Method Article

تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء وضع العلامات على البروتين الخاص بنوع الخلية باستخدام أزيدونونورليوسين (ANL) باستخدام خط ماوس يعبر عن سينثيتاز L274G-Methionine tRNA المتحور (MetRS *) والخطوات اللازمة لعزل البروتينات الخاصة بنوع الخلية الموصوفة. نحدد طريقين محتملين لإدارة ANL في الفئران الحية عن طريق (1) مياه الشرب و (2) الحقن داخل الصفاق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم الاتزان الداخلي للبروتين في الجسم الحي أمرا أساسيا لمعرفة كيفية عمل الخلايا في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. يصف البروتوكول الحالي وضع العلامات في الجسم الحي والتنقية اللاحقة للبروتينات المركبة حديثا باستخدام خط فأر مهندس لتوجيه وضع العلامات على البروتين إلى مجموعات خلوية محددة. وهو خط قابل للتحريض عن طريق تعبير Cre recombinase ل L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS *) ، مما يتيح دمج أزيدونونورليوسين (ANL) في البروتينات ، والتي لن تحدث بخلاف ذلك. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، من الممكن تنقية البروتينات الخاصة بنوع الخلية المصنفة في الجسم الحي واكتشاف التغيرات الطفيفة في محتوى البروتين بسبب تقليل تعقيد العينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث توازن البروتين الشاذ بسبب اختلال التوازن في تخليق البروتين وتدهوره. ترتبط العديد من الأمراض بالتغيرات في توازن البروتين. السمة المميزة لبعض الأمراض هي وجود مجاميع في مواقع تحت خلوية مختلفة ومناطق الدماغ. الاتزان الداخلي للبروتين ليس مهما في المرض فحسب ، بل يلعب أيضا دورا مهما في الوظيفة الطبيعية للعضو والخلية1. على سبيل المثال ، تخليق البروتين ضروري للعديد من أشكال اللدونة العصبية 2,3 ، على النحو الذي يحدده استخدام مثبطات كيميائية تمنع تخليق البروتين4. ومع ذلك ، ليس من الواضح في أي أنواع الخلايا يتم تغيير البروتين لدعم التعلم والذاكرة ، ولا يفهم أي بروتينات ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بإذن من مكاتب الحكومة المحلية في ألمانيا (RP Darmstadt ؛ البروتوكولات: V54-19c20 / 15-F122 / 14 ، V54-19c20 / 15-F126 / 1012) أو إسبانيا (لجنة التجارب على الحيوانات في UCM والاستشارات البيئية في Comunidad de Madrid ، رقم البروتوكول: PROEX 005.0 / 21) ومتوافقة مع قواعد جمعية ماكس بلانك واللوائح الإسبانية وتتبع إرشادات الاتحاد الأوروبي لرعاية الحيوان.

1. وضع العلامات الأيضية في الجسم الحي مع ANL

  1. مياه الشرب:
    1. حل ANL والمالتوز في مياه الشرب العادية للفئران. تركيز المالتوز الموصى به هو 0.7٪ (بالوزن / المجلد). الحد الأقصى لكمية ANL المضافة إلى مياه الشرب هو 1٪ (بالوزن /....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع البروتوكول الموصوف (الملخص في الشكل 1) ، تم إعطاء ANL للفئران إما عن طريق الحقن داخل الصفاق يوميا (400 mM ANL 10 مل / كجم ، Nex-Cre :: MetRS *) لمدة 7 أيام ، أو عن طريق مياه الشرب (0.7٪ مالتوز ، 1٪ ANL ، CamkII-Cre::MetRS *) لمدة 21 يوما. بعد وضع العلامات ، تم تشريح مناطق الدماغ المقابلة ، وتحليلها ، وألكلتها ، والنقر عليها. تم تحليل تفاعلات النقر بواسطة SDS-PAGE و Western Immunoblot. يتم عرض صور تمثيلية للتجارب في الشكل 2 لإدارة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجوانب الحاسمة للبروتوكول هي ؛ إدراج الضوابط السلبية ، وجود ما يكفي من التكرارات البيولوجية ، ومسار إدارة ANL ، والكمية ، والمدة ، وألكلة العينات ، وتركيز الألكين ، والقضاء على β-mercaptoethanol عند استخدام DST-alkyne.

