Method Article

الكشف عن وكمية خلايا الاحتفاظ بالتسمية في قواطع الماوس باستخدام نهج إعادة البناء 3D بعد إزالة الأنسجة

DOI:

10.3791/63721

⸱

June 10th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Texas A&M School of Dentistry

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي قاطعة الفأر على خلايا قيمة للاحتفاظ بالتسمية في مكانتها للخلايا الجذعية. لدينا طريقة جديدة لاكتشاف الخلايا التي تحتفظ بالتسمية وتحديدها بشكل غير متحيز. استخدمت دراستنا وضع العلامات EdU ونهج إعادة الإعمار 3D بعد تطهير أنسجة PEGASOS من الفك السفلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قاطعة الفئران هي عضو ينمو باستمرار طوال عمر الفأر. تؤدي الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة الموجودة في الأنسجة القريبة من القواطع إلى ظهور ذرية تتمايز إلى أرومات المينائية والأرومات السنية والخلايا الليفية اللبية. هذه الخلايا ضرورية في دعم الدوران المستمر للأنسجة القاطعة ، مما يجعل قاطعة الفئران نموذجا ممتازا لدراسة توازن الخلايا الجذعية البالغة. يعتقد أن الخلايا الجذعية تحتوي على خلايا هادئة طويلة العمر يمكن تصنيفها بواسطة نظائر النوكليوتيدات مثل 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). تحتفظ الخلايا بهذه التسمية بمرور الوقت وتسمى وفقا لذلك خلايا الاحتفاظ بالتسمية (LRCs). توفر مناهج تصور مراكز مصادر التعلم في الجسم الحي أداة قوية لمراقبة توازن الخلايا الجذعية. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتصور وتحليل مراكز مصادر التعلم. يتميز نهجنا المبتكر بمراكز مصادر التعلم في قواطع الماوس بعد إزالة الأنسجة وتلطيخ EdU الكامل متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج التصوير. تتيح هذه الطريقة الحصول على تصوير 3D والقياس الكمي غير المتحيز مقارنة بتحليل LRCs التقليدي على الشرائح المقسمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد قاطعة الماوس المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية البالغة1. تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية (حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) والخلايا الجذعية الوسيطة (بين حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) الموجودة على الجانب القريب من القاطعة إلى الأرومات المينائية والأرومات السنية وخلايا لب الأسنان. توفر هذه العملية الفريدة مصدرا للخلايا لتعويض فقدان الأنسجة ودورانها2. على الرغم من وجود العديد من علامات الخلايا الجذعية مثل Sox2 و Gli1 و Thy1 / CD90 و Bmi1 وما إلى ذلك. تم تحديدها في الجسم الحي لمجموعات فرعية من الخلايا الجذعية البالغة في قواطع الفئران ، فهي غير كافية في تمثيل مجموعات الخلايا الجذعية عند استخدامها بمفردها1،3،4،5. يمكن أن يوفر تصور الخلايا الهادئة طويلة العمر عن طريق وسم الحمض النووي التناظري للنيوكليوتيدات والاحتفاظ به اكتشافا غير متحيز لمعظم المجموعات الفرعية من الخلايا الجذعية البالغة6. علاوة على ذلك ، يعد هذا النهج مفيدا بين العديد من طرق تحديد الخلايا الجذعية7 لفهم سلوك الخلايا وتوازن مجموعات الخلايا الجذعية السنية 3,8. في حين أن الخلايا الجذعية المنقسمة ستفقد علامات الحمض النووي الخاصة بها بعد مطاردة كبيرة ، فإن الخلايا الجذعية الهادئة المفترضة تحتفظ بتسمية الحمض النووي الخاصة بها ، معتبرة أنها خلايا تحتفظ بالتسمية (LRCs)6. سيؤدي وضع علامات الحمض النووي والاحتفاظ به بواسطة الخلايا الجذعية غير المنقسمة إلى تحديد وتحديد موقع الخلايا الجذعية البالغة المفترضة في منافذها.

