوب (~ 1-2 دقيقة).
  4. انقل على الفور محتوى التجميد إلى أنبوب 15 مل البارد وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة 9 مل من المادة الفائقة وقم بطرد مركزي 1 مل المتبقية عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت واغسل الكريات ب 1 مل من الثلج البارد SFDM.
  6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل وقم بحساب الخلايا باستخدام عداد خلية آلي.
  7. احسب عدد الآبار التي يمكن بذرها واحسب نسبة تعليق الخلية / BMM المناسبة كما هو موضح أعلاه (القسم 3).
  8. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات بنسبة 70:30 من BMM:TOM واحتفظ بها على الجليد.
  9. تابع الخطوة 3.3 حتى 3.7 والمرور بين اليوم 10 واليوم 14 من الثقافة.

7. تثبيت وتضمين البارافين من المواد العضوية الأسنان

ملاحظة: يمكن أيضا تطبيق هذا الإجراء (بما في ذلك القسمين 8 و 9) على أنسجة DF الأساسية.

  1. تثبيت الأعضاء الأسنان في PFA
    1. قم بإزالة الوسط من كل بئر وكذلك في الخطوة 4.2.
    2. جمع المواد العضوية عن طريق إزاحة قطرة BMM (الخطوة 4.3). انقل خليط BMM-organoid إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بإزالة السوبرناتانت وإضافة 500 ميكرولتر من 4٪ PFA واحتضنها لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (بحد أقصى 1 ساعة) في RT مع خلط لطيف على شاكر مداري.
      تنبيه: استخدم الغطاء الكيميائي عند العمل مع PFA.
    5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت وشطف الكريات العضوية باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في RT مع اهتزاز لطيف.
    6. اغسل الكريات العضوية (الخطوة 7.1.5) مرتين إضافيتين. قم بتدوير المواد العضوية الثابتة لأسفل عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH (في الماء منزوع الأيونات). تخزين المواد العضوية لمدة تصل إلى 1 شهر في 70٪ EtOH في 4 درجة مئوية.
  2. Agarose- والبارافين - تضمين من المواد العضوية الأسنان
    ملاحظة: لتضمين المواد العضوية بكفاءة في البارافين ، هناك حاجة إلى خطوة إضافية للتضمين في الأغاروز.
    1. الطرد المركزي للعضويات الثابتة PFA في 70٪ EtOH عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant.
    2. تحضير محلول الأغاروز 2 ٪ في 30 مل من PBS في زجاجة زجاجية. قم بتسخين خليط الأغاروز-PBS في الميكروويف حتى يتم ملاحظة بنية تشبه الهلام (حوالي 2.5 دقيقة عند 600 واط).
    3. في موازاة ذلك ، أضف 30 مل من PBS إلى زجاجة زجاجية أخرى وقم بالإحماء في الميكروويف (حوالي 2.5 دقيقة عند 600 واط). دع محلول الأغاروز يبرد لمدة 1 دقيقة.
    4. اقطع طرف P200 للسماح بالعمل مع محلول الأغاروز بدقة ولتجنب فقاعات الهواء.
    5. قم بتسخين طرف P200 مسبقا في PBS الدافئ عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    6. أضف 150 ميكرولتر من محلول الأغاروز المسخن مسبقا إلى حبيبات العضوية وقم بسحب خليط الأغاروز العضوي بلطف (مع الحد الأدنى من إعادة التعليق) مع تجنب فقاعات الهواء.
      ملاحظة: سيسمح الحد الأدنى من إعادة التعليق بتحديد موقع المواد العضوية في هلام الأغاروز بشكل أفضل عند تقسيم الميكروتوم لأن المواد العضوية تكون أقرب إلى بعضها البعض.
    7. انقل على الفور خليط الأغاروز العضوي إلى نفس غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وضع الأنبوب أفقيا ، واترك الأغاروز يتصلب (~ 20 دقيقة في RT). في غضون ذلك ، قم بتسمية الكاسيت.
    8. بمجرد تصلبه ، قم بإزالة هلام الأغاروز من غطاء جهاز الطرد المركزي الدقيق باستخدام ملاقط وانقله إلى كاسيت ملصق.
    9. انقل الكاسيت المحتوي على الأغاروز إلى كوب يحتوي على 50٪ EtOH في ماء منزوع الأيونات. قم بتغطية الكوب بالبارافيلم لتجنب تبخر EtOH.
      ملاحظة: يعتمد حجم الكأس على عدد أشرطة الكاسيت.
    10. معالجة العينات في معالج الأنسجة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: مع تصلب البارافين في RT ، يجب تنفيذ الخطوات التالية بسرعة.
    11. قم بتسخين كتلة تسخين في محطة عمل التضمين لمدة 15 دقيقة.
    12. قم بإزالة جل الأغاروز المحتوي على عضويات والموجود في الكاسيت وضعه في كتلة التسخين المسببة للتدفئة. قم بإزالة الغطاء من الكاسيت وضعه جانبا للاستخدام لاحقا.
    13. املأ كتلة التدفئة المتبقية بالبارافين.
      ملاحظة: تحقق باستخدام ملاقط ما إذا كان جل الأغاروز المحتوي على عضويات لا يزال موجودا في الجزء السفلي من كتلة التسخين. نظرا لخفة وزنه ، قد يبدأ في الطفو ، مما يؤدي إلى فقدان العينة.
    14. ضع غطاء الكاسيت أعلى كتلة التسخين. اتركه يتصلب لمدة 30 دقيقة على طبق بارد. قم بإزالة كتلة التسخين وتخزين كتل البارافين عند 4 درجات مئوية.

