يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد شظايا الحمض النووي الريبي الناتجة عن التحلل الأنزيمي باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF

3.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63720

⸱

أبريل 11, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

في هذه المقالة

ملخص

تم استخدام MALDI-TOF لتوصيف الشظايا التي تم الحصول عليها من التفاعل بين الحمض النووي الريبي المؤكسد و exoribonuclease Xrn-1. يصف هذا البروتوكول منهجية يمكن تطبيقها على العمليات الأخرى التي تنطوي على الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي.

الملخص

الحمض النووي الريبي هو بوليمر حيوي موجود في جميع مجالات الحياة ، وتفاعلاته مع الجزيئات الأخرى و / أو الأنواع التفاعلية ، على سبيل المثال ، الحمض النووي والبروتينات والأيونات والأدوية والجذور الحرة ، موجودة في كل مكان. ونتيجة لذلك، يخضع الحمض النووي الريبي لتفاعلات مختلفة تشمل انقسامه أو تدهوره أو تعديله، مما يؤدي إلى أنواع ذات صلة بيولوجيا ذات وظائف وآثار متميزة. أحد الأمثلة على ذلك هو أكسدة الغوانين إلى 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) ، والتي قد تحدث في وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). وعموما، فإن الإجراءات التي تميز هذه المنتجات والتحولات ذات قيمة كبيرة للمجتمع العلمي. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن قياس الطيف الكتلي للازتناص بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF) هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع. يصف البروتوكول الحالي كيفية توصيف شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد العلاج الإنزيمي. يستخدم النموذج المختار تفاعلا بين الحمض النووي الريبي و exoribonuclease Xrn-1 ، حيث يتم إيقاف الهضم الأنزيمي في المواقع المؤكسدة. تم الحصول على تسلسلين من الحمض النووي الريبي الطويل المكون من 20 نيوكليوتيد [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] عن طريق توليف الطور الصلب ، الذي تم تحديده كميا بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ، وتم تمييزه عبر MALDI-TOF. ثم كانت الخيوط التي تم الحصول عليها (1) 5'-فسفوريلات وتتميز عبر MALDI-TOF. (2) تعامل مع Xrn-1 ؛ (3) تصفيتها ومملحة ؛ (4) تم تحليلها عبر MALDI-TOF. أدى هذا الإعداد التجريبي إلى تحديد لا لبس فيه للشظايا المرتبطة بتوقف Xrn-1: [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) CUA AAA GU] ، و [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. وأجريت التجارب الموصوفة باستخدام 200 بيكومول من الحمض النووي الريبي (20 بيمول يستخدم في تحليلات MALDI)؛ ومع ذلك ، قد تؤدي الكميات المنخفضة إلى قمم يمكن اكتشافها باستخدام مطياف باستخدام مصادر ليزر ذات طاقة أكبر من تلك المستخدمة في هذا العمل. والأهم من ذلك، أن المنهجية الموصوفة يمكن تعميمها وربما توسيعها لتشمل تحديد المنتجات لعمليات أخرى تنطوي على الحمض النووي الريبي والحمض النووي، وقد تساعد في توصيف/توضيح المسارات البيوكيميائية الأخرى.

المقدمة

MALDI-TOF 1,2,3 هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتوصيف و / أو الكشف عن الجزيئات ذات الأحجام والخصائص المختلفة. وتشمل بعض استخداماته تطبيقات متنوعة مثل الكشف عن العفص من الموارد الطبيعية4 ، وتصوير المستقلبات في الغذاء5 ، واكتشاف أو مراقبة أهداف أو علامات الأدوية الخلوية6 ، والتشخيص السريري7 ، على سبيل المثال لا الحصر. ومما له صلة بهذا العمل استخدام MALDI-TOF مع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، مع استخدامه على أوليغونوكليوتيدات يعود تاريخها إلى أكثر من ثلاثة عقود8، حيث لوحظت عدة قيود. تطورت هذه التقنية الآن إلى وسيلة موثوقة وشائعة الاستخدام لتوصيف كل من البوليمرات الحيوية9 وتحديد / فهم التفاعلات الكيميائية والكيميائية الحيوية ، على سبيل المثال ، توصيف المواقع المطلية في الحمض النووي الريبي 10 ، وتحديد شظايا الحمض النووي الريبي بعد انقسام الخيط11,12 ، أو تشكيل روابط متقاطعة بين البروتين والحمض النووي13 . وبالتالي ، من المفيد توضيح وتسليط الضوء على الجوانب المهمة لاستخدام هذه التقنية. تم وصف أساسيات MALDI-TOF في شكل فيديو بالإضافة إلى14 ولن يتم تفصيلها بشكل أكبر هنا. علاوة على ذلك ، تم وصف تطبيقه في سياق الحمض النووي أو البروتين سابقا وتوضيحه في الشكل المذكور15،16،17.

