يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام توتر الأكسجين المنخفض لتقليل الخلايا المكونة للدم في مزارع الخلايا اللحمية لنخاع عظم الفئران

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63727

⸱

أبريل 21, 2023

 , 
1Department of Orthopedic Surgery, Duke University School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Cancer Biology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تؤدي الزراعة الروتينية للخلايا اللحمية لنخاع العظم (BMSCs) إلى عزل مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، حيث تكون العديد من الخلايا من أصول مكونة للدم. هنا ، نصف طريقة تستخدم توتر الأكسجين المنخفض لتقليل الملوثات المكونة للدم بشكل كبير في مزارع الفئران BMSC.

الملخص

في الوقت الحالي ، لا يزال هناك نقص في العلامات المقبولة عالميا لعزل مجموعة متجانسة من الخلايا الجذعية الهيكلية (SSCs) بشكل مستقبلي. لهذا السبب ، لا تزال BMSCs ، التي تدعم تكون الدم وتساهم في جميع وظائف الهيكل العظمي ، تستخدم على نطاق واسع لدراسة الأسلاف الوسيطة متعددة القدرات (MMPs) واستنتاج وظيفة SSC. علاوة على ذلك ، نظرا لاتساع نماذج الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة الأمراض العضلية الهيكلية ، فإن استخدام BMSCs يعمل أيضا كأداة قوية لفحص الآليات الجزيئية التي تنظم MMPs و SSCs. ومع ذلك ، فإن إجراءات العزل الشائعة لخلايا BMSC للفئران تؤدي إلى أن تكون أكثر من 50٪ من الخلايا المستردة من أصول مكونة للدم ، مما قد يعيق تفسير البيانات التي تم إنشاؤها خلال هذه الدراسات. هنا ، نصف طريقة تستخدم توتر الأكسجين المنخفض أو نقص الأكسجة للتخلص الانتقائي من خلايا CD45 + في مزارع BMSC. الأهم من ذلك ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة ليس فقط لتقليل الملوثات المكونة للدم ولكن أيضا لتعزيز النسبة المئوية ل MMPs و SSCs المفترضة في مزارع BMSC.

المقدمة

على غرار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، توجد الخلايا الجذعية المكونة للدم داخل البيئة المكروية للعظام. ومع ذلك ، على عكس الخلايا الجذعية السرطانية ، يوجد حاليا نقص في علامات سطح الخلية المقبولة عالميا والتي يمكن استخدامها لتحديد SSCs1،2،3 بشكل مستقبلي. ومع ذلك ، تظهر أنظمة الثقافة المختبرية وفحوصات إعادة التكوين في الجسم الحي أن نسبة من BMSCs لديها القدرة على دعم تكون الدم ، فضلا عن القدرة على التمايز إلى جميع خلايا السلالات الوسيطة4،5. وبالتالي ، في حين أن BMSCs تمثل مجموعة غير متجانسة للغاية ، فإن نسبة من هذه الخلايا لها سمات الخلايا الجذعية الحسنة النية ، كما هو محدد من خلال قدرتها على التجديد الذاتي وإعادة تكوين جميع خلايا أنسجتها الأصلية. علاوة على ذلك ، على عكس استخدام علامات سطح الخلية ، يمكن عزل BMSCs بسرعة بناء على التزامها السريع ببلاستيك زراعة الأنسجة6،7. لهذه الأسباب ، غالبا ما تستخدم BMSCs كبديل لSSCs 5.

بينما تم استخدام الالتزام التفضيلي ببلاستيك زراعة الأنسجة (TC) لعزل BMSCs بنجاح من الأنسجة البشرية ، فإن نماذج الفئران تمثل تحديات إضافية لهذه الطريقة. والجدير بالذكر أنه نظرا لأن الخلايا المكونة للدم في الفئران لديها القدرة على الالتصاق بكل من بلاستيك TC و BMSCs ، يحدث تلوث عالي المكونة للدم في هذا النظام النموذجي ، مما يعيق تفسير البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام طريقة العزلهذه 6.