على مدى السنوات الماضية ، حل وضع العلامات التناظرية thymidine 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) محل طريقة وضع العلامات على الحمض النووي 3H-thymidine المرهقة والمستهلكة للوقت وعالية الدقة وغير المتوافقة مع الفحص الدقيق لفحوصات تكاثر الخلايا 6,9. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تقنية وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) بشكل متزايد على BrdU. ظهر هذا النمط لعدة أسباب. أولا ، طريقة BrdU بطيئة وكثيفة العمالة. ظروف المستخدم متغيرة ، وهي غير قادرة على الحفاظ على البنية التحتية في العينات (بسبب تمسخ الحمض النووي). وبالمثل ، تفقد طريقة BrdU مستضدية الخلايا ، مما يجعلها غير فعالة للتحليلات والمقايسات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية في الجسم الحي 3،7،9،10،11،12. BrdU هو أيضا ماسخ ، وهو غير مناسب لوضع العلامات على LRCs في التطور الجنيني6. أيضا ، طريقة BrdU غير فعالة عند استخدامها في عينات التركيب الكامل. العيوب هي انخفاض تغلغل الأجسام المضادة في الجزء العميق من العينات أو شرط فترة حضانة طويلة للأجسام المضادة للاختراق العميق13. يهرب وضع العلامات EdU من خطوات تغيير طبيعة العينات ، وبالتالي الحفاظ على البنية التحتية. هذه الميزة مفيدة للتحليلات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية11,12. أيضا ، وضع العلامات EdU حساسة للغاية وسريعة. تغلغل العينة مرتفع بسبب استخدام أزيدات الفلورسنت سريعة الامتصاص والأصغر حجما للكشف عن ملصقات EdU من خلال تفاعل الإضافة الحلقية المحفز بالنحاس (I) [3 + 2] (كيمياء "النقر)14.

طريقة أخرى لتصنيف الحمض النووي يتم تطبيقها بشكل متزايد هي استخدام الفئران المعدلة وراثيا المهندسة. تعبر هذه الفئران عن بروتين الفلورسنت الأخضر هيستون 2B (H2B-GFP) الذي يتحكم فيه عنصر منظم مستجيب للتتراسيكلين 5,14. بعد إطعام الفئران بتشاو / ماء التتراسيكلين لفترة مطاردة تتراوح من 4 أسابيع إلى 4 أشهر ، سوف يتضاءل مضان GFP في خلايا الدورة ويحتفظ LRCs فقط بالتألق6. ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن عزل مراكز مصادر التعلم الموسومة وتظل قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو التحليلات الوظيفيةالنهائية 6,7. أبلغت بعض الدراسات عن وضع علامات غير دقيقة على الخلايا الجذعية الهادئة عند مطاردتها للاستخدام على المدى الطويل. كانت هذه النتيجة بسبب تعبير خلفية متسرب من سلالة H2B-GFP وليس الاستجابة المناسبة التي ينظمها التتراسيكلين15.

علاوة على ذلك ، استخدمت معظم الأدبيات في الماضي اكتشاف مراكز مصادر التعلم بشكل أساسي على شرائح مجزأة ، وهي ثنائية الأبعاد وغالبا ما تكون متحيزة بشكل خاطئ في إظهار الموقع الدقيق وعدد مراكز مصادر التعلم. أظهر النهج زوايا غير صحيحة لأقسام هياكل الأنسجة المعقدة16. كانت الطريقة الأخرى هي الحصول على صور 3D من الأقسام التسلسلية وإجراء عمليات إعادة بناء ما بعد الصورة. كانت هذه الخطوات غير دقيقة بسبب تشويه الصورة من الاختلافات في كل قسم تسلسلي بسبب الأقسام المضغوطة أو الممتدة ، مما أدى إلى فقدان المعلومات16،17،18. كانت الطريقة أيضا شاقة وتستغرق وقتا طويلا.

لتسهيل التصوير الكامل لمراكز مصادر التعلم ، يجب توضيح العينات مع الحفاظ على التألق جيدا. يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة الحالية إلى ثلاث فئات رئيسية: تقنيات إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الكاشف المائي ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الهيدروجيل17،19. تم مؤخرا تطوير نظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS). هذا النهج يجعل جميع أنواع الأنسجة تقريبا شفافة ويحافظ على مضان داخلي المنشأ ، بما في ذلك الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان20. تتميز طريقة PEGASOS بمزايا مقارنة بطرق إزالة الأنسجة الأخرى ، خاصة في إزالة مواد الأسنان والعظام. يمكن لمعظم الطرق الأخرى إزالة الأنسجة الصلبة جزئيا فقط ، أو لها أوقات معالجة طويلة ، أو تتطلب كواشف مكلفة21. أيضا ، يمكن لطريقة PEGASOS الحفاظ بكفاءة على التألق الداخلي على الطرق الأخرى.