بروتوكول الكشف عن شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد التحلل المائي الأنزيمي هو المبلغ عنه هنا. تم اختيار النموذج التجريبي بناء على اكتشاف حديث نشرته مجموعتنا18 ، حيث تم استخدام MALDI-TOF لتحديد التفاعل الفريد بين exoribonuclease Xrn-1 و oligonucleotides من الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الآفة التأكسدية 8-oxoG. تم الحصول على خيوط طويلة من 20 نيوكليوتيد عن طريق تخليق الطور الصلب19 ، [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] ، في حين تم التعبير عن Xrn-1 وتنقيته بعد التقرير20 الموصوف سابقا. باختصار ، Xrn-121 هو إكسريبونوكلياز 5 '-3' مع العديد من الأدوار البيولوجية الرئيسية التي تحلل أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المؤكسد22. وجد أن عملية الإنزيم تتوقف عند مواجهة 8-oxoG ، مما أدى إلى شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نهايات 5'-phosphorylated [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) cua aaa gu] ، و [5'-H2PO 4-(8-oxoG) cua aaa gu]18.

وأخيرا، من المهم ملاحظة أن قياس الطيف الكتلي هو طريقة قوية يمكن، من خلال منهجيات مختلفة، تكييفها مع أغراض أخرى23،24؛ وبالتالي ، فإن اختيار طريقة التأين الصحيحة بالإضافة إلى الإعداد التجريبي الآخر له أهمية قصوى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم استخدام المياه فائقة النقاء الخالية من RNase (الجدول 1) لهذه الدراسة.