والجدير بالذكر أن BMSCs موجودة في البيئة المكروية للعظام حيث تتراوح توترات الأكسجين من 1٪ -4٪ 8. ومع ذلك ، في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية ، يتم الحفاظ على حاضنات زراعة الخلايا عند مستويات الأكسجين في الغلاف الجوي بنسبة 21٪ ، وهو ما يمثل مستويات فوق الفيزيولوجية. لتسليط الضوء على الأهمية الوظيفية لهذه الاختلافات ، يرتبط زراعة الخلايا ذات الأصول الوسيطة بنسبة 21٪ من الأكسجين بزيادة موت الخلايا9،10. علاوة على ذلك ، فقد أظهرنا مؤخرا أن خلايا الدم والخلايا الوسيطة تستجيب بشكل تفاضلي لتوترات الأكسجين المنخفضة. على وجه التحديد ، هناك انخفاض كبير في أعداد الخلايا المكونة للدم CD45 + عندما يتم الحفاظ على ثقافات BMSCs في توترات منخفضة من الأكسجين. في الواقع ، لاحظنا انخفاضا بنسبة 90٪ في الخلايا المكونة للدم CD45 + باستخدام هذه التقنية11.

هنا ، نشارك بروتوكولا يمكن تنفيذه بسهولة للمختبرات لتقليل التلوث المكونة للدم بشكل كبير وتحسين نقاء الخلايا الوسيطة أثناء الزراعة الروتينية ل BMSCs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الطرق الموصوفة باستخدام نماذج الفئران وفقا لبروتوكولات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) المعتمدة (A187-19-08).

1. تشريح عظام الأطراف الخلفية

  1. القتل الرحيم إما من الذكور أو الإناث C57BL / 6 البالغة من العمر 10-12 أسبوعا عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 باستخدام معدل تدفق 2-4 لتر / دقيقة متبوعا بتأكيد الوفاة بقطع الرأس. يمكن استخدام الفئران من الإناث أو الذكور في هذا الاختبار مع عدم وجود اختلافات متوقعة في النتائج. رش الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. استخدم ملقطا جراحيا معقما ومقصا لعمل شق صغير في الجلد تحت القص. استخدم يديك لتمزيق الجلد حول محيط الجسم ثم اسحب الجلد بعيدا نحو الأطراف الخلفية لكشف الأنسجة الأساسية.
  3. استخدم ملقطا ومقصا جراحيا معقما لإزالة الطرف الخلفي برفق عن طريق فصل رأس الفخذ (الكرة) عن الحق (تجويف) الحوض (الورك). استخدم ملقطا معقما ومشرطا لكشط العظام برفق لإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
  4. استخدم مشرطا معقما لفصل عظم الفخذ والساق باستخدام الحد الأدنى من المقاومة لقطع الأربطة (الجانبية والوسطى ، الصليبية الأمامية والخلفية ، والوتر الرضفي [الرباط]) التي تربط العظمتين. الأهم من ذلك ، بعد الانفصال ، حافظ على اللقمة الموجودة على كل من عظم الفخذ البعيد والظنبوب القريب سليمة.
  5. بالنسبة لعظم الفخذ البعيد ، قم بعمل قطع بين رأس الفخذ والمدور الثالث وقطع عند المشاشية القريبة من لوحة النمو ، مما يقلل من الضرر الذي يلحق بلوحة النمو.
  6. بالنسبة للظنبوب القريب ، اصنع قطعا واحدا قريبا من الكعب الجانبي وقطع واحد بعيدا عن هضبة الظنبوبة القريبة من لوحة النمو.
  7. ضع عظم الفخذ والساق المقطوعة لأسفل في أنابيب فردية لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.

2. عزل BMSCs عن عظم الفخذ والساق

  1. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل في جهاز طرد مركزي على الطاولة وتدور عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ثانية.
  2. استخدم ملاقط معقمة لإزالة العظام بعناية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، مع ترك سدادة حمراء من نخاع العظم في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. إذا بقي بعض النخاع في عمود العظام ، فقم بنقل العظم إلى أنبوب جديد ، وكرر الدوران السريع ، واجمع الكريات في أنبوب واحد أثناء إعادة التعليق الخطوة 2.3.
  3. استخدم ماصة P1000 لإعادة تعليق حبيبات النخاع برفق في 500 ميكرولتر من وسائط النمو، MEMa مكملة بمصل بقري للجنين بنسبة 20٪ و 1,000 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين. انقل الخلايا اللحمية لنخاع العظم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 4.5 مل من وسط النمو.

3. تحلل خلايا الدم الحمراء

  1. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استنشق وسط النمو وأعد تعليق الحبيبات برفق في 1.5 مل من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 75-90 ثانية. قم بإخمادها على الفور ب 10 مل من وسائط النمو.
  3. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استنشق الوسائط وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط النمو للعد (انظر الخطوة 4).
    ملاحظة: يجب ألا تكون حبيبات الخلية حمراء بل بيضاء ، مما يشير إلى التحلل الناجح لخلايا الدم الحمراء. إذا كانت الحبيبات لا تزال حمراء ، فيمكن إجراء جولة إضافية من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء.