8. تقسيم الميكروتوم وتلطيخ الأعضاء العضوية للأسنان (الشكل 2B والشكل 3A-C)

  1. التقسيم الدقيق لكتل البارافين المحتوية على عضويات
    1. شريحة 5 ميكرومتر أقسام من المواد العضوية الأسنان في كتل البارافين باستخدام ميكروتوم.
    2. ضع شرائح البارافين فوق شريحة زجاجية مجهرية. ضع شريحة زجاج المجهر على صفيحة دافئة عند 37 درجة مئوية وقم بتغطيتها بالماء منزوع الأيونات باستخدام ماصة باستور.
    3. دع زجاج المجهر ينزلق بين عشية وضحاها.
  2. تلطيخ أقسام الأسنان العضوية
    1. قم بإزالة البارافينات من الأقسام العضوية (على شريحة زجاج المجهر) في فرن لمدة 1 ساعة عند 58 درجة مئوية.
    2. قم بإعادة ترطيب المقاطع العضوية (على شريحة زجاج المجهر) في سلسلة EtOH المتناقصة داخل الغطاء الكيميائي بالترتيب التالي:
      زيلين 2x لمدة 3 دقائق لكل منهما
      100٪ EtOH 2x لمدة 3 دقائق لكل منهما
      95٪ EtOH 2x لمدة 3 دقائق لكل منهما
      90٪ EtOH 2x لمدة 3 دقائق لكل منهما
      70٪ EtOH 3x لمدة 3 دقائق لكل منهما
      تنبيه: استخدم الغطاء الكيميائي عند العمل مع الزيلين.
    3. شطف شريحة زجاج المجهر في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق في RT. ثم اشطفيه في PBS لمدة 5 دقائق في RT.
    4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق وضع المقاطع العضوية (على شريحة زجاج المجهر) في مخزن مؤقت للسترات المحفوظ مسبقا (10 ملليمتر من حمض الستريك في الماء منزوع الأيونات مع درجة الحموضة 6 ؛ في وعاء بلاستيكي ؛ يتم تسخينه مسبقا لمدة 10 دقائق في حمام مائي 95 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 95 درجة مئوية.
    5. دع زجاج المجهر ينزلق يبرد لمدة 20 دقيقة في RT. اشطف شريحة زجاج المجهر في PBS لمدة 5 دقائق في RT ، ثم في PBS تحتوي على 0.1٪ Triton-X (PBT) لمدة 5 دقائق في RT.
    6. استخدم قلم تمييز لإنشاء حاجز مسعور عند حدود كل شريحة.
    7. كتلة لمدة لا تقل عن 1 ساعة في RT في المخزن المؤقت المانع (يحتوي على 1.5 ملغ / مل من الجلايسين ، 2 ملغ / مل مصل الألبومين البقري (BSA) المذاب في PBT) بالإضافة إلى 10 ٪ مصل الحمير.
      ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع بالإضافة إلى 10٪ من مصل الحمير لكل شريحة زجاجية مجهرية.
    8. ضع شريحة زجاج المجهر في غرفة رطبة. استخدم صندوقا محكم الإغلاق حيث تتناسب جميع الشرائح مع بعض المناديل الورقية بالماء لوضعها في أسفل الصندوق. هذا سيمنع الشرائح من الجفاف خلال خطوات التلطيخ اللاحقة.
    9. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع ، وأضف الجسم المضاد الأساسي (الجدول 6) المحضر في المخزن المؤقت المانع بالإضافة إلى مصل الحمير بنسبة 1٪ واحتضن الشريحة المغطاة بمحلول الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في الغرفة الرطبة عند 4 درجات مئوية. أعد رسم حد قلم وضع العلامات إذا لزم الأمر.
    10. اغسل شريحة زجاج المجهر ثلاث مرات في PBT في RT لمدة 10 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري (75-150 دورة في الدقيقة).
    11. أضف الجسم المضاد الثانوي (الجدول 6) ، المحضر في المخزن المؤقت المانع بالإضافة إلى مصل الحمير بنسبة 1٪ ، واحتضنه لمدة ساعة واحدة في الغرفة الرطبة في RT.
    12. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واغسل شريحة زجاج المجهر ثلاث مرات في PBT في RT لمدة 10 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري.
    13. أضف وسط تركيب مضاد للتلاشي باستخدام DAPI (من 1 إلى 3 قطرات) على غطاء زجاجي وقم بتركيبه فوق الأقسام العضوية (على شريحة زجاج المجهر). المضي قدما في التصوير. تخزين الشرائح لمدة أقصاها 1 أسبوع في 4 درجة مئوية.