1. تحديد تركيز محلول الحمض النووي الريبي

  1. قم بإعداد عينة الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات أدناه.
    1. استخدم أنبوب الطرد المركزي الدقيق (0.6 مل) لإعداد محلول من الحمض النووي الريبي عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من محلول المخزون (الذي تم الحصول عليه عن طريق تخليق الطور الصلب)19 إلى 159 ميكرولتر من H2O. امزج المحلول عن طريق سحب الخليط لأعلى ولأسفل بشكل متكرر (10x).
      ملاحظة: نظرا لتوفر مجموعة واسعة من الكوفيت تجاريا، فقد تختلف الأحجام المطلوبة. تم استخدام Cuvettes بطول مسار 1 سم وحجم منخفض (150 ميكرولتر) في هذا العمل.
    2. شطف كوفيت الأشعة فوق البنفسجية مع الميثانول (2x) ، تليها الماء (فائقة النقاء H2O ، 3x ، انظر جدول المواد). استخدم تدفق غاز النيتروجين لتجفيف الكوفيت جيدا.
    3. استخدم ماصة لنقل المحلول (الخطوة 1.1.1) إلى الكوفيت ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هواء. قم بتغطية الكوفيت وضعه على الجانب حتى الحاجة.
  2. تحديد تركيز محلول الحمض النووي الريبي المحضر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
    1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي UV-Vis عن طريق قلب المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز. اسمح للأداة بإكمال إجراء بدء التشغيل وانقر على أيقونة UV WinLab لفتح نافذة تشغيل / التحكم في الأداة.
    2. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي Peltier Temperature Controller باستخدام المفتاح الموجود على يمين الجهاز.
    3. ضمن الطرق الأساسية ، انقر فوق المسح الضوئي - Lambda 365. سيتم فتح شاشة أخرى ومطالبة المستخدم بالتأكد من أن حاملات الخلايا فارغة. انقر فوق موافق واسمح للأداة بإجراء فحوصات النظام الخاصة بها. سيقوم النظام بعد ذلك بعرض قائمة من الشيكات ، والتأكد من أن جميع "تمرير" والنقر فوق موافق.
      ملاحظة: يوصى باتباع الخطوات 1-2-1-1-1-2-3 بالترتيب المقدم؛ قد يؤدي تغيير تسلسل الأحداث هذا إلى تعطل البرنامج.
    4. اضبط معلمات المسح الضوئي عن طريق تحديد جمع البيانات. في النافذة الجديدة ضمن إعدادات المسح الضوئي ، قم بتغيير البداية إلى 350 نانومتر والنهاية إلى 215 نانومتر.
    5. قم بتنشيط Peltier عن طريق تحديد + على يسار الملحق. انقر فوق Peltier متعدد الخلايا ، وقم بتغيير درجة الحرارة °C إلى 25 ، وانقر فوق Peltier On.
    6. انتقل إلى علامة التبويب معلومات العينة وأدخل عدد العينات والأسماء وموضع الخلية حسب الرغبة.
    7. انقر فوق Autozero وأدخل cuvette الذي يحتوي على حل الخلفية. تأكد من وضع هذه الكوفيت في نفس الفتحة حيث سيتم إجراء القياسات.
    8. انقر فوق ابدأ وأدخل cuvette (الخطوة 1.1.3) في الخلية المطلوبة. تأكد من أن نافذة cuvette موجهة بالتوازي مع الوجه الأمامي للأداة. انقر فوق موافق لبدء الفحص الأول عند 25 درجة مئوية.
    9. بالنسبة للقياسات عند درجات حرارة أعلى، كرر الخطوات 1.2.5-1.2.8 وقم بتغيير درجة الحرارة إلى درجة حرارة العينة المطلوبة (90 درجة مئوية في الحالة الحالية).
    10. انقر فوق ملف > تصدير واختر موقع الملف المطلوب. حدد XY Data للحصول على ملف .txt.
      ملاحظة: يمكن العثور على مساعدة توضيحية للخطوة 1.2 في الملف التكميلي 1 (S1-S7).
  3. إجراء الحصول على البيانات لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي.
    1. ابحث عن الملف الخاص بكل طيف ضمن علامة التبويب النتائج . للحصول على الامتصاص، مرر مؤشر الماوس فوق الخط، وانتقل إلى 260 نانومتر، وسجل الامتصاص المعروض. بدلا من ذلك، من خلال سلسلة تصدير الملفات >، قم بتصدير البيانات كملف .txt لمزيد من التحليل الرسومي باستخدام برامج تخطيط أخرى.
      ملاحظة: إذا كان 0.1 < A ≥ 1 ، فسيكون من الضروري إما تخفيف أو زيادة تركيز عينة الحمض النووي الريبي المحضرة في الخطوة 1.1.1.
    2. استخدم قانون بير لامبرت لحساب تركيز المحلول.
      ملاحظة: قانون البيرة: A = εcl، حيث:
      ج: الامتصاص (عند 260 نانومتر في هذه الحالة ، من الخطوة 1.3.1)
      ε: معامل الانقراض. بالنسبة للتسلسل المستخدم هنا ، فإن 208000 لتر mol-1 cm-1هي القيمة التي تم الحصول عليها من أداة OligoAnalyzer.
      l: طول المسار، 1 سم
      ج: تركيز العينة
    3. استخدم هذه الحسابات لإعداد الحل المطلوب للحمض النووي الريبي لاستخدامه في التجارب اللاحقة. تم استخدام حلول مع [RNA] = 200 ميكرومتر في هذه الدراسة.

