مقالة منهجية

نوع الألياف والتحليل الخاص بالخلايا لمحتوى قطرات الدهون في العضلات الهيكلية

DOI:

10.3791/63718

⸱

يونيو 8, 2022

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن التسلل المفرط للدهون داخل العضلات الهيكلية يؤدي إلى السمية الدهنية ومرض السكري. هنا ، نقدم بروتوكولا كاملا ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، والتلطيخ باستخدام Bodipy ، والحصول على الصور ، وتحليلها ، لتحديد حجم وكثافة وتوزيع قطرات الدهون تحت الخلوية بطريقة محددة من نوع الألياف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. كما تم اكتشاف Myosteatosis مؤخرا كعامل تنبؤي سلبي للعديد من الاضطرابات الأخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان. التسلل المفرط للدهون يقلل من كتلة العضلات وقوتها. كما أنه يؤدي إلى السمية الشحمية ومقاومة الأنسولين اعتمادا على إجمالي محتوى الدهون داخل الخلايا ، ومورفولوجيا قطرات الدهون (LD) ، والتوزيع دون الخلوي. نوع الألياف (المؤكسد مقابل تحلل السكر) مهم أيضا ، لأن الألياف المؤكسدة لديها قدرة أكبر على استخدام الدهون. بسبب آثارها الحاسمة في الفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات LD ووظيفتها بطريقة خاصة بنوع الألياف.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول كامل لتحديد كمية محتوى الدهون intramyocellular وتحليل مورفولوجيا LD والتوزيع دون الخلوي بطريقة خاصة بنوع الألياف. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تلطيخ عمليات تبريد العضلات التسلسلية بصبغة الفلورسنت Bodipy والأجسام المضادة ضد متساوي السلسلة الثقيلة الميوسين. يتيح هذا البروتوكول المعالجة المتزامنة للعضلات المختلفة ، وتوفير الوقت وتجنب القطع الأثرية المحتملة ، وبفضل ماكرو شخصي تم إنشاؤه في فيجي ، أصبح من الممكن أيضا أتمتة تحليل LD.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. يرتبط Myosteatosis سلبا بكتلة العضلات وقوتها ومع حساسية الأنسولين1. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أنه يمكن استخدام درجة تنخر العظم العضلي كعامل تنبؤي لحالات أخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية2 أو مرض الكبد الدهني غير الكحولي3 أو السرطان4. يمكن أن تتراكم الدهون في العضلات الهيكلية بين ألياف العضلات كدهون خارج الخلية أو داخل الألياف ، مثل الدهون داخل الخلايا (IMCLs). يتم تخزين IMCLs في الغالب كدهون ثلاثية في قطرات الدهون (LDs) التي تستخدم كوقود استقلابي أثناء التمرين البدني 5,6. ومع ذلك ، عندما يتجاوز عرض الدهون الطلب ، أو عندما تصبح الميتوكوندريا مختلة وظيفيا ، فإن IMCLs سوف تكون متورطة في مقاومة الأنسولين العضلي ، كما هو موضح في الأفراد غير الأصحاء والسمنة الأيضية وفي مرضى السكري من النوع 27. ومن المثير للاهتمام ، أن رياضيي التحمل لديهم مستويات مماثلة ، إن لم تكن أعلى ، من IMCLs لتلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة مع داء السكري من النوع 2 ، مع الحفاظ على حساسية عالية للأنسولين. توصف هذه الظاهرة بأنها "مفارقة الرياضي"8,9 ، ويتم تفسيرها من خلال تقييم أكثر دقة ل LDs العضلات ، المتعلقة بحجمها وكثافتها وتوطينها وديناميكياتها وتكوين أنواع الدهون.

أولا ، يرتبط حجم LD عكسيا بحساسية الأنسولين واللياقة البدنية10,11. في الواقع ، تظهر LDs الأصغر مساحة سطح أكبر نسبيا لعمل الليباز ، وبالتالي ، من المحتمل أن يكون لها قدرة أكبر على تعبئة الدهون12. ثانيا ، تلعب كثافة LD (العدد / السطح) دورا مثيرا للجدل في عمل الأنسولين 8,10 ؛ ومع ذلك ، يبدو أنه يزداد في الرياضيين. ثالثا ، يعد التوطين تحت الخلوي ل LDs مهما ، لأن LDs الموجودة أسفل الغشاء السطحي مباشرة (تحت الساركوليمال أو المحيطي) تمارس تأثيرا أكثر ضررا على حساسية الأنسولين من تلك المركزية 8,9,13. وتوفر هذه الأخيرة الوقود للميتوكوندريا المركزية، التي لديها نشاط تنفسي أكبر وأكثر تخصصا لتلبية الطلب المرتفع على الطاقة اللازم للانكماش14. وعلى النقيض من ذلك، توفر LDs الطرفية الميتوكوندريا تحت الساركوليمالية، التي تشارك في العمليات المتعلقة بالأغشية8. أخيرا ، بالإضافة إلى الدهون الثلاثية ، قد تكون الدهون المعقدة المحددة داخل العضلات أكثر ضررا من غيرها. على سبيل المثال ، قد يتراكم diacylglycerol و acyl-CoA طويل السلسلة والسيراميد في العضلات عندما يكون معدل دوران الدهون الثلاثية منخفضا ، مما يضعف إشارات الأنسولين 9,15. بالعودة إلى "مفارقة الرياضي" ، فإن رياضيي التحمل لديهم عدد كبير من LDs المركزية الأصغر حجما مع معدلات دوران مرتفعة في ألياف النوع الأول (المؤكسد) ، في حين أن مرضى السمنة والسكري لديهم LDs محيطية أكبر مع معدلات دوران منخفضة في ألياف النوع الثاني (السكري)8،15،16. بالإضافة إلى دورها في تخزين الطاقة وإطلاقها ، يمكن أن تعمل LDs عبر الأحماض الدهنية المشتقة (FA) وبروتين المعطف (perilipin 5) أيضا كلاعبين حاسمين يشاركون في التنظيم النسخي لأكسدة FA والتكوين الحيوي للميتوكوندريا8. بسبب آثارها الحاسمة في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات ووظائف LDs.