9. استخراج الحمض النووي الريبي و RT-qPCR من المواد العضوية الأسنان (الشكل 2B والشكل 3D)

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من الأعضاء الأسنان
    1. قم بإزالة الوسط من كل بئر (الخطوة 4.2).
    2. جمع المواد العضوية عن طريق إزاحة قطرة BMM (الخطوة 4.3) ، ونقل خليط BMM-organoid إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإزالة supernatant ، وأعد تعليقه بقوة في 350 ميكرولتر من 1٪ β-mercaptoethanol المذاب في المخزن المؤقت للتحلل (جدول المواد) ، ووضعه على الجليد.
      تنبيه: نفذ جميع الخطوات باستخدام β-mercaptoethanol في غطاء محرك السيارة الكيميائي.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه الخطوة لمدة تصل إلى 1 شهر عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة العينات على الجليد قبل المتابعة مع الخطوة 9.1.4.
    4. دوامة العينات حتى لا يتم ملاحظة أي هياكل عضوية بعد الآن.
    5. تابع استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. RT-qPCR من المواد العضوية الأسنان (الجدول 7)
    1. النسخ العكسي (RT) للحمض النووي الريبي19 باستخدام مجموعة النسخ العكسي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. تحليل عينات cDNA الناتجة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)19 القائم على SYBR Green19 باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تطور الأسنان العضوية
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء ثقافات عضوية من أنسجة DF البشرية المكتسبة بعد استخراج ضرس العقل (الشكل 1A). يتم فصل DF المعزول إنزيميا وميكانيكيا. يتم استزراع الخلايا التي تم الحصول عليها داخل BMM في الوسائط التي تم تعريفها تجريبيا من أجل التطور والنمو العضوي الأمثل (وسط عضوي للأسنان; توم)19.