4. طلاء BMSCs

  1. لحساب الخلايا الحية للطلاء ، قم بإزالة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وأضف إلى 10 ميكرولتر من محلول Trypan Blue.
  2. ضع 10 ميكرولتر من الخلية: خليط محلول Trypan Blue على مقياس كثافة الدم واحسب الخلايا القابلة للحياة (غير الزرقاء). يجب أن تستبعد معظم الخلايا Trypan blue.
  3. بالنسبة لمقايسات المستعمرة ، قم بتقطيع الخلايا بكثافة 60,000 خلية / سم2 إلى قوارير ثقافة الأنسجة T-25 سم2 . بالنسبة لثقافات BMSC عالية الكثافة ، فإن الخلايا الصفيحية بكثافة 130،000 خلية / سم2 إلى أطباق زراعة الأنسجة 100 مم2 . استخدم حجما إجماليا قدره 5 مل لقوارير T-25 سم2 وحجم إجمالي 10 مل لأطباق 100 سم2 .
  4. احتضان الخلايا لمدة 3 ساعات إما بنسبة 1٪ -2٪ (نقص الأكسجة) أو 21٪ أكسجين (نورموكسيا) و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. للزراعة الروتينية ل BMSCs في توترات الأكسجين المنخفضة ، يمكن استخدام حاضنة الخلايا الناقصة للأكسجة أو غرفة نقص الأكسجة. اضبط كل أداة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بحيث يؤدي تدفق الغاز من النيتروجين وثاني أكسيد الكربون إلى النطاق المطلوب من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون2.
  5. بعد 3 ساعات ، اشطف الألواح بعناية 3x مع 1x PBS. لتجنب تعطيل الخلايا التي بدأت في الالتصاق، اشطفها برفق عن طريق إبطاء الشفط وسحب العينة على جانب أطباق زراعة الأنسجة.
  6. بعد شطف 1x PBS النهائي ، استبدل PBS ب 10 مل من وسائط النمو إذا كنت تستخدم أطباق 100 سم2 أو 5 مل من وسائط النمو إذا كنت تستخدم قوارير T-25 سم2 . بعد الشطف ، يجب إزالة معظم الخلايا العائمة.

5. الحفاظ على BMSCs في ظروف نقص الأكسجين

  1. بالنسبة للثقافات التي تعاني من نقص الأكسجة ، حافظ على الخلايا في غرفة نقص الأكسجة أو حاضنة مضبوطة على 1٪ -2٪ O2 و 5٪ CO2. بالنسبة للثقافات النورموكسيكية ، حافظ على الخلايا عند 21٪ O2 و 5٪ CO2. في حالة استخدام حاضنة نقص الأكسجين ، تأكد من فتح الأبواب بالحد الأدنى لمنع تدفق الأكسجين في الغلاف الجوي (21٪). قم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.
  2. بالنسبة لمقايسات المستعمرة ، احتضن الخلايا لمدة 7-10 أيام ، وبعد ذلك إما تعداد المستعمرات أو البدء في التمايز أو المقايسات الأخرى المرغوبة. في ظل ظروف نقص الأكسجين ، يمكن توقع ما بين 50-120 مستعمرة ، بينما في ظل الظروف الطبيعية ، يمكن توقع ما بين 5-30 مستعمرة.
  3. بالنسبة لثقافات BMSC عالية الكثافة ، احتضان الخلايا حتى التقاء ، حوالي 7-10 أيام للثقافات الناقصة للأكسجين وحوالي 14-21 يوما للثقافات النورموكسية. بمجرد التقاء الخلايا ، قم بتربسين الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين لاستخدامها في المقايسات المرغوبة.
  4. لتصور الخلايا ، ضع طبق زراعة الأنسجة على خشبة المسرح ، وقم بتدوير هدف الطور في المسار البصري ، وتأكد من تحديد شريط تمرير تباين الطور للهدف المقابل. عرض الخلايا إما بتكبير 100x أو 200x.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد 7 أيام من عزل الخلايا ، تكون الخلايا المزروعة بنسبة 21٪ من الأكسجين غير متجانسة للغاية. على وجه التحديد ، هناك تباين كبير في الحجم ، مع وجود خلايا ثنائية القطب أكبر متباعدة مع خلايا أصغر تحتوي على نتوءات متعددة (الشكل 1 أ). في المقابل ، فإن الخلايا التي تنمو في ظروف نقص الأكسجين متجانسة للغاية. الخلايا داخل المستعمرات متشابهة نسبيا في الحجم ولها مظهر ثنائي القطب ، يشبه الخلايا الأخرى ذات الأصول الوسيطة المزروعة على بلاستيك زراعة الأنسجة (الشكل 1 ب). عند الكث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بناء على ملاحظاتنا ، تلتزم BMSCs ببلاستيك زراعة الأنسجة في وقت أبكر من البلاعم والخلايا الأخرى ذات الأصول المكونة للدم11. لهذا السبب ، تعد ألواح الشطف بعد 3 ساعات من الطلاء خطوة حاسمة لأن هذا يزيل الخلايا المكونة للدم العائمة التي لديها القدرة على إرفاق نقاط زمنية لاحقة. علاوة على ذلك ، يجب أن تتم عمليات الشطف هذه بعناية ، وتحديدا عن طريق سحب الوسائط على جانب الطبق لمنع تعطيل BMSCs المستديرة والمرفقة بشكل فضفاض والتي لم تضع بعد مصفوفة وتنتشر على أطباق زراعة الأنسج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل قسم جراحة العظام في جامعة ديوك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 مم < سوب > 2 < / سوب> أطباق زراعة الأنسجةكورنينج353003
1x فوسفات موفري سالين (PBS)جيبكو100010-023
مقياس كثافة الدم ذو الخط الساطعسيجما ألدريتشZ359629
C57BL / 6Jمختبر جاكسون664
HyClone مصل الأبقار الجنيني (الولايات المتحدة) ، تميزGE Healthcare Life العلومSH30071.03
InvivO2< / sub> 400بيكر روسكينhttps://bakerco.com
MEM & alpha ؛ ، نيوكليوسيداتGibco12571-063
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)جيبكو15140-122
الدم الحمراء محلول العازلة Hybri-MaxSigma-AldrichR7757
T-25cm2  قوارير زراعة الأنسجةCorning430168
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرجيبكو25200-056
خلايا