على الرغم من وجود العديد من التقنيات لدراسة IMCLs ، إلا أنها ليست جميعها مناسبة لتحديد حجم LD وكثافته وتوزيعه بدقة بطريقة خاصة بالألياف. على سبيل المثال ، يوفر تقييم IMCLs بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي ، على الرغم من كونه غير غازي ، مستوى من الدقة لا يكفي لدراسة حجم LDs وموقعها الدقيق داخل الألياف ، وليس من نوع الألياف المحدد17,18. وبالمثل ، لا يمكن للتقنيات الكيميائية الحيوية التي يتم إجراؤها على متجانسات العضلات بأكملها19 تقييم موقع وحجم الدهون. وبالتالي ، فإن الطريقة الأكثر ملاءمة لتحليل مورفولوجيا LD وموقعها هي المجهر الإلكتروني للإرسال الكمي13 ، ولكن هذه التقنية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. لذلك ، برز التصوير الفلوري البؤري على المستحضرات ذات الأصباغ مثل Oil Red O (ORO) 20,21 أو monodansylpentane (MDH)22 أو Bodipy 23,24,25 كأفضل أداة لهذه الدراسات.

هنا ، يتم وصف بروتوكول كامل ، بما في ذلك أخذ عينات الأنسجة ومعالجتها ، وتلطيخ Bodipy ، والحصول على الصور البؤرية وتحليلها لتحديد حجم LD وعددها وتوطينها في عمليات تبريد عضلات الفأر. نظرا لأن IMCLs لا يتم توزيعها بالتساوي بين الألياف المؤكسدة وتحلل السكر ، وينظم كل نوع من أنواع الألياف ديناميكيات LD بشكل مختلف ، يجب أن تكون دراسة IMCLs محددة من نوع الألياف 16,25,26,27. لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول التألق المناعي على الأقسام التسلسلية لتحديد متساوي (أشكال) سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) التي تعبر عنها كل ألياف. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي المعالجة المتزامنة ل glycolytic (الباسطة digitorum longus ، EDL) وعضلة مؤكسدة (وحيد) موضوعة جنبا إلى جنب قبل التجميد (الشكل 1). هذه المعالجة المتزامنة لا توفر الوقت فحسب ، بل تتجنب أيضا التباين بسبب المعالجة المنفصلة للعينات.

مخطط بروتوكول لتجميد الأنسجة والاستئصال بالتبريد. رسم تخطيطي مع الكيمياء المناعية والفحص المجهري.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. بعد تشريح العضلات (1) ، يتم تحضير العضلات المختارة ذات الحجم المماثل وتجميدها معا (2). يتم الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية من 10 ميكرومتر باستخدام cryostat ومثبتة مباشرة على شرائح الالتصاق (3). من شريحتين تسلسليتين ، الأولى (4A) مناعية للأمينين وملطخة ب Bodipy للتعرف على LDs والثانية (4B) ملطخة بالمناعة بالأجسام المضادة ضد MyHCs للتعرف على أنواع الألياف العضلية. يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة ل Bodipy (5A) ومجهر epifluorescence لأنواع ألياف العضلات (5B). يتم تحليل الصور في فيجي من خلال تطبيق عتبة وتحديد كمية الجسيمات (6A) للحصول على العدد ومتوسط الحجم والكثافة والنسبة المئوية من المساحة الإجمالية التي تشغلها LDs (7) أو خلايا العد (6B) للحصول على النسبة المئوية للألياف من كل نوع في القسم (7). الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات من القطاع الطبي في الجامعة الكاثوليكية في لوفان (2019/UCL/MD/013).

1. تشريح وإعداد العينات للتجميد

  1. ضع علامة على قطعة من الفلين بسماكة 3 مم لكل زوج من العضلات.
  2. من خلال شق صغير مصنوع من شفرة في وسط الفلين ، أدخل بشكل عمودي قطعة مستطيلة من البلاستيك الصلب (0.5 سم عرض ، 1 سم ارتفاع) ستكون بمثابة دعم (الشكل 2B).
    ملاحظة: يعتمد حجم القطعة البلاستيكية المستطيلة على حجم العضلات. هنا ، يتم تكييف الأبعاد الموصوفة مع حجم النعل (~ 9 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) و EDL (~ 5 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) من فأر ذكر C57BL / 6J عمره 3 أشهر.
  3. في وقت التشريح ، قم بإزالة النعل و EDL من الطرف الخلفي للماوس. لمنع العينات من الجفاف أثناء التشريح ، ضعها على ضغط مبلل قليلا بمحلول ملحي في طبق بتري يوضع على الثلج.
    ملاحظة: انظر Wang et al.28 للحصول على تفسيرات حول كيفية تشريح هاتين العضلتين الطرفيتين.
  4. ضع قطرة صغيرة من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) عند تقاطع الفلين / البلاستيك ، وتجنب فقاعات الهواء.
  5. تخلص من الرطوبة الزائدة من العينات عن طريق تجفيفها بلطف بمنشفة ورقية (الشكل 2A) ووضع كلتا العضلتين على البلاستيك عموديا على الفلين (الشكل 2C).
  6. تحقق من اتجاه الألياف العضلية العضلية تحت مجهر ستيريو (الشكل 2D).
    ملاحظة: من المهم عدم تغطية العضلات ب OCT ، لأن تأثيرها العازل سيمنع التجميد السريع وسينتج عنه قطع أثرية مجمدة.

