تؤدي الزراعة الروتينية للخلايا اللحمية لنخاع العظم (BMSCs) إلى عزل مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، حيث تكون العديد من الخلايا من أصول مكونة للدم. هنا ، نصف طريقة تستخدم توتر الأكسجين المنخفض لتقليل الملوثات المكونة للدم بشكل كبير في مزارع الفئران BMSC.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام توتر الأكسجين المنخفض لتقليل الخلايا المكونة للدم في مزارع الخلايا اللحمية لنخاع عظم الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الوقت الحالي ، لا يزال هناك نقص في العلامات المقبولة عالميا لعزل مجموعة متجانسة من الخلايا الجذعية الهيكلية (SSCs) بشكل مستقبلي. لهذا السبب ، لا تزال BMSCs ، التي تدعم تكون الدم وتساهم في جميع وظائف الهيكل العظمي ، تستخدم على نطاق واسع لدراسة الأسلاف الوسيطة متعددة القدرات (MMPs) واستنتاج وظيفة SSC. علاوة على ذلك ، نظرا لاتساع نماذج الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة الأمراض العضلية الهيكلية ، فإن استخدام BMSCs يعمل أيضا كأداة قوية لفحص الآليات الجزيئية التي تنظم MMPs و SSCs. ومع ذلك ، فإن إجراءات العزل الشائعة لخلايا BMSC للفئران تؤدي إلى أن تكون أكثر من 50٪ من الخلايا المستردة من أصول مكونة للدم ، مما قد يعيق تفسير البيانات التي تم إنشاؤها خلال هذه الدراسات. هنا ، نصف طريقة تستخدم توتر الأكسجين المنخفض أو نقص الأكسجة للتخلص الانتقائي من خلايا CD45 + في مزارع BMSC. الأهم من ذلك ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة ليس فقط لتقليل الملوثات المكونة للدم ولكن أيضا لتعزيز النسبة المئوية ل MMPs و SSCs المفترضة في مزارع BMSC.
المقدمة
على غرار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، توجد الخلايا الجذعية المكونة للدم داخل البيئة المكروية للعظام. ومع ذلك ، على عكس الخلايا الجذعية السرطانية ، يوجد حاليا نقص في علامات سطح الخلية المقبولة عالميا والتي يمكن استخدامها لتحديد SSCs1،2،3 بشكل مستقبلي. ومع ذلك ، تظهر أنظمة الثقافة المختبرية وفحوصات إعادة التكوين في الجسم الحي أن نسبة من BMSCs لديها القدرة على دعم تكون الدم ، فضلا عن القدرة على التمايز إلى جميع خلايا السلالات الوسيطة4،5. وبالتالي ، في حين أن BM....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الطرق الموصوفة باستخدام نماذج الفئران وفقا لبروتوكولات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) المعتمدة (A187-19-08).
1. تشريح عظام الأطراف الخلفية
- القتل الرحيم إما من الذكور أو الإناث C57BL / 6 البالغة من العمر 10-12 أسبوعا عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 باستخدام معدل تدفق 2-4 لتر / دقيقة متبوعا بتأكيد الوفاة بقطع الرأس. يمكن استخدام الفئران من الإناث أو الذكور في هذا الاختبار مع عدم وجود اختلافات متوقعة في النتائج. رش الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- استخدم ملقطا جراحيا معقما ومقصا لعمل شق صغير في الجلد تحت القص. استخدم يديك لتمزيق الجلد ح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد 7 أيام من عزل الخلايا ، تكون الخلايا المزروعة بنسبة 21٪ من الأكسجين غير متجانسة للغاية. على وجه التحديد ، هناك تباين كبير في الحجم ، مع وجود خلايا ثنائية القطب أكبر متباعدة مع خلايا أصغر تحتوي على نتوءات متعددة (الشكل 1 أ). في المقابل ، فإن الخلايا التي تنمو في ظروف نقص الأكسجين متجانسة للغاية. الخلايا داخل المستعمرات متشابهة نسبيا في الحجم ولها مظهر ثنائي القطب ، يشبه الخلايا الأخرى ذات الأصول الوسيطة المزروعة على بلاستيك زراعة الأنسجة (الشكل 1 ب). عند الكث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بناء على ملاحظاتنا ، تلتزم BMSCs ببلاستيك زراعة الأنسجة في وقت أبكر من البلاعم والخلايا الأخرى ذات الأصول المكونة للدم11. لهذا السبب ، تعد ألواح الشطف بعد 3 ساعات من الطلاء خطوة حاسمة لأن هذا يزيل الخلايا المكونة للدم العائمة التي لديها القدرة على إرفاق نقاط زمنية لاحقة. علاوة على ذلك ، يجب أن تتم عمليات الشطف هذه بعناية ، وتحديدا عن طريق سحب الوسائط على جانب الطبق لمنع تعطيل BMSCs المستديرة والمرفقة بشكل فضفاض والتي لم تضع بعد مصفوفة وتنتشر على أطباق زراعة الأنسج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل قسم جراحة العظام في جامعة ديوك.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100 مم < سوب > 2 < / سوب> أطباق زراعة الأنسجة | كورنينج | 353003 | |
| 1x فوسفات موفري سالين (PBS) | جيبكو | 100010-023 | |
| مقياس كثافة الدم ذو الخط الساطع | سيجما ألدريتش | Z359629 | |
| C57BL / 6J | مختبر جاكسون | 664 | |
| HyClone مصل الأبقار الجنيني (الولايات المتحدة) ، تميز | GE Healthcare Life العلوم | SH30071.03 | |
| InvivO2< / sub> 400 | بيكر روسكين | https://bakerco.com | |
| MEM & alpha ؛ ، نيوكليوسيدات | Gibco | 12571-063 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) | جيبكو | 15140-122 | |
| الدم الحمراء محلول العازلة Hybri-Max | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| T-25cm2 قوارير زراعة الأنسجة | Corning | 430168 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمر | جيبكو | 25200-056 |
المراجع
- Chen, K. G., Johnson, K. R., Robey, P. G. Mouse genetic analysis of bone marrow stem cell niches: technological pitfalls, challenges, and translational considerations. Stem Cell Reports. 9 (5), 1343-1358 (2017).
- Baryawno, N., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
