إنشاء عضويات الرئة البشرية والتمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة

أصبحت المواد العضوية أداة قوية وعالمية لنمذجة تطور الأعضاء في المختبر ودراسة البيولوجيا والمرض. عند استزراعها في وسط استزراع محدد بعامل النمو ، يمكن توسيع الخلايا الجذعية البالغة (ASC) من مجموعة متنوعة من الأعضاء في 3 أبعاد (3D) وتجميعها ذاتيا في مجموعات خلوية تشبه الأعضاء تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، تسمى المواد العضوية. أبلغ مختبر كليفرز عن اشتقاق أول عضوي مشتق من ASC ، عضوي معوي بشري ، في عام 2009 ^1,2. بعد ذلك ، تم إنشاء عضويات مشتقة من ASC لمجموعة متنوعة من الأعضاء والأنسجة البشرية ، بما في ذلك البروستاتا³،⁴ ، والكبد⁵،⁶ ، والمعدة⁷،^8،9 ، والبنكرياس 10 ، والغدة الثديية 11 ، والرئة ^12،13 . احتفظت هذه المواد العضوية المشتقة من ASC بالخصائص الخلوية والهيكلية والوظيفية الحرجة للعضو الأصلي وحافظت على الاستقرار الجيني والمظهري في ثقافة التوسع طويلة الأجل^14,15.

يمكن أيضا اشتقاق المواد العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلية الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS)¹⁶. في حين أن المواد العضوية المشتقة من PSC تستغل آليات تطوير الأعضاء لإنشائها ، يمكن إجبار ASCs على تكوين عضويات عن طريق إعادة بناء الظروف التي تحاكي مكانة الخلايا الجذعية أثناء التجديد الذاتي للأنسجة الفسيولوجية أو إصلاح الأنسجة. تعد المواد العضوية المشتقة من PSC نماذج مواتية لاستكشاف التطور والتكوين العضوي ، وإن كانت غير قادرة على الوصول إلى مستوى النضج المماثل للعضويات المشتقة من ASC. حالة النضج الشبيهة بالجنين للعضويات المشتقة من PSC ، والتعقيد لإنشاء هذه المواد العضوية تمنع بشكل كبير تطبيقاتها الواسعة لدراسة البيولوجيا وعلم الأمراض في الأنسجة الناضجة.

تصطف القناة التنفسية البشرية ، من الأنف إلى القصيبات الطرفية ، مع ظهارة مجرى الهواء ، وتسمى أيضا الظهارة الهدبية الزائفة الطبقية ، والتي تتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، أي الخلايا الهدبية ، والخلية الكأسية ، والخلية القاعدية ، وخلية النادي. أنشأنا عضوي الرئة البشري المشتق من ASC من أنسجة الرئة البشرية بالتعاون مع مختبر Clevers^12,13. يتم توسيع هذه المواد العضوية الرئوية على التوالي في وسط التوسع لأكثر من عام. تختلف المدة الدقيقة بين الخطوط العضوية المختلفة التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن الخلايا الهدبية ، وهي مجموعة الخلايا الرئيسية في مجرى الهواء البشري ، ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه المواد العضوية الرئوية. وهكذا ، قمنا بتطوير بروتوكول تمايز قريب وأنشأنا عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ ظاهريا مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء إلى مستوى شبه فسيولوجي.

هنا نقدم بروتوكول فيديو لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D.

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الأنسجة البشرية الموضحة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة هونغ كونغ / هيئة المستشفيات في هونغ كونغ ويست كلاستر (UW13-364 و UW21-695). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى قبل جمع الأنسجة.