2. تجميد عينات العضلات الهيكلية للاستئصال بالتبريد

تحذير: يجب أن يتم تجميد العضلات تحت غطاء كيميائي ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (انظر جدول المواد).

  1. استخدم بهلوان من الفولاذ المقاوم للصدأ (~ 8 سم ارتفاع ، 6 سم Ø) مع شريطين جانبيين متصلين به بطول 25 سم على الأقل (الشكل 2F) ، واملأ البهلوان حتى 2/3 من سعته بالأيزوبنتان.
  2. أمسك البهلوان من الأشرطة ، واغمره بلطف في صندوق بوليسترين مملوء بالنيتروجين السائل بحيث يكون مستوى النيتروجين خارج الحاوية أعلى من مستوى الأيزوبنتان في الداخل (الشكل 2F ، G).
    تنبيه: عندما يتلامس البهلوان مع النيتروجين ، قد تتسبب الصدمة الحرارية في الدوران. تأكد من أن البهلوان مغمور بما فيه الكفاية ولكن تجنب دخول النيتروجين لأن هذا من شأنه أن يسبب هطول الأمطار isopentane. إذا حدث هذا ، دع الأيزوبنتان يبرد ، واملأ البهلوان بالأيزوبنتان الجديد وابدأ من جديد.
  3. عندما يكون الجزء الداخلي من البهلوان مغطى بالكامل بطبقة صلبة بيضاء من الأيزوبنتان ، أخرجه من صندوق النيتروجين السائل (الشكل 2H).
    ملاحظة: درجة حرارة انصهار الأيزوبنتان هي -159 درجة مئوية ، وسوف تتحول حواف البهلوان إلى اللون الأبيض عندما يكون الجو باردا بما فيه الكفاية.
  4. حرك بلطف قطع الأيزوبنتان الصلبة في الأيزوبنتان السائل المتبقي مع ملقط حتى يصبح الحجم بأكمله سائلا مرة أخرى.
  5. أعد غمر البهلوان في النيتروجين السائل حتى يشكل الأيزوبنتان حصى بيضاء في جميع أنحاء الجزء السفلي وحواف البهلوان (الشكل 2G ، H).
    ملاحظة: تضمن خطوة التبريد الثانية هذه درجة حرارة التجميد المناسبة للأيزوبنتان.
  6. قم بإزالة البهلوان من النيتروجين السائل وقم بغمس العضلات بسرعة في الجزء السفلي من البهلوان ، مع الاحتفاظ بالفلين باستخدام ملاقط أسنان الفئران. قم بتدوير الفلين لمدة 15 ثانية في الأيزوبنتان وخزنه عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة (الشكل 2I).
    ملاحظة: بالنسبة للتخزين على المدى القصير ، يمكن الاحتفاظ بالعينات في ثلاجة -20 درجة مئوية. تم بالفعل نشر البروتوكول الكامل للتجميد السريع للعضلات الهيكلية في مكان آخر. للاطلاع على المراجع التفصيلية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر: Meng et al.29, Kumar et al.30, and Leiva-Cepas et al.31.

3. التقسيم بالتبريد

  1. أحضر العينات إلى حجرة كريوستات تم تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية وضبطت درجة حرارة الشفرة على -25 درجة مئوية.
    ملاحظة: انقل العينات من الفريزر -20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية إلى كريوستات في صندوق بوليسترين مملوء بالثلج الجاف واسمح للعينات بالتوازن لمدة 20-30 دقيقة على الأقل إلى درجة حرارة الغرفة قبل القطع.
  2. قم بإزالة البلاستيك من الفلين باستخدام ملاقط دقيقة وضع قرص عينة cryostat على لوحة التجميد السريع ليبرد. بمجرد أن تصل اللوحة إلى -50 درجة مئوية ، ضع بعض OCT على القرص وضع الفلين بسرعة أعلى القرص ، مع الضغط بإحكام. انتظر حتى يتصلب OCT ويتم تثبيت الفلين جيدا على القرص.
  3. ضع القرص على رأس الكائن في اتجاه القطع المطلوب (الشكل 2J ، K) وقم بتقليم كتلة العضلات إلى ما بعد 1/3 على الأقل من طول العضلات وحتى يصبح كلا المقطعين العرضيين للعضلات مرئيين.
  4. اضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر وضع قسم واحد على شريحة التصاق للتحقق من الاتجاه الصحيح للألياف على مجهر ساطع.
    ملاحظة: يعد التحقق من الاتجاه العرضي للألياف أمرا بالغ الأهمية. إذا لم تكن الألياف موجهة بشكل كاف ، فاضبط زاوية رأس الكائن ، وقطع قسم آخر وتحقق مرة أخرى.
  5. ضع مقطعين عرضيين تسلسليين على شريحتين للالتصاق مصنفتين مسبقا: شريحة واحدة لتحديد أنواع الألياف ، والأخرى لتحديد محتوى الدهون (الشكل 2L).
    ملاحظة: يمكن الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية إضافية والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية للدراسات النسيجية الأخرى. ومع ذلك ، لتجنب تغيير محتوى الدهون والتشكل داخل الخلايا24 ، من الضروري معالجة أول شريحتين مباشرة بعد القطع لمنع تجفيف الهواء. إن تجميد وإذابة الشرائح من أجل تحديد كمية LD سيكون له نفس التأثير وبالتالي فهو غير مستصوب للغاية.