عادة ما تتطور المواد العضوية في غضون 2 أسابيع بعد بذر خلايا DF (P0; الشكل 2 ألف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول الجيل الفعال والقابل للتكرار من المواد العضوية بدءا من الأسنان البشرية. على حد علمنا ، هذه هي المنهجية الأولى لإنشاء العضوية ذات المفهوم الحالي (الظهارية) بدءا من أنسجة الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل وتعرض النمط الظاهري الظاهري للجذع الظهاري للأسنان ، مما يكرر DESCs التي تم الإبلاغ عنها سابقا في حجرة ERM في DF7. علاوة على ذلك ، تقوم المواد العضوية بتكرار خصائص DESC / ERM الوظيفية ، بما في ذلك الكشف عن عملية تمايز الأرومة النمائية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يضمن المؤلف المقابل أن جميع المؤلفين قد كشفوا عن أي وجميع تضارب المصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لجميع موظفي جراحة الفم والوجه والفكين (MKA) في UZ Leuven ، وكذلك المرضى ، لمساعدتهم التي لا تقدر بثمن في جمع الأضراس الثالثة المستخرجة حديثا. نود أيضا أن نشكر الدكتورة رينهيلد جاكوبس والدكتورة إليزابيث تيجسكينز على مساعدتهما في جمع العينات. تم دعم هذا العمل من خلال منح من KU Leuven (BOF) و FWO-Flanders (G061819N). L.H. هو زميل دكتوراه FWO (1S84718N).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق Eppendorf30120.086
15 مل أنبوب الطرد المركزيCorning430052
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM-6250
ألواح قاع مسطحة 48 بئرCorning3548
50 مل أنبوب الطردالمركزي Corning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
AgaroseLonza50004
ألبومين بقري (درجة زراعة الخلايا)Serva47330.03
AMELX الجسم المضادسانتا كروزsc-365284
أمفوتريسين بجيبكو15200018
B27 (بدون فيتامين أ)جيبكو12587-010
كاسيتVWR7202191
كاتالاز من كبد البقرسيجما ألدريتشC100
CD44 الجسم المضادAbcamab34485
مصفاة الخلايا ، 40 & micro ؛ mFalcon352340
الكوليراSigma-AldrichC8052
حمض الستريكSigma-AldrichC0759
CK14 الجسم المضادThermo Fisher ScientificMA5-11599
Collagenase IVGibco17104-019
غطاء زجاجيVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
CryovialThermo Fisher Scientific375353
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD2650
Dispase IIسيجما ألدريتشD4693
DMEM 1: 1 F12 بدون FeInvitrogen074-90715A
مسحوق DMEM عالي الجلوكوزGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
مصل الحمارSigma-AldrichD9663 - 10ML
محطة عمل التضمين ، 220 إلى 240 فولت تيار مترددثيرمو فيشر العلمي12587976
الإيثانول المطلق ، & ge ؛ 99.8٪ (EtOH) فيشركيميكالE / 0650DF / 15
مصل بقري الجنين (FBS)سيجما ألدريتشF7524
FGF10بيبروتك100-26
FGF2 (= FGF أساسي)R & D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTيتضمن 1٪ & بيتا ميركابتو إيثانول مذاب في عازلة التحلل
باستور ماصةنيكوآليات 170-40050
جلايسينVWR101194M
HEPESسيجما ألدريتشH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (مثبط ROCK ، RI)Sigma-Aldrich688001
الأنسولين من البنكرياس البقريSigma-AldrichI6634
ITGA6 الأجسام المضادةسيجما ألدريتشHPA012696
L-GlutamineGibco25030024
Matrigel (عامل النمو المخفض ؛ خالي من الفينول باللون الأحمر)شريحة مجهر 15505739
Corning Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV وحدة تصفية حقنة ، 0.22   ؛ مو mMilliporeSLGV033R
الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي (α MEM)سيجما ألدريتشM4526
الماوس IgG (Alexa 555) الجسم المضاد الثانويThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-acetyl L-cysteineSigma-AldrichA7250
نيكوتيناميدسيجما ألدريتشN0636
NogginPeproTech120-10C
الجسم المضاد P63Abcamab124762
قلم عنقالرحم Sigma-AldrichZ377821-1EAقلم الوسم
Paraformaldehyde (PFA) ، 16٪Merck8.18715
Penicillin G ملح الصوديومSigma-AldrichP3032
البنسلين الستربتومايسين (قلم / Strep)طبقجيبكو15140-122
بتريكورنينج353002
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ماصة Gibco10010-015
(P20 ، P200 ، P1000)Eppendorf أو غيرها2231300006
ماصة نقل البلاستيك (3.5 & nbsp ؛ مل)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) الجسم المضاد الثانويThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
مشرط (شفرة جراحية)Swann-Morton207
SHHR & D Systems464-SH-200
قوالب السيليكون (كتلة التسخين)VWR720-1918
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) BDH102415K
كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3)ميرك106329
الصوديوم بيروفات (C3< / sub>H3< / sub>NaO3< / sub>)سيجما ألدريتشP-5280
SOX2 الأجسام المضادةAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR
System Stericup-GP ، 0.22 & micro ؛ mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP وحدة تصفية علوية لأنبوب الطرد المركزي المعقم ، 0.22 & mu ؛ مميليبورSCGP00525
معقم 1000 مو ؛ أطراف ماصة L مع فلترGreiner740288
معقم 20 مو ؛ أطراف ماصة L مع فلترGreiner774288
معقم 200 مو ؛ أطراف ماصة L مع وبدون مرشحGreiner739288
معقم H2< / sub>OFreseniusB230531
ملح كبريتات الستربتومايسينSigma-AldrichS6501
Superscript III أول حبلا تخليق سوبرميكسInvitrogen11752-050طقم النسخ العكسي
معالج الأنسجةالحراري العلمي12505356
ترانسفيرينسيرفا36760.01
تريتون X-100سيجماT8787-50ML
TrypLE ExpressGibco12605-010
Vectashield تركيب متوسط + DAPILabconsult NVH-1200وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
الزيلين ، 99٪ ، للكيمياء الحيوية والأنسجةVWR2،89،75،325
توكسين زجاج

المراجع

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).
  31. Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنشاء المواد العضوية من الأسنان البشرية كأداة قوية نحو البحث الميكانيكي والعلاج التجديدي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.