1. اشتقاق العضوية الرئة البشرية

1. إعداد المواد التجريبية
   1. تحضير الوسط القاعدي عن طريق استكمال وسط DMEM / F12 المتقدم مع 2 mM الجلوتامين ، 10 mM HEPES ، 100 U / mL من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
   2. تحضير وسط توسع عضوي للرئة البشرية عن طريق استكمال الوسط القاعدي بنسبة 10٪ R-spondin 1 وسط مشروط ، و 10٪ وسط مكيف Noggin ، وملحق B27 1x ، و 1.25 mM N-acetylcysteine ، و 10 mM nicotinamide ، و 5 μM من Y-27632 ، و 500 nM من A-83-01 ، و 1 μM من SB202190 ، و 5 نانوغرام / مل من عامل النمو الليفي (FGF) -7 ، و 20 نانوغرام / مل من FGF-10 ، و 100 ميكروغرام / مل من البريموسين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن استبدال الوسط المشروط R-spondin 1 و Noggin ب R-spondin 1 المؤتلف التجاري (500 نانوغرام / مل) و Noggin (100 نانوغرام / مل).
   3. قم بتسخين صفيحة استزراع معلقة من 24 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا. استخدم حاضنة زراعة الخلايا القياسية مع 5٪ CO₂ والغلاف الجوي الرطب عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة مصفوفة الطابق السفلي في ثلاجة 4 درجات مئوية. حافظ على مصفوفة الطابق السفلي ووسط الاستزراع على الجليد أثناء التجريب.
2. عزل الخلايا من أنسجة الرئة البشرية لثقافة العضوية 3D
   1. شراء أنسجة الرئة البشرية المستأصلة حديثا بحجم حوالي 0.5 سم من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي بسبب أمراض مختلفة. نقل أنسجة الرئة في 30 مل من الوسط القاعدي في درجة حرارة الغرفة ومعالجتها في أسرع وقت ممكن داخل غطاء السلامة الأحيائية.
   2. افرم أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة (0.5-1 مم) باستخدام مشرط معقم في طبق زراعة خلايا 10 سم. اغسل قطع الأنسجة ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، يليه الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   3. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 8 مل من الوسط القاعدي المكمل بالكولاجيناز بتركيز نهائي قدره 2 ملغم / مل. هضم قطع الأنسجة عن طريق هز الأنبوب عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بتحريك أعلى وأسفل لمدة 20 ضعفا لقص قطع الأنسجة المهضومة باستخدام ماصة مصلية 10 مل. قم بتكديس مصفاة 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية التعليق.
   5. استعادة قطع الأنسجة على المصفاة مع الوسط القاعدي ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل ، تليها جولة ثانية من القص والترشيح. يمكن إجراء تصفية قص إضافية 1x-2x لعزل المزيد من الخلايا ، خاصة عند شراء قطعة صغيرة من الأنسجة (على سبيل المثال ، <0.5 سم).
   6. أضف FBS إلى التدفق من خلال تركيز نهائي قدره 2٪ لإنهاء الهضم ، يليه الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسط القاعدي ، تليها الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
   8. (اختياري) إذا شوهدت العديد من كريات الدم الحمراء في الكريات (تقدر بلون الكرية) ، فأعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء وحضانتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم أضف 10 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب ، متبوعا بالطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
   9. أعد تعليق الكريات في مصفوفة الطابق السفلي البارد واحتفظ بها على الجليد. إضافة 80-160 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي للخلايا المستردة من أنسجة الرئة بحجم حوالي 0.5 سم ؛ المبلغ يكفي لزرع 2-4 قطرات.
   10. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق على كل بئر من لوحة مستنبتة التعليق 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب لتشكيل قطرة.
   11. أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد عضويات الرئة البشرية مع 5 نانومتر من هيريجولين بيتا-1 إلى كل بئر واحتضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا.
   12. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. قم بإزالة الوسط القديم مع الحفاظ على القطرة سليمة وأضف الوسط الطازج بحذر. مرور المواد العضوية بعد الحضانة لمدة 10-14 يوما. استخدم Heregulin beta-1 فقط في الثقافة الأولية قبل المقطع الأول.
   13. راقب المواد العضوية تحت المجهر للتأكد من أن المواد العضوية ليست جزءا لا يتجزأ من كثافة الخلايا العالية جدا. إذا تفككت قطرة بسبب كثافة الخلايا العالية بشكل مفرط ، فقم باستعادة وإعادة تضمين المواد العضوية والخلايا ذات الحجم الأكبر من مصفوفة الطابق السفلي لصنع المزيد من القطرات ذات كثافة الخلايا الأقل والمرغوبة.