4. كتابة الألياف وتلطيخ Bodipy

  1. الكشف عن المناعة النسيجية الكيميائية لنوع الألياف العضلية
    ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي ، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة 1 سنت.
    1. أحط الأقسام بمخطط مرسوم بقلم مسعور وشطف بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول الحجب (10٪ مصل الماعز العادي (NGS) و 1:30 ماوس على كاشف مانع الماوس (MOM) في PBS).
    2. قم بإزالة محلول الحجب واحتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (5٪ NGS ، كاشف حجب MOM 1:30 MOM ، الأجسام المضادة الأولية للفأر للتعرف على النوع الأول (IgG2b ، في 1:10) ، النوع IIa (IgG1 ، في 1:10) ، والنوع IIx (IgM ، في 1:5) الألياف والفئران المضادة للصفح (سلسلة α2 ، 1:1,000) في PBS.
    3. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
    4. احتضان الشرائح في الظلام لمدة ساعة واحدة في RT باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد IgG2b AF405 (1:500) ، الماعز المضاد IgG1 AF488 (1:500) ، الماعز المضاد IgM AF568 (1:1000) ، والماعز المضاد للصفيحة AF647 (1:500) في PBS).
      تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
    5. اغسل مرة أخرى 3 × 5 دقائق في PBS ، واشطف في H2O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
      ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة. نظرا لأن الشرائح غير ثابتة ، فمن المستحسن استخدام حلول حديثة الصنع لكل تجربة ، وتعقيم PBS ، والحصول على الصور في أقرب وقت ممكن لتجنب تلوث الأقسام.
  2. تلطيخ LDs مع Bodipy
    ملاحظة: على غرار الخطوة 4.1.، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة معدنية من فئة 1 سنت.
    1. أحط الأقسام بمخطط رسمه قلم مسعور واشطفه بالثلج 0.1 M PBS لمدة 10 دقائق في RT. استخدم PBS البارد المثلج لجميع الشطف والغسيل.
    2. إصلاح مع الباردة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) دون الميثانول لمدة 10 دقائق في RT. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
      تنبيه: نفذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك كيميائي.
    3. ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 1 ساعة في RT مع 5٪ NGS في PBS.
    4. احتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية بمحلول الجسم المضاد الأساسي (2٪ NGS والفئران المضادة للأمينين (سلسلة α2 ، 1: 1000) في PBS). اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
      تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
    5. احتضان لمدة 1 ساعة في RT مع محلول الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الماعز المضادة المضادة للفئران AF647 (1:500) في PBS. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
    6. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT بمحلول 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.5 μg/mL) وBODIPY (1 ميكروغرام/مل) في PBS.
      ملاحظة: لتحضير محلول المرق BODIPY ، قم بإذابته في DMSO بتركيز 1 ملغ / مل. تتوفر تركيبات Bodipy مختلفة تجاريا لتلطيخ LD. اعتمادا على الاختيار الذي تم إجراؤه ، فإن طريقة التلطيخ هي نفسها (نفس الخطوات والتركيز ووقت الحضانة) ؛ ومع ذلك ، فإن طريقة الاستحواذ ستكون مختلفة قليلا.
    7. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT ، واشطفها في H2O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
      ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة.

5. الحصول على الصور

ملاحظة: بمجرد الانتهاء من بروتوكولات التلطيخ ، من المهم المتابعة الفورية للحصول على الصور (خلال 24 ساعة التالية) ، ليس فقط لتجنب التلوث ولكن أيضا للحفاظ على مورفولوجيا وحجم وعدد LDs.