قادتنا هذه الأدبيات إلى إنشاء طريقة جديدة لدراسة الخلايا. لقد جمعنا مزايا الكشف عن LRCs لوضع العلامات على EdU مع التصوير الأكثر تفوقا 3D الكامل للعينات التي تم تطهيرها من الأنسجة. تمت معالجة العينات باستخدام تقنية إزالة الأنسجة المتقدمة المرتبطة بنظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS)15. مكنتنا شفافية الأنسجة الصلبة من إعادة بناء إشارة 3D لتألق LRCs في الجسم الحي دون كسر الأسنان أو الفك السفلي ، مما يخلق طريقة أكثر دقة لتصور وقياس LRCs.

في هذه الدراسة ، نقدم دليلا مبتكرا لتصور LRCs في قاطعة الماوس. لقد صنعنا نهجا مرئيا 3D لتحديد موقع وكمية LRCs داخل مكانة الخلايا الجذعية القاطعة للفأر. استخدم هذا المشروع وضع العلامات على EdU ، وتقنيات إزالة الأنسجة PEGASOS ، والفحص المجهري متحد البؤر. تتغلب طريقتنا في وضع علامات EdU على LRCs على أنسجة كاملة التركيب واستخدام عينة واضحة وشفافة على كل من قيود الشرائح التقليدية المجزأة وغيرها من طرق وضع العلامات على الحمض النووي غير المواتية. وبالتالي ، ستكون تقنيتنا مناسبة للدراسات حول توازن الخلايا الجذعية التي تتطلب اكتشاف LRCs ، خاصة على الأنسجة الصلبة. يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا بنفس القدر لأولئك الذين يركزون على الاتزان الداخلي للخلايا الجذعية في الأنسجة والأعضاء الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) لكلية طب الأسنان بجامعة تكساس إيه آند إم.

1. إعداد كوكتيل وضع العلامات EdU

  1. قم بإعداد حلول مخزون الكوكتيل كما هو موضح في الجدول 1.
  2. قم بإعداد كوكتيل وضع العلامات EdU كما هو موضح في الجدول 1.

2. إعداد الفئران وحل EdU

  1. قم بإعداد حل EdU. قم بإذابة EdU في DMSO عند 20 مجم / مل واحفظه في فريزر -20 درجة مئوية.
    تنبيه: EdU هو مطفر. يجب على المستخدمين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع هذه المادة.
  2. حقن الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 5 أيام بمحلول EdU المحضر داخل الصفاق بوزن جسم 3 ميكرولتر / جم. يجب أن تتلقى الفئران الحل مرة واحدة في اليوم لمدة 7 أيام متتالية. بعد ذلك ، يخضعون لفترة مطاردة لمدة 6 أسابيع قبل حصادهم للتحليل (الشكل 1).
    تنبيه: احرص على تجنب وخز الإبرة عند حقن EdU في الفئران. بعد حقن EdU لمدة 7 أيام متتالية ، ضع الفئران في قفص جديد. بعد أن تكون الفئران في منزلها الجديد ، تخلص من الفراش في القفص القديم باستخدام قواعد الخطر البيولوجي المناسبة.

3. تحضير العينة عن طريق التروية عبر القلب (الفئران البالغة من العمر 53 يوما بعد فترة المطاردة التي استمرت 6 أسابيع)

ملاحظة: يجب أن يتحول كبد الفأر إلى لون باهت بعد نجاح التروية عبر القلب.