2. التحلل المائي لقلة النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي بواسطة Xrn-1

  1. قم بإجراء فسفرة 5 'من الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات أدناه.
    1. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق 0.6 مل لإعداد المحلول التالي (الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر).
      1. إضافة H2O الخالي من RNase (33.5 ميكرولتر) ؛ قد تختلف وحدات التخزين اعتمادا على [RNA].
      2. ثم أضف الحل A (5 L، الجدول 1).
      3. أضف محلولا مائيا من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP ، انظر جدول المواد) (6 لتر ، 10 مللي متر ، 60 نانومول).
      4. أضف محلول مائي للحمض النووي الريبي (1 ميكرولتر ، 200 ميكرومتر ، 200 بمول).
      5. أضف محلول كيناز متعدد النوكليوتيدات (إنزيم PNK ، انظر جدول المواد) (4.5 لتر ، 45 وحدة). اخلطي بلطف عن طريق سحب الخليط لأعلى ولأسفل (10x).
    2. احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة عن طريق وضعه في حمام مائي.
    3. قم بتعطيل الإنزيم عن طريق وضع أنبوب التفاعل في كتلة حرارية مسخنة مسبقا (65 درجة مئوية) واحتضان المحلول لمدة 10 دقائق.
    4. اسمح للمحلول بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة (تم تمييز فسفرة الحمض النووي الريبي عبر تحليل MALDI-TOF ، انظر النتائج التمثيلية) لإنتاج محلول RNA نهائي مفسفرة 5 أقدام (4 ميكرومتر ، 50 ميكرولتر).
  2. قم بإجراء التحلل المائي للحمض النووي الريبي بواسطة Xrn-1 باتباع الخطوات أدناه.
    1. باستخدام الحل (50 ميكرولتر) من الخطوة 2.1.4 ، نفذ الخطوات التالية.
      1. يضاف الحل باء (5 لتر، الجدول 1).
      2. أضف محلول Xrn-1 (0.5 لتر ، 1 نانوغرام ، 30 fmol). امزج المحلول عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل (10x).
      3. احتضان أنبوب التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    2. انقل خليط التفاعل (الخطوة 2-2-1-3) إلى جهاز طرد مركزي بحجم 10 كيلوداد مسام (انظر جدول المواد)، وقم بتصفية الإنزيمات عن طريق الطرد المركزي (700 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
    3. انقل الترشيح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.6 مل.
    4. اغسل الحمض النووي الريبي المتبقي على أنبوب الطرد المركزي (الخطوة 2.2.2) بإضافة H 2 O (20 L) الخالي من RNase ، متبوعا بالطرد المركزي (700 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
    5. ادمج الترشيح مع الترشيح الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.2.3.
    6. قم بتخزين الأنبوب الذي يحتوي على المحلول الناتج في الفريزر (0 درجة مئوية) أو اشحنه للتحليل.