المراجع

  1. Chen, K. G., Johnson, K. R., Robey, P. G. Mouse genetic analysis of bone marrow stem cell niches: technological pitfalls, challenges, and translational considerations. Stem Cell Reports. 9 (5), 1343-1358 (2017).
  2. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  3. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhjan, R. K., Lalykina, K. S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinetics. 3 (4), 393-403 (1970).
  5. Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
  6. Bearpark, A. D., Gordon, M. Y. Adhesive properties distinguish sub-populations of haemopoietic stem cells with different spleen colony-forming and marrow repopulating capacities. Bone Marrow Transplantation. 4 (6), 625-628 (1989).
  7. Kerk, D. K., Henry, E. A., Eaves, A. C., Eaves, C. J. Two classes of primitive pluripotent hemopoietic progenitor cells: separation by adherence. Journal Cell Physiology. 125 (1), 127-134 (1985).
  8. Spencer, J. A., et al. Direct measurement of local oxygen concentration in the bone marrow of live animals. Nature. 508 (7495), 269-273 (2014).
  9. Boregowda, S. V., et al. Atmospheric oxygen inhibits growth and differentiation of marrow-derived mouse mesenchymal stem cells via a p53-dependent mechanism: implications for long-term culture expansion. Stem Cells. 30 (5), 975-987 (2012).
  10. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nature Cell Biology. 5 (8), 741-747 (2003).
  11. Guo, W., et al. Hypoxia depletes contaminating CD45(+) hematopoietic cells from murine bone marrow stromal cell (BMSC) cultures: Methods for BMSC culture purification. Stem Cell Research. 53, 102317(2021).
  12. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  13. Naserian, S., Shamdani, S., Arouche, N., Uzan, G. Regulatory T cell induction by mesenchymal stem cells depends on the expression of TNFR2 by T cells. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 534(2020).
  14. Razazian, M., et al. Differences and similarities between mesenchymal stem cell and endothelial progenitor cell immunoregulatory properties against T cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 971-984 (2021).
  15. Ambrosi, T. H., Longaker, M. T., Chan, C. K. F. A revised perspective of skeletal stem cell biology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 189(2019).
  16. Krebsbach, P. H., Kuznetsov, S. A., Bianco, P., Robey, P. G. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine: An Official Publication of the American Association of Oral Biologists. 10 (2), 165-181 (1999).
  17. Harvey, D. M., Levine, A. J. p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts. Genes and Development. 5 (12), 2375-2385 (1991).
  18. Buravkova, L. B., Andreeva, E. R., Gogvadze, V., Zhivotovsky, B. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we. Mitochondrion. 19, 105-112 (2014).
  19. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD45

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.