2. توسيع العضوية الرئوية البشرية

1. قم بإعداد ماصة باستور عن طريق حرق طرف ماصة باستور على لهب ، مثل موقد بنسن ، لتضييق الفتحة من 1.5 مم إلى حوالي 1.0 مم في القطر. قم بتبريد الماصات ، تليها التعقيم للتعقيم. بلل الماصات بالوسط القاعدي لتجنب التعلق الخلوي وفقدانه أثناء القص الميكانيكي.
2. مرور عضويات الرئة مع القص الميكانيكي
   1. استخدم طرف 1 مل وماصة لأعلى ولأسفل لكسر القطرات التي تم الحصول عليها أعلاه. ثم ، انقل المواد العضوية مع الوسط إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل واضبط الحجم إلى 10 مل مع وسط قاعدي بارد. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
   2. اغسل المواد العضوية ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد مرة أخرى. إعادة تعليق المواد العضوية في 2 مل من الوسط القاعدي البارد. ضع لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور.
   3. تكملة مع المتوسطة القاعدية إلى حجم إجمالي من 10 مل، تليها الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الشظايا العضوية باستخدام مصفوفة قبو باردة كافية لتمكين التوسع من 1:3 إلى 1:5. حافظ على الجليد.
   4. ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
   5. أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد الرئة العضوي إلى كل بئر واحتضنه في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. مرور المواد العضوية كل أسبوعين بنسبة 1: 3 إلى 1: 5.
3. مرور عضويات الرئة مع التربسين
   ملاحظة: يفضل التربسين عندما يكون من الصعب قص عضوي الرئة إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور ، أو يكون حجم المواد العضوية متغيرا للغاية ، أو تتطلب التجارب اللاحقة عضويات ذات حجم أكثر اتساقا.
   1. حصاد المواد العضوية الرئوية كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق العضو العضوي في 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
   2. أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قص المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحب المواد العضوية لأعلى ولأسفل إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور. تحقق من حجم القطع العضوية تحت المجهر عند تكبير 4x. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
      ملاحظة: تحديد حجم الشظايا العضوية تحت المجهر وفقا للترتيب التجريبي. إذا كانت التجربة تحتاج إلى المزيد من المواد العضوية أو المواد العضوية ذات الحجم الأكثر اتساقا ، فقم بقص المواد العضوية إلى قطع أصغر أو حتى خلايا مفردة. بعد ذلك ، يستغرق الأمر وقتا أطول ، ربما 3 أسابيع ، قبل أن تكون المواد العضوية جاهزة للتجريب.
   3. قم بتعبئة الرصيد بوسط قاعدي إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق القطع العضوية في مصفوفة الطابق السفلي البارد بحجم كاف للمرور بنسبة 1:5-1:10. حافظ على الجليد.
   4. ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
   5. تكملة مع 500 ميكرولتر من وسط توسع الرئة العضوي لكل بئر وحضانة في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث وسيط التمدد كل 3 أيام. مرور المواد العضوية بعد 2-3 أسابيع.
      ملاحظة: يتم تركيب حوالي 100 مادة عضوية داخل قطرة 40 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي. عادة ما تنمو عضويات الرئة بشكل أفضل مع كثافة خلايا عالية نسبيا. أعد تضمين المواد العضوية بكثافة خلايا أقل إذا تفككت القطرات أو التقت المواد العضوية المتنامية معا بسبب كثافة الخلايا العالية للغاية.

3. التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة

1. قم بإعداد وسط التمايز القريب (وسط PD) عن طريق استكمال الوسط القاعدي للواجهة السائلة الهوائية بملحق واجهة سائلة هوائية 1x ، وملحق صيانة واجهة سائل الهواء 1x ، و 4 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر من الهيدروكورتيزون ، و 10 ميكرومتر من Y-27632 ، و 10 ميكرومتر من DAPT (انظر جدول المواد).
2. 3D مجرى الهواء العضوية
   1. احتضان عضويات الرئة في وسط التمدد لمدة 7-10 أيام بعد المرور عن طريق القص الميكانيكي. استبدل وسيط التوسيع بوسيط PD. احتضان المواد العضوية في وسط PD لمدة 14 يوما في حاضنة زراعة الخلايا.
   2. تخلص من وسيط PD في كل بئر. أضف المخزن المؤقت للخلايا لحصاد المجرى الهوائي العضوي المتمايز لاستخراج الحمض النووي الريبي والكشف عن التعبير الجيني الخلوي عن طريق فحص RT-qPCR.
   3. بدلا من ذلك ، احتضن المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بعد إضافة 10 mM EDTA لفصل المواد العضوية إلى خلايا مفردة ، تليها تحليل التدفق الخلوي لفحص مجموعات الخلايا. المواد العضوية جاهزة للتلاعبات التجريبية المختلفة.
3. 2D مجرى الهواء العضوي
   1. إعداد ما يكفي من المواد العضوية الرئوية 3D لثقافة التمايز 2D. مطلوب ما مجموعه 1.3 × 10 5 و 4.5 × 10⁵ خلايا لإدراج دعم قابل للنفاذ 24 بئرا وإدراج دعم قابل للنفاذ 12 بئرا ، على التوالي.
   2. بعد أن تنمو عضويات الرئة ثلاثية الأبعاد في وسط التمدد لمدة أسبوعين ، هضم المواد العضوية إلى خلايا مفردة والبذور في إدراج 24 بئرا و 12 بئرا لتوليد عضويات مجرى الهواء ثنائية الأبعاد.
   3. قبل احتضان الإدخالات مع الوسط القاعدي بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الخلايا. أضف 250 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية للوحة ذات 24 بئرا ، على التوالي. للحصول على لوحة من 12 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية ، على التوالي.
   4. حصاد العضوية الرئوية ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق المواد العضوية مع 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
   5. أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قم بتحريك الخلايا العضوية لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى خلايا مفردة باستخدام ماصة باستور والتحقق من الخلايا تحت المجهر. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
   6. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. انقل تعليق الخلية المصفى إلى أنبوب 15 مل. قم بتعبئة المزيج بوسط قاعدي إلى حجم إجمالي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. أعد تعليق الكريات ، التي تم جمعها من 24 قطرة (40 ميكرولتر) ، في 1-2.5 مل من وسط تمدد الرئة العضوي اعتمادا على كثافة الخلايا في القطرات. عد عدد الخلايا التي تحتوي على عداد خلايا تحت المجهر. اضبط تركيز الخلية على 1.3 × 10⁶/مل (لإدراج 24 بئرا) أو 9 × 10⁵/مل (لإدراج 12 بئرا).
   8. قم بإزالة الوسط القاعدي من الغرف العلوية والسفلية. أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من وسط التمدد في الغرفة السفلية لإدراج 24 بئرا وإدراج 12 بئرا ، على التوالي. البذور 100 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضرة في الخطوة 3.3.7 على الغرفة القمية لإدراج 24 بئرا و 12 بئرا ، على التوالي.
   9. احتضان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 أيام. استبدل وسط التمدد بوسط PD في كل من الغرفة القمية والسفلية للألواح. احتضان المواد العضوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 14 يوما وتحديث وسط PD كل 3 أيام.
      ملاحظة: يمكن تمييز الأهداب المتنقلة في المواد العضوية 3D و 2D تحت المجهر من اليوم 7 بعد الحضانة في وسط PD. بعد 14 يوما من ثقافة التمايز في وسط PD ، تنضج عضويات مجرى الهواء لمختلف التلاعبات التجريبية.
   10. قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) كل يومين باستخدام نظام قياس المقاومة الكهربائية وفقا لبروتوكول قياسي موضح في¹⁷.