3. تحلية محلول الحمض النووي الريبي ، اكتشاف لوحة MALDI-TOF

  1. قم بإزالة الملح وتركيز العينة باستخدام أطراف ماصة تبادل الكاتيون C18 المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. ضع طرف ماصة C18 سعة 10 لترات (طرف ماصة محمل بسرير من وسائط كروماتوغرافيا C18 مثبتة في نهايته) على ماصة سعة 10 ميكرولترات، ثم تابع ما يلي:
      1. اغسل طرف C18 بمحلول الأسيتونيتريل المائي (10 ميكرولتر) بنسبة 50٪ مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.
      2. قم بموازنة طرف C18 بمحلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك مائي (0.1٪ TFA ، 10 ميكرولتر) مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.
      3. قم بإزالة طرف C18 يدويا من الماصة وتثبيته على ماصة سعة 200 ميكرولتر تحتوي على طرف ماصة P200 (سيتم الآن توصيل طرف الماصة C18 بطرف ماصة P200).
      4. اغمر طرف C18 في المحلول (الخطوة 2.2.6)، وقم بتحرير الحل من خلال طرف C18 عشر مرات.
        ملاحظة: تصبح عينة الحمض النووي الريبي مرتبطة براتنج تبادل الكاتيون داخل الطرف.
      5. افصل طرف C18 عن ماصة P200 وضعه على ماصة سعة 10 ميكرولتر.
      6. اغسل طرف C18 باستخدام محلول مائي بنسبة 0.1٪ TFA (10 ميكرولتر) مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.
      7. اغسل طرف C18 بالماء الخالي من RNase (10 ميكرولتر) مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.
  2. ضعيه على لوحة MALDI باتباع الخطوات التالية.
    1. قم بالتخلص من أوليغونوكليوتيد الحمض النووي الريبي من طرف C18 (الخطوة 3.1.1.7) عن طريق غمر العينة في المصفوفة المطلوبة (10 ميكرولتر ، محلول 1: 1 من C و D ، الجدول 1) ، متبوعا بتوزيع المحلول مرة أخرى في الأنبوب. كرر هذه العملية عشر مرات.
    2. ماصة المحلول من 3.2.1 على نقطتين منفصلتين على اللوحة (1 ميكرولتر لكل منهما ، 20 pmol). اترك البقع لتجف في الهواء (الشكل 1A والفيديو 1).
      ملاحظة: يمكن تكرار هذه العملية في نفس المكان لزيادة تركيز العينة في كل مكان.
    3. عيار ماصة المطلوبة (1 لتر) على نقطتين منفصلتين قريبتين ماديا من موقع العينة والسماح لها بالجفاف في الهواء.
      ملاحظة: تم الحصول على معيار الاختبار المستخدم في هذه الدراسة من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
    4. قم بتراكب العيار [المجفف بالكامل] مع المصفوفة المطلوبة (1 لتر). اتركيه حتى يجف في الهواء.
      ملاحظة: من المهم تتبع الموضع الذي يتم فيه رصد العينات والمعايرة قبل إدخالها في الجهاز. دون ذلك باستخدام نظام إحداثيات اللوحة، على سبيل المثال، توجد العينة 1 في الموضع (C,3)

4. الحصول على البيانات ومعالجتها

ملاحظة: بشكل عام ، يتطلب THAP طاقة ليزر أعلى لتحقيق التأين. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب تأين الأوليغوس دون تجزئة. وبالتالي ، من الضروري عادة استخدام طاقة ليزر منخفضة قدر الإمكان ورفع مكاسب الكاشف و / أو انخفاض تردد الليزر لتحقيق أقصى قدر من الكشف وتقليل التجزئة.