  1. تخدير الفئران بالحقن داخل الصفاق. يجب إعطاؤهم مزيجا من مخدر الزيلازين والكيتامين (زيلازين 10-12.5 مغ/كغ; الكيتامين، 80-100 ملغم/كغ من وزن الجسم).
  2. انتظر لمدة ~ 10 دقائق حتى لا يستجيب الماوس للمنبهات المؤلمة (مثل ردود الفعل قرصة مخلب).
  3. ضع الفئران في وضع ضعيف استقرت على دعم الستايروفوم مع الإبر في كل مخلب.
  4. كشف تجويف الصدر عن طريق فتح الجلد المغطي باستخدام ملاقط ومقص تشريح.
  5. قطع الحجاب الحاجز باستخدام مقص حاد. احرص على عدم اختراق القلب.
  6. قطع من خلال القفص الصدري ، والاستيلاء على قاعدة القص مع مقص المشبك لفضح القلب.
  7. انقل الماوس إلى مرحلة التروية بالقرب من مضخة الدوران في غطاء الدخان.
  8. أدخل إبرة 25 G (من الأنبوب المملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) / محلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA)) في قمة البطين الأيسر. احرص على إبقاء طرف الإبرة في تجويف البطين.
    تنبيه: PFA سمية معتدلة ومادة مسرطنة محتملة. استخدم معدات الوقاية الشخصية للتعامل مع PFA وإعداد المحلول تحت غطاء دخان كيميائي. يتطلب PFA التخلص السليم من النفايات وفقا لإرشادات المؤسسة.
  9. قطع البطين الأيمن باستخدام مقص حاد مباشرة بعد إدخال الإبرة في البطين الأيسر. تسمح هذه الخطوة بتدفق الدم من الماوس وتصريفه في طبق التجميع.
  10. قم بتغذية العينات ب 50 مل من محلول PBS بمعدل تدفق 7 مل / دقيقة.
  11. بعد نضح PBS ، قم بتبديل المحبس للسماح بتدفق 20 مل من محلول PFA 4٪ بنفس معدل التدفق البالغ 5 مل / دقيقة.
  12. بينما لا تزال مضخة الدورة الدموية قيد التشغيل ، قم بإزالة الإبرة من البطين الأيسر.
    ملاحظة: تم الآن إصلاح الماوس لجمع الأنسجة. للحفاظ على التألق ، يجب تجنب التعرض للضوء كلما أمكن ذلك طوال البروتوكول بأكمله. أثناء معالجة الأنسجة ، قد يتم تغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع عينات الأنسجة بورق الألمنيوم.

4. تطهير أنسجة الفك السفلي باستخدام تقنية PEGASOS

ملاحظة: يمكن استخدام أنبوب مخروطي 15 مل أو 50 مل حسب حجم الأنسجة للحفاظ على العينات جاهزة للعلاج في كل خطوة. تتم معالجة العينات عند هزازات 37 درجة مئوية (~ 100 دورة في الدقيقة) من الخطوات 4.2 إلى 4.7. استخدم حاويات بلاستيكية قائمة على مادة البولي بروبيلين مقاومة للمذيبات العضوية لتجنب ذوبان البلاستيك. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأواني الزجاجية.

تنبيه: تستخدم تقنية إزالة الأنسجة PEGASOS محاليل سامة مثل Quadrol والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) وبنزوات البنزيل (BB) و MMA500 وما إلى ذلك. مطلوب معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب التعرض المحتمل.