يتيح هذا البروتوكول اشتقاق عضويات الرئة البشرية بمعدل نجاح مرتفع. يتم فرم أنسجة الرئة البشرية الطازجة إلى قطع صغيرة ، ثم تتحلل مع الكولاجيناز. يتم تضمين الخلايا المفردة الناتجة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التوسع العضوي الرئوي مع استكمال مزيج من العوامل المتخصصة لنمو الخلايا الجذعية الظهارية (الخطوة 1.1.2). ويبين الشكل 1 الصورة المصغرة لخلايا الرئة المعزولة حديثا المضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي لعامل النمو المنخفض من النوع 2 (BME; الشكل 1 ألف، إلى اليسار). تظهر المواد العضوية الكيسية وتتضخم بمرور الوقت (الشكل 1A ، على اليمين). وفي الوقت نفسه ، تخضع الخلايا غير ذات الصلة لموت الخلايا تدريجيا. توجد الخلايا الليفية في الثقافة خلال الممرات الأولى أو الثانية. بعد ذلك ، تحتوي الثقافة على عضويات ظهارية حصريا ، وهي عضويات رئوية مشتقة من الخلايا الجذعية الظهارية الموجودة في أنسجة الرئة الأولية. يتم تمرير هذه المواد العضوية الرئوية كل 2-3 أسابيع عن طريق القص الميكانيكي بنسبة 1: 3 إلى 1: 5 أو عن طريق التربسين بنسبة 1: 5 إلى 1: 10 (الخطوات 2.2-2.3). تظهر الصور الميكروفوتوغرافية التمثيلية للعضويات الرئوية بعد المقطع الرابع في الشكل 1B. بعد القص الميكانيكي ، تشكل الشظايا العضوية المضمنة في BME مجالات كيسية في غضون ساعتين (الشكل 1B ، اليسار). تظهر صورة مصغرة لنفس الحقل في اليوم 5 (الشكل 1B ، على اليمين) المواد العضوية التي تنمو بمرور الوقت. هذه الخلايا العضوية الرئوية البشرية المتوسعة تؤوي جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الأربعة في مجرى الهواء ، بما في ذلك الخلايا الهدبية ACCTUB + أو FOXJ1 + ، والخلية القاعدية P63 + ، وخلية نادي CC10 + ، وخلية الكأس MUC5AC +18 (الشكل 1C) ، في حالة سابقة لأوانها. والجدير بالذكر أن هذه المواد العضوية الرئوية البشرية يمكن أن تمر على التوالي وبثبات لأكثر من 1 سنة. عند الاحتفاظ بها داخل مصفوفة الطابق السفلي ، من المرجح أن تظهر عضويات الرئة قطبية قطبية قمية ، وأقل من 2٪ -3٪ من عضويات الرئة تظهر قطبية قطبية قمية13. ونتيجة لذلك ، لا يمكن الوصول بسهولة إلى قمم الخلايا ما لم يتم قص المواد العضوية 3D مفتوحة.

ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء البشري الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن مجموعة الخلايا المهيمنة في ظهارة مجرى الهواء البشري الأصلي ، الخلية الهدبية ، ممثلة تمثيلا ناقصا في العضوية الرئوية. ثم حددنا وسيط التمايز القريب (PD) لتحسين حالة نضج عضويات الرئة البشرية. طورت المواد العضوية المحتضنة في وسط التمدد ووسط PD مورفولوجيا متميزة بمرور الوقت (الشكل 2A). كانت الأهداب المتحركة أكثر وفرة في المواد العضوية في وسط PD من تلك الموجودة في وسط التمدد. بعد أسبوعين من ثقافة التمايز في وسط PD ، يمكن تمييز الأهداب المتحركة في كل عضوي واحد (الشكل 2B والفيديو التكميلي 1). ومن المثير للاهتمام أن الأهداب الضاربة تدفع حطام الخلية وتفرز الميوسين داخل التجويف العضوي لتدور في اتجاه واحد ، مما يلخص بشكل كاف السلم المتحرك المخاطي الهدبي لإزالة الجسيمات المستنشقة (الفيديو التكميلي 1) ، وهي آلية مهمة للتطهير الذاتي للممرات الهوائية البشرية. لقد أظهرنا أن الخلايا الهدبية زادت بشكل كبير إلى حوالي 50٪ في المواد العضوية المتباينة مقارنة بعضويات الرئة الأصلية. لتقييم النسب المئوية لأربعة أنواع من الخلايا الظهارية ، تم تحليل عضويات مجرى الهواء 2D عن طريق قياس التدفق الخلوي. باختصار ، تم فصل المواد العضوية مع 10 mM EDTA لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثابتة مع 4٪ PFA ، وتتخلل مع 0.1٪ السطحي. في وقت لاحق ، تم احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية تليها تلطيخ بالأجسام المضادة الثانوية. واستخدم نظام FACS لتحليل العينات. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن المواد العضوية المتباينة تستوعب أربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء (الشكل 2C). لذلك ، طورنا بروتوكول تمايز قريب لتوليد عضويات مجرى الهواء يمكنها محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة إلى مستوى شبه فسيولوجي.