  1. قم بإجراء الحصول على البيانات باتباع الخطوات أدناه.
    ملاحظة: تم إجراء قياسات الوزن الجزيئي باستخدام مطياف الكتلة (انظر جدول المواد) في الأيون الموجب، الوضع الخطي مع جهد مصدر أيون يبلغ 20 كيلو فولت، وكسب كاشف يبلغ ~ 2.8 كيلو فولت، وتردد ليزر يبلغ 20 هرتز. تم حسابها والتعبير عنها ككتلة فوق الشحنة (m/z)، حيث كانت الشحنة 1. تم إجراء المعايرة الخارجية باستخدام خليط معايرة البروتين (معيار الاختبار البكتيري، انظر جدول المواد) في بقعة مجاورة للعينة. ثم تمت معالجة البيانات الخام في برنامج flexAnalysis (انظر جدول المواد).
    1. افتح "برنامج Flexcontrol" للتشغيل. اضغط على زر الإدخال/الخروج الأخضر للأداة، وانتظر حتى تتحرك المرحلة المستهدفة، ثم قم بالتفريغ للتنفيس. افتح الغطاء ، ضع اللوحة المستهدفة المجففة بالكامل في الأداة. تأكد من المحاذاة في الاتجاه الصحيح (الشكل 1B).
    2. اخفض الغطاء برفق، ثم اضغط على زر الإدخال/الخروج الأخضر. انتظر حتى يتم سحب اللوحة والأداة للضخ مرة أخرى. بمجرد أن يعكس شريط الحالة (الزاوية اليمنى السفلى من نافذة البرنامج) "جاهز" ، تابع المعايرة.
    3. لمعايرة الأدوات باستخدام البرنامج ، قم بما يلي.
      1. حدد الطريقة المطلوبة بالنقر فوق ملف > حدد الطريقة أو الضغط على الزر تحديد بجوار الطريقة التي تم تحميلها. انقر على الإحداثيات لبقعة المعايرة. انتقل إلى علامة التبويب معايرة وتأكد من تحديد المعايرة الصحيحة. تأكد من إيقاف تشغيل " المشي العشوائي " (في علامة التبويب "حامل العينات ").
      2. اضغط على Start (ابدأ ) وقم بتوجيه الليزر يدويا على طول بلورة (انقر فوق سهم الماوس في الموقع المطلوب في عرض الكاميرا). اضبط طاقة الليزر، إذا لزم الأمر. بمجرد الرضا عن الإعدادات ، اضغط على Start (ابدأ ) لجمع الأطياف وإضافتها إلى المخزن المؤقت للمجموع.
      3. أضف أطياف إلى المجموع حتى يتم الوصول إلى كثافة كافية. قم بالتبديل لعرض المخزن المؤقت للمجموع فقط، وطرح خط الأساس، والسلس. ثم انقر فوق التعيين التلقائي. تحقق من كل ذروة معينة ولاحظ خطأ جزء في المليون. إذا كنت راضيا عن المهام والأخطاء ، فانقر فوق تطبيق.
      4. امسح المخزن المؤقت للمجموع وانتقل إلى موضع العينة الأولى.
      5. قم بتأكيد نطاق الفحص المطلوب (علامة التبويب "الكشف"). اضبط الأشرطة في "نطاق الكتلة" بحيث تكون المنطقة الخضراء ممثلة للكتلة (الكتل) المتوقعة.
      6. انقر مباشرة على نافذة التكبير بحيث يتم توجيه الشعيرات المتقاطعة نحو الجزء المتبلور المطلوب (غالبا ما تسفر البلورات الأكبر حجما عن أفضل النتائج ، الشكل 2).
      7. اجمع بعض الأطياف على طول البلورات الكبيرة ، مع ضبط طاقة الليزر حسب الضرورة. الإعداد المناسب هو 5٪ -10٪ فوق الطاقة التي تظهر بها القمم.
    4. للحصول على الأطياف، قم بما يلي.
      1. انقر فوق ابدأ لمراقبة وميض الليزر جنبا إلى جنب مع زيادة الكثافة الطيفية (كما هو موضح في النافذة في الجزء العلوي الأيمن). حرك الليزر على طول البلورة بالنقر فوق سهم الماوس لأعلى ولأسفل البلورة (فيديو 2).
      2. انقر على إضافة مباشرة أسفل ابدأ.
      3. كرر ذلك عدة مرات حتى يتم الوصول إلى الكثافة / عدد اللقطات المطلوبة (ينعكس على المحور y للنافذة الطيفية)
      4. اضبط طاقة الليزر و/أو سرعتها و/أو مكاسب الكاشف إذا كانت عمليات الفحص الأولية غير مرضية. كرر الخطوات 4.1.4.1-4.1.4.3 حسب الحاجة.
      5. إذا كنت راضيا عن الطيف ، فانقر فوق حفظ باسم لحفظ الطيف تحت اسم محدد. ثم، إذا كانت هناك حاجة إلى عينات أخرى، انقر فوق مسح المجموع وكرر الخطوات ضمن الخطوة 4.1.4.