  1. تشريح الفك السفلي ومزيد من إصلاح العينات في 4 ٪ PFA. احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  2. قم بإزالة العضلات من الفك السفلي واغمرها في محلول EDTA 0.5 M (درجة الحموضة 8.0) لإزالة الكلس لمدة 4 أيام. خلال هذه الفترة ، قم بإجراء تغيير متوسط يومي على شاكر 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المستحسن إزالة العضلات من العينة قدر الإمكان. سيؤدي هذا الاحتياط إلى تبسيط عملية التصوير وتقليل التألق الذاتي من العضلات.
  3. قم بإزالة لون الفك السفلي بمحلول رباعي 25٪ (v / v في H2O) على شاكر 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد لإزالة الهيم الدموي المتبقي.
  4. استكمال تلطيخ EdU جبل كامل.
    1. قم بإعداد كوكتيل جديد لوضع العلامات EdU وفقا للجدول 1.
      ملاحظة: يجب صنع كوكتيل الملصقات EdU طازجا في كل مرة مع إضافة محلول أسكوربات طازج للحصول على أفضل نتائج وضع العلامات على EdU.
    2. اشطف الفك السفلي باستخدام PBST لمدة 30 دقيقة على خلاط 37 درجة مئوية.
    3. شطف الفك السفلي مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 3 دقائق في كل مرة.
    4. احتضن الفك السفلي في كوكتيل EdU طازج على شاكر 37 درجة مئوية طوال الليل.
    5. شطف الفك السفلي مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  5. قم بإجراء إزالة الدهون التسلسلية في كل من المحاليل التالية لمدة 6 ساعات على 37 درجة مئوية:
    محلول ثلاثي البيوتانول (tB) بنسبة 30٪: 75٪ v / v H2O ، 22٪ v / v tB ، و 3٪ v / v Quadrol.
    محلول 50٪ تيرابل: 50٪ v / v H2O ، 47٪ v / v tB ، و 3٪ v / v Quadrol.
    محلول 70٪ تيرابايت: 30٪ v / v H2O ، 67٪ v / v tB ، و 3٪ v / v Quadrol
    ملاحظة: خطوة إزالة الدهون أمر بالغ الأهمية. يمكن إزالة الدهون بين 4-6 ساعات في محلول 30٪ و 50٪ تيرابايت ولمدة 1 يوم في محلول 70٪ تيرابايت.
  6. قم بتجفيف الفك السفلي في محلول tB-PEG لمدة يومين مع التغيير المتوسط اليومي التالي: 75٪ TB ، 22٪ v / v البولي إيثيلين جلايكول ميثيل إيثر ميثاكريلات متوسط MMA500 ، و 3٪ v / v Quadrol عند 37 درجة مئوية.
  7. امسح الفك السفلي في وسط إزالة البنزيل بنزوات (BB) -PEG للحصول على مطابقة معامل الانكسار: 75٪ v / v BB ، 22٪ v / v PEG-MMA500 ، و 3٪ Quadrol حتى يتم تحقيق الشفافية.
    ملاحظة: لدينا معلومات عن مطابقة معامل الانكسار. المكونات غير العضوية والعضوية في الأنسجة مثل الماء والدهون والبروتينات والمعادن والعضيات ، إلخ. لها معامل انكسار مختلف (RI) في نطاق 1.33 إلى 1.55. عدم تطابق RI هذا بين مكونات الأنسجة يعيق عملية التصوير. يمكن تحقيق الشفافية من خلال القضاء على عدم تطابق النظائر المحجوزة داخل الأنسجة. ينصح بغمر العينات التي تم تطهيرها من الأنسجة في وسط المقاصة ل BB-PEG. ستعطي هذه الخطوة RI الداخلي الموحد ~ 1.54 (يسمى مطابقة RI) للعينة بأكملها ، مما يسهل عملية التصوير.
  8. الحفاظ على الفك السفلي في وسط إزالة الأنسجة BB-PEG في درجة حرارة الغرفة للتخزين والتصوير.
    ملاحظة: من الجيد إكمال التصوير في أقرب وقت ممكن لتجنب الفقدان التدريجي لمراسلي الفلورسنت. ومع ذلك ، فإن طريقة PEGASOS ستحافظ على مراسلي التألق محفوظين جيدا حتى بعد عدة أسابيع من التخزين20,21. للتخزين طويل الأجل ، يمكن أيضا تخزين العينات عند 4 درجات مئوية.