  1. الحصول على صور لتقييم أنواع الألياف لكل عضلة تم أخذ عينات منها
    ملاحظة: يمكن تحقيق هذه الخطوة باستخدام مجهر المسح الضوئي الفلوري كامل الشريحة أو باستخدام مجهر التألق التقليدي. مع هذا الأخير ، يجب إجراء خياطة يدوية أو آلية للصور لإعادة بناء القسم.
    1. للتعرف على نوع الألياف ، استخدم مجهر epifluorescence مع هدف 10x / 0.3. حدد مرشحات الإثارة ل DAPI (405 نانومتر) و FITC و TRITC و Cy5 للكشف عن ألياف النوع I و IIa و IIx و laminin ، على التوالي.
      ملاحظة: لن تكون الألياف من النوع IIb مناعية. سيتم التعرف عليها على أنها ألياف ملطخة باللامينين على حدود ساركوليما مع ساركوبلازما سوداء.
    2. اضبط وقت التعرض المناسب لكل قناة.
    3. عند استخدام مجهر epifluorescence التقليدي ، احصل دائما على صور العضلة بأكملها باتباع نفس الترتيب لتسهيل إعادة بناء العضلات. تأكد من أن الألياف الموجودة على الحافة اليمنى لصورة واحدة تظهر أيضا على الحافة اليسرى للصورة التالية. وينطبق الشيء نفسه على الأجزاء العلوية والسفلية من الصور (الشكل 3A).
      ملاحظة: كمرجع، بالنسبة لقسم من EDL أو النعل الذي تم تشريحه من فأر عمره 3 أشهر، سيغطي متوسط ست وثماني صور، على التوالي، المقطع العرضي للعضلات بأكمله.
    4. بعد مسح العضلات، قم بتحميل الصور الرقمية الملتقطة في أي برنامج لمعالجة الصور لإعادة الإعمار (الخياطة)، استنادا إلى مورفولوجيا الألياف (laminin) وعلم الأنسجة لقسم العضلات، واحفظها كملف TIFF أو PNG أو JPG مع دمج جميع القنوات (الألوان) (الشكل 3A).
  2. الحصول على الصور مع اللامينين و Bodipy تلطيخ مشترك
    ملاحظة: للتعرف على نوع الألياف والحصول على تقدير لعدد الألياف لكل نوع تم التقاطه ، من الضروري إجراء مسح ضوئي لقسم الألياف بالفعل وإعادة بناء العضلات قبل البدء في الحصول على صورة Bodipy-laminin (الشكل 3B).
    1. لمراقبة الصورة واقتنائها من Bodipy، استخدم مجهرا متحد البؤرة مع عدسة هدف غمر الزيت 40x مع فتحة عددية تبلغ 1.4.
    2. استخدم الإعدادات التالية: ثقب عند 1 وحدة فلكية، ودقة 2,048 بكسل × 2,048 بكسل، وحجم البكسل عند 0.08 ميكرومتر، والوضع أحادي الاتجاه، وسرعة المسح الضوئي عند 4 (~4 ميكروثانية/بكسل)، وضبط متوسط الخط على 4x، وضبط التكبير/التصغير الرقمي على 1.
    3. لتجنب الحديث المتبادل بين Bodipy-558/568 و laminin-AF647، استخدم وضع المسح المتسلسل على البرنامج البؤري.
      ملاحظة: عندما تكون الصبغة المختارة هي Bodipy-493/503 ، يكون المسح الضوئي بالليزر البؤري المتزامن ممكنا بدون محادثة متقاطعة بين قناة Bodipy وقناة laminin-AF647. هذا سوف يسرع من الحصول على الصور.
    4. إثارة Bodipy-493/503 باستخدام خط الليزر 488 نانومتر أو خط ليزر الأرجون ، وإثارة Bodipy-555/568 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر. أخيرا ، اكتشف laminin-AF647 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 640 نانومتر.
      تنبيه: ضع في اعتبارك أن جزيئات Bodipy حساسة جدا للتبييض الضوئي ، لذا تجنب المسح الضوئي بالليزر غير الضروري. للتعرف على الألياف ، استخدم الليزر فقط للأمينين.
    5. اعتمادا على الصبغة المختارة ، اضبط نطاقات الانبعاثات على 570-650 نانومتر ل Bodipy-493/50324 وعند 565-620 نانومتر ل Bodipy-558/568. اضبط نطاق انبعاث اللامينين عند 656-700 نانومتر.
    6. اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب حتى لا يتم اكتشاف وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق. قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة.
      ملاحظة: يجب تحسين اختيار المرشح ومعلمات المسح الضوئي الأخرى المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤرة. من المهم أن تظل جميع الإعدادات المذكورة أعلاه ثابتة لجميع الصور التي تم التقاطها من العينات المراد مقارنتها.
    7. لتحديد نوع الألياف بين تلك التي تم تصورها على المجهر البؤري ، استخدم جهاز كمبيوتر محمول شخصي أعيد بناء صورة القسم عليه بعد فحص الكشف المناعي من نوع الألياف (الشكل 3B).
    8. بمجرد تحديد مجموعة من الألياف بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات Bodipy و laminin.
      ملاحظة: يوصى بتدوين اسم صورة Bodipy-laminin على منطقة العضلات حيث توجد هذه الألياف على الصورة التي تم الحصول عليها للتعرف على MyHC لتسهيل التحليل اللاحق للألياف الخاصة ب LDs.