لتمكين السطح القمي العضوي من الوصول إليه بسهولة ونمذجة أفضل لتعرض ظهارة مجرى الهواء البشري لمسببات الأمراض التنفسية ، قمنا بإنشاء طبقات أحادية 2D من المواد العضوية في مجرى الهواء. بعد أسبوعين من ثقافة التمايز ، طورت عضويات مجرى الهواء 2D حاجزا ظهاريا سليما (الشكل 3A ، B). أجرينا أيضا فحص انسداد ديكستران لتقييم سلامة الحاجز الظهاري المتشكل في عضويات مجرى الهواء 2D. في اليوم 10 بعد الزراعة في إدراج ترانسويل ، تمت إضافة الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران (MW 10,000) في وسط الغرفة العلوية وحضانتها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم حصاد وسائل الإعلام في الغرف العلوية والسفلية لإجراء فحص فلوري. يشير مؤشر انسداد ديكستران إلى شدة التألق للوسط في الغرفة العلوية مقابل تلك الموجودة في الغرفة السفلية (الشكل 3B). تحتوي هذه المواد العضوية ثنائية الأبعاد في مجرى الهواء أيضا على خلايا هدبية وفيرة (الشكل 3C). تم تصنيف الخلايا المذبذبة بواسطة الأجسام المضادة β-Tubulin IV (ACCTUB) والأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للفأر 488. تم الحصول على صور متحدة البؤرة باستخدام المجهر البؤري. تم الحصول على صور متعددة القنوات باستخدام أشعة الليزر 405 نانومتر ل DAPI ، و 488 نانومتر ل ACCTOB ، و 633/640 نانومتر ل Phalloidin. تم تعديل معلمات التصوير وفقا لدليل المستخدم الخاص بالمجهر البؤري. باختصار ، تم تعيين حجم الثقب إلى 1 وحدة فلكية ، وتم تعيين الكسب الرئيسي على 650 فولت إلى 750 فولت مع كسب رقمي قدره 1.0 ، وتم ضبط طاقة الليزر لكل قناة في نطاق 0.2٪ إلى 5٪. تم تنفيذ معالجة الصور باستخدام برنامج التحليل المقدم.

تصطف القناة التنفسية البشرية مع نوعين متميزين من الظهارة ، أي ظهارة مجرى الهواء والظهارة السنخية. الأول يبطن الشعب الهوائية من تجويف الأنف إلى القصيبات الطرفية ويتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا الظهارية ، أي الخلية الهدبية ، خلية الكأس ، خلية النادي ، والخلية القاعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر ظهارة مجرى الهواء المبطنة للممرات الهوائية القريبة والبعيدة تركيبة خلوية متغيرة على طول المحور القريب البعيد. ظهارة مجرى الهواء القريب زائفة ، تتكون من خلايا هدبية وفيرة وخلايا كأسية تفرز المخاط. في حين أن ظهارة مجرى الهواء البعيد هي طبقة واحدة من الخلايا الهدبية المكعبة والخلايا الهاربية مع خلايا قاعدية وكأسية أقل19. تم شراء أنسجة الرئة البشرية المستخدمة لاشتقاق عضويات الرئة من المرضى الذين خضعوا لعمليات استئصال جراحية بسبب أمراض مختلفة. نحن نستخدم أنسجة الرئة الطبيعية المجاورة للأنسجة المريضة للزراعة العضوية. تحتوي أنسجة الرئة هذه عادة على قصيبات ذات حجم متغير تحيط بها الأكياس السنخية. خلال الثقافة الأولية ، تبقى الخلايا الجذعية الظهارية في مجرى الهواء أو الخلايا السلفية للمجرى الهوائي في أنسجة الرئة وتتكاثر بسبب العوامل المتخصصة في وسط التمدد. يتيح وسيط التمدد الاشتقاق الأولي والتوسع طويل الأجل للعضويات الرئوية عن طريق توجيه المواد العضوية نحو حالة غير ناضجة ، في حين أن بروتوكول تمايز مجرى الهواء يولد عضويات مجرى الهواء التي تنسخ ظهارة مجرى الهواء الأصلية من الناحية المورفولوجية والوظيفية. النظام النموذجي، بما في ذلك اشتقاق وتوسيع وتمايز عضويات الرئة، موضحة في الشكل 4. كما يوضح الشكل 4 التركيب الخلوي في ظهارة مجرى الهواء القريب والبعيد.