5. التصوير البؤري للفك السفلي الذي تم تطهيره من الأنسجة

  1. قم بتركيب الفك السفلي الكامل للأنسجة التي تم تطهيرها على شرائح تجويف العلامة التجارية في وسط المقاصة BB-PEG وقم بتغطيتها بشرائح غطاء زجاجي. تجنب أي فقاعات.
  2. قم بإجراء التقاط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر مناسب للمسح بالليزر. حدد الحصول على وتعيين معلمات الحصول على الصورة بدقة 512 × 512 بكسل وسرعة اكتساب 400 هرتز. تم العثور على هذه الإعدادات في قائمة وضع الاستحواذ للبرنامج الذي يتحكم في المجهر.
  3. في لوحة الإثارة الفلورية ، قم بتنشيط الليزر المطلوب (TRITC) لإثارة الفلوروفورات على النحو الأمثل (المسبار الذي استخدمناه لتصور LRCs له خصائص الفلورسنت مثل Cy3 مع الإثارة عند 548 نانومتر والانبعاثات عند 563 نانومتر من الطول الموجي لليزر).
  4. في لوحة الكشف عن الفلورسنت ، حرك شريط التمرير لتحديد الأطوال الموجية التي سيتم قياسها (على سبيل المثال ، بين 555 إلى 625 نانومتر لفلوروفور يشبه Cy3).
  5. ضع الفك السفلي المثبت على مرحلة المجهر لتصور العينة والعثور عليها باستخدام الضوء الأبيض وهدف تكبير أقل (2-10x).
  6. أضف قطرة من زيت الغمر مع معامل انكسار 1.52 أعلى غطاء الغطاء لتتناسب مع معامل الانكسار لانزلاق الغطاء الزجاجي والهدف.
    ملاحظة: قم بمطابقة معامل الانكسار للأهداف ووسائط التصوير والأنسجة قدر الإمكان لتقليل إدخال التشوهات البصرية أثناء التقاط الصورة.
  7. قم بتشغيل مصابيح الفلورسنت واختر هدف تكبير مناسب لتصوير مناطق الاهتمام. استخدمنا عدسة موضوعية 20x بفتحة عددية تبلغ 0.9 بمسافة عمل تبلغ 1.95 مم. قد تكون هناك حاجة إلى عدسة مسافة عمل أطول عند تصوير عينات أنسجة أكبر في المجهر متحد البؤر. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التصوير بسهولة باستخدام مجهر ورقة الضوء لعينات الأنسجة الكبيرة.
  8. في برنامج التصوير متحد البؤر، اضغط على الزر Live لبدء وضع المسح المباشر. لزيادة النطاق الديناميكي للصور وتجنب تشبع البكسل، اضبط الكسب وكثافة الليزر للقناة المحددة.
  9. حدد مجال الرؤية لتصور المنطقة بأكملها من الفك السفلي في أبعاد X و Y. قم بتعيين معلمات اكتساب المرحلة Z العلوية والسفلية التي تغطي بدقة حجم مكانة الخلايا الجذعية في قاطعة الفئران. استخدم حجم خطوة Z يبلغ 2 ميكرومتر أو حسب متطلباتك. يجب أن تكون الإصدارات الأحدث من المجاهر متحدة البؤر قادرة على الحصول تلقائيا على مكدسات z لمختلف المناطق المتداخلة.
  10. الحصول على ملفات صور Z-stack وحفظها بتنسيق .lif.
    ملاحظة: الذباب .lif يمكن تحويلها إلى ملفات .tiff واستخدامها لبرامج تحليل 3D الأخرى.

6. معالجة الصور ، وإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد ، والقياس الكمي لخلايا الاحتفاظ بالتسمية عن طريق إنشاء سطح ، وتجزئة منطقة الاهتمام (ROI) ، وإخفاء عائد الاستثمار ، وإنشاء بقع

ملاحظة: استخدمنا Imaris (Bitplane 9.0.1) لمعالجة الصور وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، ولكن يمكن إجراء خطوات معالجة صور مماثلة باستخدام مجموعات برامج أخرى (على سبيل المثال ، ImageJ / Fiji ، 3D slicer ، Avizo ، Arivis ، Amira ، إلخ).