6. تحليل الصور

  1. تحليل أنواع الألياف على كل عينة عضلية
    1. في فيجي (أو ImageJ)32 ، افتح ملف TIFF أو PNG أو JPG مع العضلات المعاد بناؤها التي تم الحصول عليها من دمج جميع القنوات المستخدمة للكشف عن أشكال الألياف.
    2. لبدء أداة عد الخلايا ، انقر فوق المكونات الإضافية | تحليل | | عداد الخلايا عداد الخلايا.
    3. في نافذة عداد الخلايا ، انقر فوق الإجراءات | تهيئة.
    4. ضمن عدادات في نفس النافذة، حدد النوع 1.
    5. في النافذة الرئيسية في فيجي، حدد أداة العصا .
    6. لتحديد عدد الألياف من كل نوع ، انقر فوق كل ألياف من نفس النوع ، بحيث يسجل البرنامج عدد الألياف التي تم النقر عليها.
    7. بمجرد الانتهاء ، حدد النوع التالي من الألياف وكرر نفس الخطوات.
    8. عندما يتم تعيين جميع ألياف الصورة إلى نوع معين من الألياف ، انقر فوق النتائج في نافذة عداد الخلايا لعرض النتائج في جدول.
    9. احفظ هذا الجدول كجدول بيانات بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة النتائج .
    10. احفظ التحديدات وأعد تحميلها على نفس الصورة في أي وقت بالنقر فوق حفظ العلامات أو علامات التحميل، على التوالي، في نافذة عد الخلايا .
  2. تحليل قطرات الدهون بطريقة تعتمد على نوع الألياف
    1. تحليل صور Bodipy و laminin التي تم الحصول عليها على البؤرة باستخدام فيجي لتحديد كمية LDs.
      ملاحظة: صمم المؤلفون ماكرو مخصص لأتمتة التحليل. يتوفر هذا الماكرو، إلى جانب شرح خطوة بخطوة حول كيفية استخدامه، كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2، على التوالي.
    2. افتح كل صورة بمساعدة مستورد التنسيقات الحيوية من فيجي. ضمن الخيار عرض المكدس باستخدام ، حدد Hyperstack | وضع اللون، افتراضي. تأكد من تحديد نافذة القياس التلقائي .
      ملاحظة: ستصف الخطوات التالية بروتوكول تحليل ألياف واحدة على الصورة، ولكن يجب تكرارها عدة مرات مثل عدد الألياف الكاملة التي تظهر على الصورة.
    3. استخدم أداة التحديد الحر لتحديد ساركوليما الألياف يدويا استنادا إلى قناة laminin (الشكل 4A) واضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل التحديد أو منطقة الاهتمام (ROI) في نافذة عائد الاستثمار.
    4. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | اضبط القياسات، وفي النافذة المنبثقة، حدد المنطقة وقطر Feret. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
    5. انقر فوق قياس في نافذة عائد الاستثمار للحصول على المساحة وقطر الحد الأدنى من Feret (MF) للألياف المحددة ، وقم بتدوينها لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: عند تحليل LDs ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن حجمها وكثافتها تختلف بين المركز ومحيط الألياف (المنطقة تحت الساركوليمالية-SS). لذلك ، يجب أن يتم التحليل بشكل منفصل.
    6. احسب قيمة 1/6 من MF لتحديد الجزء المركزي من الألياف.
      ملاحظة: في الماكرو، يتم تعيين قيمة MF الافتراضية إلى 6، مما يعني أنه سيتم تعيين التخفيض المطبق ك 1/6 من MF. تم اختيار هذه القيمة بناء على البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من وحيد الحيوانات التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون. ومع ذلك ، يجب على كل باحث تغيير هذا الرقم بناء على البيانات التجريبية والعضلات التي تم تحليلها ، ونوع الألياف ، وحالة الحيوان.
    7. في نافذة عائد الاستثمار ، انقر فوق إضافة للحصول على نسخة مكررة من عائد الاستثمار الأول وحدد عائد الاستثمار الثاني الذي يظهر على النافذة.
    8. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحرير | | الاختيار قم بتكبير القيمة المحسوبة مسبقا وتقديمها (من الخطوة 6.2.6.) باستخدام علامة ناقص قبل الرقم وانقر فوق موافق. في نافذة عائد الاستثمار، انقر فوق إضافة[t] (يجب أن يظهر عائد استثمار ثالث) وحذف، لحذف عائد الاستثمار الثاني.
      ملاحظة: يمكن للباحث التحقق من النتائج من خلال النقر على المربع إظهار الكل في نافذة عائد الاستثمار . عند هذه النقطة ، يجب أن يظهر عائد استثمار ، أحدهما يحيط بمحيط الألياف بالكامل (الشكل 4B) والآخر يتم وضعه في الوسط (الشكل 4C).
    9. حدد كل من عائد الاستثمار في نافذة عائد الاستثمار وانقر على المزيد من | | XOR إضافة[ر]. انتظر حتى يظهر عائد استثمار ثالث ، والذي يتوافق مع محيط الألياف (الشكل 4D).
    10. احفظ عائد الاستثمار من خلال النقر على مزيد من | حفظ لحفظ عائد الاستثمار في حالة الحاجة إلى إعادة تحليل لاحقة لنفس الألياف.
    11. حدد قناة Bodipy وافتح أداة العتبة بالنقر فوق صورة | ضبط | عتبة على النافذة الرئيسية في فيجي.
    12. في النافذة المنبثقة العتبة ، اضبط القيم على 70/255، وحدد الين | طريقة B&W، وانقر على الخلفية الداكنة | تطبيق.
      ملاحظة: قد تختلف القيم المطبقة على العتبة وفقا لظروف التجربة ويجب تعيين العتبة بشكل مناسب لتحسين التحليل. يجب أن تظهر نافذة B&W التي تحتوي على إشارة Bodipy أعلى من حد العتبة الموضح باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود (قارن صورة Bodipy الأصلية في الشكل 4E بالصورة الموجودة في الشكل 4F).
    13. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | قم بتعيين القياسات وفي النافذة المنبثقة، حدد المساحة وجزء المساحة والحد إلى العتبة. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
      ملاحظة: إذا أراد الباحث تحليل "دائرية" LDs ، وهو مؤشر للمورفولوجيا الكروية التي تتراوح من 1 للكرة المثالية إلى 0 لخط ، فانقر فوق مربع واصفات الشكل في النافذة المنبثقة مجموعة القياسات .
    14. انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار وحدد عائد الاستثمار الأول. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحليل | أداة تحليل الجسيمات.
      ملاحظة: تحدد هذه الأداة عدد المساحة الإجمالية التي تغطيها الجسيمات في كل تحديد وحجمها ومساحتها المغطاة ونسبتها المئوية وتحفظ النتائج كملف جدول بيانات.
    15. اضبط القيم من 2 إلى ما لا نهاية (2-إنفينيتي) في نافذة تحليل الجسيمات، وحدد مربع البيكسلات، واحتفظ بقيم الدائرية الافتراضية، وحدد تلخيص، وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: للتحقق من النتائج على الألياف، ضمن الخيار إظهار ، حدد أيا من الخيارات المتاحة. للتعرف على معلومات كل LD على التحديد في جدول، حدد خيار عرض النتائج في نافذة تحليل الجسيمات . يتم حساب متوسط نتائج تحليل المساحة الكلية للألياف وتلخيصها في جدول يحتوي على عدة أعمدة (العد ، المساحة الكلية ، متوسط الحجم ، النسبة المئوية للمساحة ؛ هذه تتوافق مع عدد الجسيمات [LDs] ، المساحة التي تشغلها هذه الجسيمات ، متوسط حجمها ، والنسبة المئوية للمساحة الكلية للاختيار الذي تشغله الجسيمات ، على التوالي). لحساب الكثافة، اقسم عدد الجسيمات على المساحة الإجمالية لكل اختيار.
    16. للحصول على قيم مركز الألياف ومحيطها، كرر الخطوتين 6.2.14 و6.2.15، مع تحديد الثاني (الوسط) والعائد على الاستثمار الثالث (المحيط) في كل مرة.
    17. احفظ النتائج بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة الملخص .
      ملاحظة: قم بتضمين نوع الألياف والحالة واسم الصورة على الاسم المعين للنتائج لتسهيل التوحيد اللاحق والتحليل الإحصائي للبيانات. لتحليل بقية الألياف في نفس الصورة، كرر الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.17. للتحليل الإحصائي ، يجب تحليل ما لا يقل عن 10-15 ألياف من كل نوع لكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد كمية LDs بسهولة في نوع الألياف وبطريقة خاصة بالخلايا الفرعية. ويبين كيف أنه من خلال تجميد عضلتين متشابهتين في الحجم، مثل مؤسسة كهرباء لبنان والوحيد، يتم تقليل الوقت والموارد التي تنفق على الخطوات التالية بمقدار النصف.