الشكل 1: اشتقاق وتوسيع وتوصيف عضويات الرئة البشرية. (أ) تظهر صورة مصغرة تمثيلية خلايا مفردة مدمجة في مصفوفة الطابق السفلي بعد عزلها عن أنسجة الرئة في اليوم 0 (يسار). في اليوم 5 ، تنمو المواد العضوية الكيسية (يمين). شريط المقياس هو 0.5 مم. (B) صورة ميكروفوتوغرافية تمثيلية للعضويات الرئوية في يوم المقطع الرابع واليوم 5 بعد المرور. شريط الميزان 0.5 مم. يمثل P1 و P4 المقطعين الأول والرابع. تم التقاط الصور بتكبير 10x. (ج) صور متحدة البؤرة لأربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في عضويات الرئة البشرية. توجد أربعة سلالات من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في الخلايا العضوية الرئوية ، بما في ذلك الخلايا الهدبية ACCUB + و FOXJ1 + ، والخلايا القاعدية P63 + ، وخلايا نادي CC10 + ، وخلايا الكأس MUC5AC +. يتم تلطيخ النوى وخيوط الأكتين الخلوية ب DAPI (أزرق) و Phalloidin-647 (أرجواني) ، على التوالي. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التمايز القريب من عضويات الرئة البشرية. (أ) تم استزراع عضويات الرئة البشرية في وسط PD أو وسط التمدد (Exp) بالتوازي لمدة 16 يوما. يتم عرض الصور الدقيقة ذات المجال الساطع للعضويات في الأيام المشار إليها. شريط المقياس هو 0.4 مم. (B) تظهر الأهداب في عضويات مجرى الهواء المتمايزة (السهم الأسود). شريط المقياس هو 20 ميكرومتر (C) النسب المئوية لأنواع الخلايا الفردية في المواد العضوية المحتضنة في وسط PD (أعلى) ووسط تمدد (أسفل) كما تم اكتشافه بواسطة تحليل FACS. يتم عرض المدرج التكراري التمثيلي لخط عضوي واحد. تم إجراء التجربة في ثلاثة خطوط عضوية مختلفة. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: توليد عضويات مجرى الهواء المتمايزة ثنائية الأبعاد. (أ) تم قياس المقاومة الإلكترونية عبر الظهارية (TEER) في اليوم المشار إليه بعد الحضانة في وسط PD. تظهر البيانات متوسط الانحراف المعياري ± (SD) للطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد في 10 إدراجات. (ب) في اليوم 10 بعد الاستزراع في ألواح دعم قابلة للنفاذ، أضيفت فلوريسين إيزوثيوسيانات - ديكستران وتم حصاد الوسائط في الغرف العلوية والسفلية لإجراء فحص التألق بعد 4 ساعات. يشير مؤشر انسداد ديكستران إلى شدة التألق للوسط في الغرفة العلوية مقابل تلك الموجودة في الغرفة السفلية. يبلغ قطر إدخالات الدعم القابلة للنفاذ المستخدمة في تجربتنا 0.4 ميكرومتر. دون بذر أي خلايا ، يمكن للديكستران اختراق إدراج 2D الطبيعي بحرية. وبالتالي ، يجب أن يكون مؤشر انسداد dextran ل 2D العادي (الشريط المسمى بفارغ) 1. تمثل البيانات متوسط ± SD من 10 إدخالات مصنفة مع عضويات مجرى الهواء 2D (2D organoid) وتلك الموجودة في إدراجين فارغين (فارغ). (ج) صور متحدة البؤرة للخلايا الهدبية ACCTUB+ الوفيرة (الخضراء) في عضويات مجرى الهواء 2D. يتم تلطيخ خيوط الأكتين الخلوية مع Phalloidin-647 (الأرجواني). شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. وقد اعتمد هذا الرقم من13 عضوا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: رسم تخطيطي لاشتقاق وتوسع وتمايز عضويات الرئة البشرية. يتم تضمين الخلايا المفردة المعزولة من أنسجة الرئة البشرية مباشرة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التمدد العضوي للرئة. يمكن توسيع عضويات الرئة البشرية المشتقة على المدى الطويل مع استقرار عال واستعادتها بسهولة من المخزونات المحفوظة بالتبريد. عند التمايز ، يمكن للعضويات المولدة في مجرى الهواء محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة. تم تطوير عضويات مجرى الهواء 2D و 3D لمختلف التلاعب التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1. تدفع الأهداب الضاربة بشكل متزامن حطام الخلية إلى الدوران أحادي الاتجاه في عضويات مجرى الهواء المتمايزة13. تم اعتماد هذا الفيديو من13. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

تم إدراج J. Z. ، C.L. ، و M.C.C. كمخترعين في براءة اختراع المواد العضوية في مجرى الهواء (المنشور رقم: US-2021-0207081-A1). ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.