  1. في برنامج التصوير، انقر على زر الساحة، ثم اختر صورة. حدد ملف .lif الأصلي واختر الملف المدمج ، وسيتم استيراد الصور إلى برنامج التصوير.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم محول ملفات برنامج تصوير لتحويل ملف صورة مكدس Z إلى نوع ملف التنسيق الأصلي للبرنامج. على سبيل المثال: تحويل ملفات .lif إلى ملفات .ims باستخدام محول ملفات Imaris وافتح ملفات .ims في برنامج التصوير. سيسمح تحويل البيانات إلى تنسيق الملف الأصلي للبرنامج بالتحويل السريع للملفات وتقليل الأخطاء.
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف المدرج لفتح مجموعة بيانات الصورة.
  3. قم بزيارة لوحة ضبط العرض ، انقر فوق اسم القناة. عادة ما يتم تصنيفه على أنه أحمر في الوضع الافتراضي.
    1. في نافذة خصائص الصورة ، انقر فوق علامة التبويب اللون المعين . في خيار ملف جدول الألوان ، اختر Fire Flow ، ثم انقر فوق موافق. عادة ما يتم اختيار لون الشاشة لتمييز مضان الخلفية والتألق الإيجابي من العينة.
  4. في الجانب الأيسر العلوي من الشاشة في جزء المشهد - الخصائص ، انقر فوق الرمز الأزرق المسمى إضافة سطح جديد. قم بإلغاء تحديد رمز مستوى الصوت الذي سيزيل معظم مضان الخلفية ويكون التألق الإيجابي مرئيا بشكل واضح (انظر الخطوة 6.4.2).
    1. ابدأ عملية التقسيم اليدوي لمنطقة الاهتمام (ROI) بالنقر فوق علامة التبويب إنشاء وتحديد علامة التبويب تخطي الإنشاء التلقائي والتحرير يدويا . في معالج إنشاء السطح اليدوي ، انقر فوق علامة التبويب كفاف لاختيار الاتجاه (XY أو YZ أو XZ) بناء على العينات لتحديد عائد الاستثمار بسهولة. هنا ، نختار اتجاه XY.
    2. بعد ذلك ، تأكد من أن قائمة المؤشر في الزاوية اليمنى في وضع التحديد . اضبط موضع الشريحة لتحديد موقع عائد الاستثمار في المنسجة. ستلاحظ أن معظم مضان الخلفية قد تمت إزالته بمضان إيجابي مميز كما هو مذكور في الخطوة 6.4. انقر فوق الزر "رسم " وارسم منطقة اهتمام مؤقتة. حدد خيار الرؤية إلى لا شيء لتجنب التداخل من مناطق أخرى غير عائد الاستثمار.
    3. كرر الخطوة 6.4.2. شريحة تلو الأخرى لجذب المنطقة بأكملها محل الاهتمام.
    4. بعد الانتهاء من رسم عائد الاستثمار ، انقر فوق إنشاء Surface للحصول على هندسة 3D لعائد الاستثمار.
    5. انقر فوق الزر تحرير في معالج إنشاء السطح اليدوي وحدد إخفاء الكل.
    6. في نافذة قناع القناة المنبثقة ، حدد القناة 1 في خيارات اختيار القناة. بعد ذلك ، حدد تكرار القناة قبل تطبيق القناع. في إعدادات القناع ، حدد ثابت داخل / خارج واضبط السطح الخارجي voxel على 0.
    7. في جزء خصائص المشهد ، قم بإلغاء تحديد كائن Surface وحدد كائن وحدة التخزين. في ضبط العرض ، قم بإلغاء تحديد القناة "الحمراء" الأصلية وحدد القناة الحمراء المقنعة واضبط كثافة اللون للحصول على عائد استثمار مضان 3D المطلوب والمسمى بشكل إيجابي.
  5. إنشاء كائن تركيز جديد. ابدأ بالنقر فوق رمز إضافة البقع لتحديد كمم مراكز مصادر التعلم المقدمة ثلاثية الأبعاد عن طريق إنشاء نقاط ثلاثية الأبعاد تتداخل نسبيا مع مراكز مصادر التعلم المقدمة ثلاثية الأبعاد. استخدم الأسهم السفلية للتنقل بين الخطوات في معالج إنشاء البقعة.
    1. في معالج إنشاء البقعة ، ستكون هناك أربع خطوات متسلسلة من التعليمات لإنشاء نقاط تلقائيا باستخدام البرنامج. تأكد من تحديد الخيار تقسيم منطقة اهتمام فقط في الخطوة الأولى. انقر على أيقونة التالي .
    2. في الخطوة الثانية ، سيكون هناك "صندوق XYZ 3D". اضبط مربع XYZ لتغطية عائد الاستثمار. انقر على أيقونة التالي .
    3. في الخطوة الثالثة ، انتقل إلى خيارات قناة المصدر . اختر القناة الحمراء المقنعة ؛ أدخل قطر بقعة XY المقدر مقارنة لتناسب وتتداخل مع نقاط مضان العينة. انقر على أيقونة التالي .
    4. في الخطوة الرابعة ، أضف نوع مرشح "الجودة" واضبط عتبة الكثافة المنخفضة عن طريق تحريك النافذة المنزلقة عبر الرسم البياني "الجودة" حتى يتم تصنيف غالبية مراكز مصادر التعلم التي يمكن تحديدها.
      ملاحظة: تعتمد التجزئة وبالتالي القراءات الإحصائية (مثال: عدد الخلايا) إلى حد كبير على قيم عتبة الكثافة. كن حريصا على تعيين قيم العتبة المناسبة بدقة.