يتم توفير بروتوكول كامل للتلطيخ المناعي ، والحصول على الصور ، وتحليل الأشكال المختلفة MyHC المعبر عنها في عضلات الفئران البالغة. يعتمد هذا البروتوكول على البروتوكول الذي صممه Schiaffino et al. لأول مرة في عام 19893<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة فعالة لقياس LDs الموسومة ب Bodipy على أساس نوع الألياف وتحت الخلوية. في السنوات الأخيرة ، تم استبدال الأصباغ الدهنية الكلاسيكية ، مثل ORO أو Sudan Black B ، بمجموعة جديدة من الأصباغ الفلورية النفاذة للخلايا والمحبة للدهون التي ترتبط بالدهون المحايدة (على سبيل المثال ، Bodipy). متوفر كمترافقات مختلفة ، وقد أثبت Bodipy فعاليته الكبيرة في وضع علامات LDs لدراسة مورفولوجيتها وديناميكياتها وتفاعلها مع العضيات الأخرى ، ليس فقط في الأنسجة والخلايا الثابتة المختلفة 23,38,39,40 ولكن أيضا في الخلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من الصندوق الوطني للبحوث العلمية (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) والشركة الفرنكوفونية لديابيت (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. حاصل على زمالة الدكتوراه من FRIA (FNRS). حصل M.A.D.-L.d.C. على زمالة من برنامج Wallonie-Bruxelles الدولي للتميز.