  2. إجراء معالجة البيانات.
    ملاحظة: تصف الخطوة 4.2 طريقة واحدة لتحليل البيانات باستخدام برنامج flexAnalysis.
    1. افتح البرنامج المطلوب. ثم افتح الطيف (أ) بتحديد ملف. من القائمة المنسدلة، حدد فتح.
    2. سيتم عرض نافذة جديدة. انقر فوق استعراض لتحديد موقع الملفات المحفوظة من الخطوة 4.1.4. حدد مربعات الملفات المطلوبة ، ثم انقر فوق فتح على اليسار. إذا كان هناك طيف واحد فقط يتطلب التحليل ، فما عليك سوى سحب الملف وإفلاته في نافذة البرنامج.
    3. قم بتمييز الملف (الملفات) الذي تم تحميله للتحليل المجمع. انتقل إلى علامة التبويب عملية على شريط الأدوات. في القائمة المنسدلة، حدد طرح خط أساس طيف الكتلة.
      ملاحظة: سيتم تحديد الخوارزمية المستخدمة للطرح بواسطة الطريقة المحددة في الخطوة 4.1.3.
    4. انتقل إلى علامة التبويب عملية على شريط الأدوات. في القائمة المنسدلة، حدد الطيف الكتلي السلس.
      ملاحظة: سيتم تحديد الخوارزمية المستخدمة للتنعيم بواسطة الطريقة المحددة في الخطوة 4.1.3.
    5. انقر فوق علامة التبويب " قائمة الكتلة" ؛ في القائمة المنسدلة، حدد بحث. يقوم هذا الأمر تلقائيا بتسمية القمم بجماهيرها. سيتم عرض قائمة بالجماهير على الشاشة إلى اليمين.
    6. لإضافة قمم أو حذفها، انتقل إلى علامة التبويب قائمة الكتلة . في القائمة المنسدلة ، انقر فوق تحرير.
    7. تحوم فوق المحور x من الطيف ؛ يمثل الخط الرأسي موقع الطيف حيث يوجد المؤشر.
      ملاحظة: سيظهر رمز يحتوي على رسم بياني ومؤشر عند إضافة كتلة جديدة عن طريق النقر. سيظهر هذا الرمز عند التمرير فوق القمم التي يمكن حذفها بالنقر فوق (راجع الخطوة 4.2.7 في الملف التكميلي 1).
    8. كرر الخطوات 4.1.3-4.1.7 للحصول على أطياف إضافية. تصدير القائمة الجماعية لجميع الأطياف عن طريق النقر والسحب لتمييز الملفات الموجودة على اليسار وتنفيذ القائمة التالية متتالية ملف > تصدير > Mass List إلى Excel.
    9. لتصدير الأطياف كما هو موضح على الشاشة، إما التقاط لقطة شاشة أو تصديرها كتقرير. بالنسبة لهذا الأخير، انتقل إلى القائمة تقرير . في القائمة المنسدلة، حدد حفظ بتنسيق PDF.
      ملاحظة: يمكن للمرء تغيير كيفية عرض الأطياف باستخدام علامات التبويب الثلاث أسفل الأطياف و / أو تغيير الملفات المميزة. ستظهر شاشة منبثقة. قم بتسمية مستند PDF حسب الرغبة ، واضبط الإعدادات / التخطيط ، وانقر فوق حفظ لإنشاء صورة من الطيف.
    10. ستعكس الصورة التي تم إنشاؤها العرض الطيفي في البرنامج البرمجي. لمعالجة طريقة العرض، قم بتنفيذ ما يلي.
      1. التكبير: انقر على زر التكبير في شريط الأدوات.
      2. مرر مؤشر الماوس فوق المحور x وانقر حتى يتم تحقيق النطاق المطلوب.
      3. التصغير/التراجع: انقر على زر التصغير وانقر في أي مكان في الطيف للعودة إلى العرض الكامل.
        ملاحظة: يمكن العثور على مساعدة توضيحية للخطوتين 4.1 و4.2 في الملف التكميلي 1 (الصفحات S8-S23 وS24-S30 على التوالي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تصنيع الأوليغنوكليوتيدات المستخدمة في هذا العمل وتمييزها وتحديدها كميا قبل الاستخدام. تم تحديد تركيز جميع النوكليوتيدات القليلة عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية المسجل عند 90 درجة مئوية لتجنب القراءات الخاطئة الناشئة عن التكوين المحتمل للهياكل الثانوية. يعرض الشكل 3 أطياف نموذج أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذا العمل، والتي تؤخذ في درجة حرارة الغرفة وبعد تطبيق الحرارة.