    5. انقر فوق الزر " إنهاء " وحدد الزر "إحصائية ". حدد علامة التبويب الإجمالي للعثور على قيمة إجمالي عدد النقاط في الصورة.
    6. قم بتصدير الإحصائيات بالنقر فوق الزر "عرض علامة التبويب إلى ملف" وتلقي النتائج في ملف .xls.
    7. استخدم مخططا مناسبا لعرض نتائج القياس الكمي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد وضع العلامات على EdU وعملية إزالة الأنسجة PEGASOS (الشكل 2) ، تم الحصول على الفك السفلي الشفاف كما هو موضح في صورتنا (الشكل 3B). قارنا العينة المعدلة بالفك السفلي العادي دون عملية إزالة الأنسجة (الشكل 3 أ). تعرض الفك السفلي الشفاف (الشكل 3B) مع وضع العلامات EdU للتصوير متحد البؤر. ركزنا على قمة القاطعة التي توضح مكانة الخلايا الجذعية كما هو موضح في (الشكل التكميلي 1). أظهر القسم الب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما تستخدم جرعات متعددة من الحقن (BrdU ، EdU) على الفئران الوليدية النامية لتسمية الخلايا المتكاثرة قدر الإمكان1،6،13. تعتبر فترة المطاردة خطوة حاسمة فيما يتعلق بمعدل تجديد الأنسجة 6,13. قاطعة الماوس تجدد نفسها كل شهر. تسمح هذه السمة للباحثين بضبط فترة المطاردة على 4 أسابيع أو أكثر4،5،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ميغان ك. هولت على تحرير المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح NIH / NIDCR DE026461 و DE028345 وتمويل بدء التشغيل من كلية طب الأسنان في تكساس إيه آند إم للدكتور شياو فانغ وانغ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 م EDTAسيجما الدرسيهE9884
20 & مرات ؛ الهدف / NA 0.9Leica507702
50 مل Falcon أنابيب الطرد المركزيFalconFalcon 352070
BD PrecisionGlide NeedleBDREF 305111
بنزوات بيزيل (BB)Sigma Aldrcih409529
Bitplane 9.0.1Imaris
BRAND تجويف الشرائحMillipore SigmaBR475505
C57BL / 6J الفئرانجاكسون مختبرسلالة #:000664
مضخة الدورة الدمويةVWR23609-170
CuSO4< / sub>Sigma Aldrcih451657
DMSOSigma AldrcihD8418
EdUCarboynthNE08701
HeparinMiiilipore SigmaH3149
نظام التصويرأوليمبوسDP27
LAS X SoftwareLeica
Olympus مجهر ستيريوأوليمبوسSZX16
ParaformaldehyeSigma AldrichP6148
PBSSigma AldrichP4417
PEGMMA500Sigma Aldrich447943
Quadrolسيجما ألدريتش122262
أسكوربات الصوديومسيجما ألدريتش11140
سلفا سيانين 3 أزيدلوميبروبD1330
TBS-10Xتقنية إشارات الخلية12498
TCS SP8 مجهر متحد البؤرLeica
tert-butanol (tB)سيجما ألدريتش360538
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712(2017).
  2. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  3. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  4. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
  5. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  6. Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
  7. de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595(2021).
  8. Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
  9. Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
  10. Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345(2021).
  11. Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
  12. Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
  13. Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
  14. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  15. Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357(2008).
  16. Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
  17. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  18. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  19. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  20. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  22. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  23. Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Retaining CellsMouse IncisorsTissue Clearing3D ReconstructionStem Cell NicheEdU StainingConfocal MicroscopyMandible DecalcificationMesenchymal Stem CellsEpithelial Stem Cells

Related Articles