يشكر المؤلفون أليس مونييه على مساهمتها في تطوير هذا البروتوكول وكارولين بوزين على خبرتها ومساعدتها التقنية في عملية الحصول على الصور. كما نشكر منصة التصوير 2IP-IREC للوصول إلى المجهر والمجاهر (منصة التصوير 2IP-IREC ، معهد البحوث التجريبية والسريرية ، الجامعة الكاثوليكية في لوفان ، 1200 بروكسل ، بلجيكا). وأخيرا، يود المؤلفون أن يشكروا نيكولاس دوبويسون ورومان فيرسيل وميشيل أبو سمرة على النقد البناء للمخطوطة. تم إنشاء بعض أرقام هذه المقالة مع BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المعداتAxioCam
506 كاميرا أحادية 6 ميجابكسلكاميرا Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD Zeiss
Chemical HoodPotteau LaboEN-14175
مجهر متحد البؤرZeissLSM800
أقراص الفلين (ø ؛ 20 مم ، 3 مم سميكة)   ؛علوم المجهر الإلكتروني63305
قفازات التبريدTempshield16072252
Cryostat   ؛ثرمو علمية ميكروم كرايو ستار HM 560
تشريح مجهر ستيريو SMZ745نيكون
الجاف الجليد
دومون ملقطFST11295-10
مجهر epifluorescenceZeissAxioImage-Apotome Z1
مقص بون فائق الدقةFS14084-08
FisherBrand يمكن التخلص منه قوالب القاعدة (0.7 × 0.7 سم)ThermoFisher22-363-552تستخدم لقطع قطعة لتثبيت العضلات على الفلين لتجميد
طبق بتري زجاجي (H 25   مم ، & أوسلاش. 150  مم)طبق بتري العلامة التجارية ،MERK BR455751يستخدم لوضع العضلات على الجليد أثناء تشريح
ImmEdge حاجز مسعور PAP PenVector LabsH-4000يستخدم لإنشاء حاجز نسائي حول أقسام العضلات
حاضنةMMM MedcenterIncucell 707 & nbsp ؛
نظارات غطاء المجهر (24x50 مم)Assistent 40990151
شرائح المجهر Kartell278تستخدم كغرف رطبة للكيمياء المناعية
حامل الرقبةLinie zwoSB-035X-02يستخدم كحزام لحمل كوب الفولاذ المقاوم
رقم 15 شفرة مشرط من الفولاذ الكربوني المعقمSwann-Morton0205
فرش الطلاءVan BleiswijckAmazon B07W7KJQ2Xتستخدم للتعامل مع عمليات القطع بالتبريد
قلم تحديد دائم أسودKlinipath / VWR98307-Rتستخدم لتسمية الشرائح
Pierce Tتثبيت FallpsFST18155-13
صندوق البوليسترين   ؛الارتفاع 12 سم × الطول 25 سم × العرض 18 سم ، يستخدم كحاوية نيتروجين سائل ولنقل العينات إلى مقبض مشرط ناظم البرد
، 125 مم (5 بوصة) ، رقم 3AesculapBB073R
كوب من الفولاذ المقاوم للصدأ 10 أوقية   ؛EboxerB07GFCBPFHبهلوان لملء الأيزوبنتين لتجميد العضلات
Superfrost Ultra Plus شرائحThermoFisherJ1800AMNZ
ملاقط جراحية 1/2 أسنانMedische Vakhandel1303152وتسمى أيضا "ملاقط أسنان الفئران"
مقص زنبركي Vannas - 3 مم حافة القطعFST15000-00
قوارب الوزنVWR الماسح الضوئي الدولي611-2249
كامل الشريحة للتألقZeissAxio Scan.Z1
Recodes< / strong>Alexa
Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2bSigma-AldrichSAB4600477يستخدم بتركيز نهائي يبلغ 1: 500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1ThermoFisherA-21121المستخدم في أ التركيز النهائي ل 1: 500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgMAbcamab175702يستخدم بتركيز نهائي 1: 1,000
Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للفئران-IgG (H + L) الجسم المضاد الثانويThermoFisherA-21247يستخدم بتركيز نهائي 1: 500
BODIPY-493/503 (4،4-difluoro-1،3،5،7،8-pentametil-4-bora-3a، 4a-diaza-s-indaceno)ThermoFisherD3922تستخدم بتركيز نهائي 1 & ميكرو; جم / مل
BODIPY-558/568 C12 (4،4-ثنائي فلورو-5- (2-ثينيل) -4-بورا-3 أ ، 4 أ-ديازا-إس-إنداسين-3-حمض الدوديكانويك)ثيرموفيشرD3835يستخدم بتركيز نهائي من 1 وميكرو ؛ جم / مل
DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFisherD1306يستخدم بتركيز نهائي يبلغ 0.5 & ميكرو ؛ جم / مل
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD-8418يستخدم لحل Bodipy لمحلول مخزون 1 مجم / مل. <قوي > الحذر < / قوي>: سام وقابل للاشتعال. قد تسبب الأبخرة تهيجا. التلاعب في غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد مباشرة. ارتداء قفازات مطاطية ونظارات واقية للعين.
محلول الفورمالديهايد 4٪ ، مخزن ، درجة الحموضة 6.9سيجما ألدريتش1004969011<قوي> الحذر < / قوي>: قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. يشتبه في تسببه في عيوب وراثية. قد يسبب السرطان. التلاعب في غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد مباشرة. ارتداء قفازات مطاطية ونظارات واقية للعين.
Isopentane GPR RectaPurVWR الدولي24872.298CAUTION< / قوي>: سائل وبخار شديد الاشتعال. قد يكون قاتلا إذا ابتلع ودخل الشعب الهوائية. قد يسبب النعاس أو الدوخة. قد يتسبب التعرض المتكرر في جفاف الجلد أو تشققه. ارتد قفازات واقية / ملابس واقية / حماية للعين / حماية الوجه.
النيتروجينالسائل < قوي > الحذر < / قوي > :  ؛ شديد البرودة. ارتد القفازات. تعامل ببطء لتقليل الغليان والرش وفي مناطق جيدة التهوية. استخدم حاويات مصممة للسوائل ذات درجة الحرارة المنخفضة.
الماوس على الماوس حجب الكاشف Vector LabsMKB-2213-1يستخدم بتركيز 1:30
الميوسين الثقيلة من النوع الأول (الجسم المضاد الأساسي BA-D5-s) الجين: MYH7 ، أحادي النسيلة البقري المضاد للفأر IgG2bDSHB جامعة أيواBA-D5 طافيستخدم بتركيز نهائي 1:10
سلسلة الميوسين الثقيلة من النوع IIA (الجسم المضاد الأساسي SC-71-s) الجين:   MYH2 ، أحادي النسيلة البقري المضاد للفأر IgG1DSHB جامعة أيواSC-71-طافيستخدم بتركيز نهائي من 1:10
سلسلة ميوسين ثقيلة من النوع IIX (الجسم المضاد الأساسي 6H1-s) ، الجين:   ؛ MYH1 ، أرنب أحادي النسيلة مضاد للفأر IgMدراسات تنموية بنك الورم الهجين ، جامعة أيوا6H1-طافيستخدم بتركيز نهائي 1: 5
مصل الماعز العادي (NGS)Vector LabsS-1000
PBS 0.1 Mيشيع استخدامه في مختبرات الأنسجة
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen   ؛P36930
المضاد للفئران المضاد لللامينين -2 (&alpha ؛ -2 سلسلة) الجسم المضاد الأساسي (أحادي النسيلة)Sigma-AldrichL0663يستخدم بتركيز نهائي 1: 1،000
مركب Tissue-Tek O.C.TSakura   ؛4583
<قوي>البرمجيات
أدوبي المصور CCأدوبي إنك.تستخدم لتصميم الأشكال
أدوبي فوتوشوبأدوبي ، Inc.البرنامج متحد البؤر
BioRenderhttps://biorender.com/يستخدم لتصميم الأشكال
Fiji / ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/يستخدم لتحليل الصور المكتسبة
Microsoft PowerPointالذي استخدمته Microsoft لإعادة بناء أنسجة العضلات بأكملها بعد مسح أنواع الألياف
تستخدم لإعادة بناء أنسجة العضلات بأكملها بعد مسح أنواع الألياف
صناديق للصدأ سلسلة الجسم Zen Blue 2.6 Zeiss

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
  2. Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
  3. Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
  4. Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839(2020).
  5. Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
  6. van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
  7. Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
  8. Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
  9. Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
  10. Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
  11. Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
  12. Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
  13. Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
  14. Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
  15. Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
  16. Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
  17. Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
  18. Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
  19. De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
  20. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
  21. Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
  22. Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
  23. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
  24. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774(2013).
  25. Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
  26. Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
  27. Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
  28. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
  29. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586(2014).
  30. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793(2015).
  31. Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
  34. Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
  35. Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327(2018).
  36. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
  37. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  38. Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
  39. Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
  40. Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
  41. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  42. de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168(2021).
  43. Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
  44. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
  45. Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
  46. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
  47. Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
  48. Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415(2020).
  49. Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2(2018).
  50. Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239(2010).
  51. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  52. Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
  53. Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852(2021).
  54. Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lipid DropletsFiber Type AnalysisMyosteatosisIntramyocellular LipidConfocal MicroscopyBodipy StainingSubcellular DistributionImmunohistochemistryMuscle Cryosection

مقالات ذات صلة