الإجراء العام ، جنبا إلى جنب مع بنية الآفة التأكسدية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نشأ التحدي الرئيسي في سير العمل هذا بين الانتهاء من التجارب وإجراء التحليلات الطيفية الكتلية. أجريت التجارب وأكملت في جامعة كولورادو دنفر وشحنت (بين عشية وضحاها) إلى مرافق جامعة ولاية كولورادو. تم الحصول على البيانات عند استلامها ، حسب الراحة. أدت عدة ظروف غير متوقعة إلى تأخيرات زمنية في العملية. وفي إحدى الحالات، اقتضت أعطال غير متوقعة في الأجهزة تجميد العينات (مرة واحدة لمدة 21 يوما) قبل اكتشافها واقتنائها؛ ومع ذلك ، لا يبدو أن هذا التأخير الزمني يؤثر على النتيجة التجريبية ، على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد تدهور الحمض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ومن المهم ملاحظة أن هذا العمل كان جهدا تعاونيا بين ثلاث مؤسسات، ومجموعتين بحثيتين، ومرفق أساسي واحد. تم تنفيذ التوزيع وعبء العمل على النحو التالي: تم تنفيذ تعبير البروتين (Xrn-1) في جامعة دنفر (دنفر ، كولورادو). تم إجراء توليف أوليغونوكليوتيدات ، وتحديد كمي ، وتجريب (التحلل الأنزيمي بشكل رئيسي) في جامعة كولورادو دنفر (دنفر ، كولورادو). كما تم تنفيذ التحسين هناك. تم إجراء اكتشاف MALDI-TOF واقتنائه وتحليله في المرفق الأساسي للموارد التحليلية في جامعة ولاية كولورادو. (فورت كولينز ، كولورادو). تود SS أن تعترف بجائزة UROP (CU Denver) ومنح Eureca (CU Denver) للدعم. يقر E. G.C. بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر R00GM115757. تقر MJER بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر 1R15GM132816. K.B. يقر بمعرف المورد: SCR_021758. تم دعم العمل أيضا من قبل جائزة المعلم والباحث (MJER) ، TH-21-028 ، من مؤسسة هنري دريفوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.6 مل MCT متخرج بنفسجيفيشر علمي05-408-127
6'-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98٪Sigma Aldrich480-66-0
Acetonitrile 99.9٪ ، HPLC gradeFisher Scientific75-05-8
Adenosine triphosphate ، 10 mMNew Englang BioscienceP0756S
سترات الأمونيوم ، ثنائي القاعدة 98٪ Sigma Aldrich3012-65-5
فلوريد الأمونيوم 98.0٪ ، ACS الصفAlfa Aesar12125-01-8
معيار اختبار بكتيريBruker Bruker Daltonics8255343
مصدر تجاري ل Xrn-1New England BioLabsM0338S
ثنائي إيثيل بيروكربونات ، 97٪ACROS OrganicsA0368487
تحليل فليكس برنامجBruker daltonicsFlexAnalysis الإصدار 3.4 ، Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis الطيفPerkin Elmer
لوحة MALDI: MSP 96 هدف فولاذي أرضيBruker Daltonics280799
مطياف الكتلةBrukerMicroflex LRFTOF (Bruker Daltonics ، Billerica ، MA)
Mili-Q IQ 7000تم استخدام نظام Milipore SigmaA Mili-Q لتنقية جميع المياه المستخدمة في هذا العمل
الطرد المركزي Nanosep مع غشاء OmegaTM 10 K ، أزرق (24 / pkg)Pall CorporationOD010C33وسائط الترشيح ، أوميغا (بولي إيثر سلفون المعدل) 10 كيلو حجم المسام
NEBuffer 3New England BiolabsB7003Sهذا هو الحل B
أداة محلل أوليغوIDT-DNAhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer
أطراف الماصة P10فيشر ساينتفيك02-707-441
أطراف الماصة P200فيشر ساينتفيك02-707-419
RNase بعيداالمنتجات الحيوية الجزيئية7005-11
T4 بولي النوكليوتيدات كينازنيو إنجلاند BioLabsM0201S
T4 بولي النوكليوتيدات كيناز تفاعل عازلةجديد إنجلترا BioLabsB0201Sهذا هو الحل
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكAlfa Aesar76-05-1
Xrn-1 exoribonucleaseمعبرا عنه في المنزلانظر المرجع 20
نصائح ماصة ZipTip لإعداد العينةMilliporeZTC 18S 09610 & micro ؛ أطراف ماصة L محملة بمعيار C18 0.6 & micro ؛ سرير L
الضوئي أجهزة

المراجع

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73(2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516(2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521(2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

8 Xrn 1 C18
تحديد شظايا الحمض النووي الريبي الناتجة عن التحلل الأنزيمي باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.