يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تقسيم تجمعات Ubiquinone (CoQ) في غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) جزئيا إلى إنزيمات معقدة I أو تعتمد على FAD. ويمكن تقييم هذا التقسيم الفرعي بسهولة عن طريق مقايسة مقارنة باستخدام NADH أو السكسينات كمتبرعين بالإلكترونات في الميتوكوندريا المذابة المجمدة، حيث يقاس انخفاض السيتوكروم ج (cyt c). يعتمد الفحص على تأثير Na+ على IMM ، مما يقلل من سيولته. هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس نشاط NADH-cyt c oxidoreductase وأنشطة أوكسيدوريدوكتاز خلية سكسينات c في وجود كلوريد الصوديوم أو KCl. يتم قياس التفاعلات ، التي تعتمد على خليط الكواشف في كوفيت بطريقة تدريجية ، الطيف الضوئي خلال 4 دقائق في وجود Na + أو K +. يتم تنفيذ نفس الخليط بالتوازي في وجود مثبطات الإنزيم المحددة من أجل طرح التغيير غير المحدد في الامتصاص. لا ينخفض نشاط NADH-cyt c oxidoreductase في وجود أي من هذه الكاتيونات. ومع ذلك ، ينخفض نشاط أوكسيدوريدوكتاز السكسينات - cyt c في وجود كلوريد الصوديوم. تسلط هذه التجربة البسيطة الضوء على: 1) تأثير Na+ في تقليل سيولة IMM ونقل CoQ ؛ 2) أن المركبين الفائقين I+III2 يحمي نقل يوبيكينون (CoQ) من التأثر بخفض سيولة IMM؛ 3) أن نقل CoQ بين CI و CIII يختلف وظيفيا عن نقل CoQ بين CII و CIII. تدعم هذه الحقائق وجود برك CoQ متباينة وظيفيا في IMM وتظهر أنه يمكن تنظيمها بواسطة بيئة Na+ المتغيرة للميتوكوندريا.
المقدمة
نظام الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا (OXPHOS) هو المسار الرئيسي الذي يقود تخليق الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، واستهلاك المكافئات المختزلة ، مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) أو السكسينات ، بواسطة الميتوكوندريا. يتكون نظام OXPHOS من خمسة مجمعات بروتينية: المركب I (CI) يؤكسد NADH ويقلل من CoQ إلى يوبيكوينول (CoQH2). المركب الثاني (CII) يؤكسد السكسينات إلى فومارات ويقلل من CoQ إلى CoQH2. المركب الثالث (CIII) يؤكسد CoQH2 مرة أخرى إلى CoQ ، مما يقلل من السيتوكروم c (cyt c). أخيرا ، يؤكسد المركب IV (CIV) cyt c ويقلل من الأكسجين إلى الماء. تقترن سلسلة اختزال الأكسدة هذه ، ما يسمى بسلس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة للمركز الوطني للبحوث القلبية الوعائية كارلوس الثالث (CNIC) ، إسبانيا ، وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي المؤرخ 22 سبتمبر 2010 (2010/63/UE) والمرسوم الملكي الإسباني المؤرخ 1 فبراير 2013 (53/2013). وبذلت جميع الجهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتها.
ملاحظة: يتم وصف هذا الفحص المقارن لدراسة تجزئة برك CoQ الميتوكوندريا على النحو التالي:
1. تحديد كمية البروتين
- قم بتجميد وإذابة الميتوكوندريا المعزولة26 من كبد فأر من النوع البري ثلاث مرات (أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وترد أدناه النتائج النموذجية لهذا البروتوكول (الشكل 3). نظرا لأن الامتصاص المنخفض للخلية c يقع عند 550 نانومتر ، يجب أن تظهر جميع العينات الفرعية غير المثبطة زيادة في الامتصاص عند 550 نانومتر. تظهر العينات الفرعية المثبطة بشكل مثالي منحدرا مسطحا أو متزايدا قليلا (الشكل 3). يجب طرح المنحدرات من العينات الفرعية المثبطة من العينات الفرعية غير المثبطة.
وللعينتين ألف وباء، اللتان تم تصحيحهما بواسطة تثبيط مراسلهما واللتين تمثلان نشاط أكسيدو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن هذا البروتوكول يمثل إجراء مباشرا للغاية لتحديد وجود تجمعات CoQ المجزأة جزئيا ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها. يفضل إضافة الركائز (أي NADH أو السكسينات) أخيرا نظرا لاحتمال حدوث الأكسدة الذاتية لهذه المركبات. يجب أن يكون تقليب كوفيت حذرا لتجنب تكوين فقاعات قد تتداخل مع القراءة.
بالإضافة إلى ذلك ، تقدم التقنية الحالية بعض القيود التي تستحق الذكر. لا يتم إجراء القياسات في الميتوكوندريا السليمة. وبالتالي ، قد يؤدي المحتوى الاصطناعي ونسبة المخزن المؤقت إلى اختلافا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
مارتينيز - دي - مينا، و م. م. مونيوز - هيرنانديز، أ.، والدكتور س. خيمينيز و إ. ر. مارتينيز - خيمينيز على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل MICIN: RTI2018-099357-B-I00 و HFSP (RGP0016/2018). يتم دعم CNIC من قبل معهد Salud Carlos III (ISCIII) ، ووزارة العلوم ، و Innovación y Universidades (MCNU) ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (SEV-2015-0505). الشكل 2 تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| بروتين برادفورد | Bio-Rad | 5000001 | |
| السيتوكروم ج من قلب الخيول | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| حمض مالونيك | سيجما ألدريتش | M1296 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S9888 | |
| NADH | روش | 10107735001 | |
| سيانيد البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| برنامج Spectra Manager | JASCO | الإصدار 2 | |
| مقياس الطيف | للأشعة فوق البنفسجية / VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
المراجع
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory superc....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