من المهم تضمين عينات التحكم السلبية الناتجة عن الحيوانات التي تحمل علامة ANL بدون سائق Cre وبالتالي لا يوجد تعبير MetRS *. يجب إخضاع هذه العينات لكل خطوة موصوفة في البروتوكول بالتوازي مع العينات المأخوذة من فئران MetRS * التي تحمل علامة ANL. العينات التي لم يتم النقر فوقها ليست.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل B.A-C من قبل وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I) ، من قبل مجتمع مدريد المتمتع بالحكم الذاتي (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) ، ومنح MICINN (PID2020-113270RA-I00). يتم تمويل R. A-P من قبل مجتمع مدريد المستقل (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057). يتم تمويل E.M.S. من قبل جمعية ماكس بلانك ، وهي جائزة الباحث المتقدم من مجلس البحوث الأوروبي (منحة 743216) ، DFG CRC 1080: الآليات الجزيئية والخلوية للتوازن العصبي ، و DFG CRC 902: المبادئ الجزيئية للتنظيم القائم على الحمض النووي الريبي. نشكر DC Dieterich و P. Landgraf على نصائحهم الفنية وتوليف DST-Alkyne. نشكر E. Northrup و S. Zeissler و S. Gil Mast ومرفق الحيوانات في MPI لأ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12٪ مواد هلامية من مادة الأكريلاميدGenScriptSurePAGE ، Bis-Tris ، 10 × 8 ، 12٪
بيتا ؛ MercaptoethanolSigmaM6250Toxic ؛ استخدم معطف المختبر والقفازات وغطاء الدخان.
بيكربونات الأمونيومSigma9830Toxic ؛ استخدم معطف المختبر والقفازات وغطاء الدخان
ANLSyntheized كما هو موضح سابقا ل AHA (انظر المراجع 5 و 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotin alkyneThermo ،B10185
الجسم المضاد للدجاج مضاد ل GFPAves1020
مثبط البروتياز الكامل الخالي من EDTARoche4693132001Toxic ؛ استخدم معطف المختبر والقفازات.
بروميد النحاس (I)سيجما25418599.999٪ (بالوزن / الوزن) علامة
ثاني كبريتيد (DST) - الألكينمركب كما ورد في المرجع رقم 15 ، والذي يشار إليه باسم المسبار 20
DMSOSigma276855
مرشحاتMerkSCGP00525
أسيتاميد اليود (IAA)SigmaI1149
IR مضاد للدجاج 800LI-CORIRDye 800CWالحمار المضاد للدجاج الأجسام المضادة الثانوية
IR المضادة للربيع 680LI-CORIRDye 680RDالماعز المضاد للأرانب IgG الجسم المضاد
الثانوي المالتوزSigmaM9171
خلاط يدويBioSpec المنتجات1083
NaClSigmaS9888
N-ethylmaleimideSigma4259سام; استخدم معطف المختبر والقفازات وغطاء الدخان.
حبات NeutrAvidinبيرس29200
غشاء النيتروسليلوزBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8التحضير الموصوف في الرقم المرجعي 5
أعمدة SpinTrap G-25 GEHealthcareBuffer
Exchange Pierce BCA Protein Assay KitThermo،23225الكواشف الموجودة في مجموعة فحص البروتين Pierce BCA سامة للحياة المائية.
الأرنب متعدد النسيلة الأجسام المضادة للبيوتينإشارات الخلية5597
غشاء PVDFMilliporeIPVH00010
SDS 10٪Sigma71736
SDS-PAGE  تشغيل المخزن المؤقت MOPSGenScriptM00138
SYPRO روبي وصمة عارSigmaS4942
الجدول التلقائي دوامةEppendorfMixmate
Triazole ligandSigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502درجة البيولوجيا الجزيئية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles