في نقاط الاشتباك العصبي ضادات في دماغ الثدييات ، ينشط الغلوتامات التي يتم إطلاقها قبل المشبكي المستقبلات المضمنة في غشاء ما بعد المشبكي1،2. تخضع قوة هذه الوصلات المشبكية للدونة المعتمدة على الخبرة ، وهي خاصية تسمح بأشكال متنوعة من التعلم والذاكرة3،4،5،6،7،8،9. تؤدي التغيرات المرضية في عدد نقاط الاشتباك العصبي وخصائص الإشارات الخاصة بها إلى تغيير نشاط الدائرة ومعالجة المعلومات المعروضة في العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية10،11،12. على هذا النحو ، هناك حاجة ماسة لفهم الآليات الأساسية التي تحكم الاتصال العصبي وقوة الوصلات المشبكية.
تتشكل نقاط الاشتباك العصبي المثيرة على العمود الفقري التغصني ، ونتوءات صغيرة بعد المشبكية تحتوي على بروتينات السقالة ، والمستقبلات ، وعوامل الإشارات ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، والعضيات المهربية1،2،13،14،15،16. تسمح مقصورات الإشارات بحجم الميكرون هذه بالتحكم في القوة المشبكية على أساس المشبك تلو الآخر13،16. يختلف مورفولوجيا العمود الفقري التغصني على طول التشعبات العصبية ، حيث توصف أشكال العمود الفقري عادة بأنها رقيقة أو خيلية الأرجل أو قصيرة أو فطر أو متفرعة13. الأهم من ذلك ، يرتبط شكل العمود الفقري بالوظيفة المشبكية والاستقرار. على سبيل المثال ، زادت الأشواك الأكبر من أعداد المستقبلات وقوة متشابكة أكبر16،17،18. على عكس الأشواك الرقيقة ، يمكن أن تستمر الأشواك الأكبر لأشهر في الجسم الحي ، وهي خاصية قد تسمح باتصالات متشابكة مستقرة وتخزين ذاكرة طويلة المدى19،20.
عادة ما يتم تتبع مورفولوجيا العمود الفقري وكثافته على طول التغصنات للتحقيق في درجة الاتصال العصبي وخصائص المشابك المثيرة داخل منطقة معينة من الدماغ ، في كل من الحالات الطبيعية والمرضية13. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لتصور مورفولوجيا العمود الفقري في مستحضرات الأنسجة المختلفة وأنظمة النمذجة باستخدام الفحص المجهري القياسي للضوء والفلورة ، بالإضافة إلى الدقة الفائقة والمجهر الإلكتروني (EM) 21. قدمت تقنيات التصوير القوية هذه نظرة ثاقبة لفهمنا الحالي لتنظيم الدماغ ووظيفته ومرضه. تتضمن مجموعة الطرق هذه تقنيات تصوير مهمة لمراقبة التعقيد المورفولوجي للتشعبات والعمود الفقري ، بالإضافة إلى أدوات البصريات الوراثية لتنشيط وقياس النشاط العصبي في التشعبات والعمود الفقري المفرد.
يقدم Pekarek et al.22 بروتوكولا سريعا نسبيا وعالي الإنتاجية لتصوير وتحديد بنية التشعبات العصبية العميقة داخل الأنسجة العصبية السليمة. يقوم المؤلفون بإجراء Clear Lipid-تبادل A Rigid Iالمهجن بcrylamide / التلوين المناعي / التهجين في الموقع المتوافق مع Tissue-hYdrogel (CLARITY) ، وهي تقنية لإزالة الأنسجة تزيل الدهون من أنسجة المخ وتساعد على تقليل تشتت الضوء أثناء التصوير اللاحق23. بعد المسح ، تم جمع أكوام Z من الخلايا العصبية التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر أو ثنائي الفوتون. سمح تحليل الصور والقياس الكمي الآلي بإجراء قياسات دقيقة لكثافة العمود الفقري وشكله ، بالإضافة إلى تعقيد الشجرة المتغصنة. يسمح هذا البروتوكول بالتصوير المتزامن للهياكل التي تتراوح من العمود الفقري المفرد إلى الأشجار المتغصنة ويزيل الخطوة التي تستغرق وقتا طويلا والتي يحتمل أن تكون ضارة لقطع المقطع الرقيق. ستكون هذه التقنية مفيدة للغاية للباحثين الذين يتطلعون إلى تحديد التغيرات في مورفولوجيا العمود الفقري والتعقيد التغصني في أنسجة المخ السليمة بعد إدخال أو إزالة الجين (الجينات) ذات الأهمية.
تم تطوير تلطيخ جولجي منذ أكثر من 100 عام24 ، ولا يزال أداة قوية لتصور تنظيم الجهاز العصبي ومورفولوجيا الخلايا العصبية. في هذه الطريقة ، يتم تلطيخ مجموعات متناثرة من الخلايا العصبية عن طريق البلورة الدقيقة لكرومات الفضة ، مما يسمح بتصور المحاور والأشجار المتغصنة والعمود الفقري25. يفصل فرانكفورت وبومان26 بروتوكولا سريعا لتشريب جولجي لتصور الخلايا العصبية والعمود الفقري التغصني في حصين الفئران وقشرة الفص الجبهي الإنسي. يوضح المؤلفون كيفية تحضير الأنسجة وتلطيخها وتصويرها للفحص المجهري الضوئي اللاحق ، بالإضافة إلى تحديد كثافة العمود الفقري على طول الأشجار التغصنية. ينتج عن البروتوكول الموصوف هنا تشريبا متسقا وموثوقا للخلايا العصبية ، ويقلل من التعرض للمواد الكيميائية السامة.
في حين أن الفحص المجهري للضوء والفلورة مناسب تماما لتصوير التشعبات والأشواك ، فإن EM يسمح بتصور دقة النانومتر للهياكل قبل وبعد المشبكي21. تستخدم مناهج EM عادة لقياس الخصائص الفوقية للمشابك ، بما في ذلك أبعاد كثافة ما بعد المشبكي ، بالإضافة إلى أعداد وحجم الحويصلات المشبكية21. في هذه المجموعة ، يوفر Śliwińska et al.27 بروتوكولا للحصول على صور EM ثلاثية الأبعاد (3D) عن طريق المسح الضوئي S erial Bقفل الوجه Electron Mالفحص (SBEM) في أنسجة فأر الحصين28،29. على وجه التحديد ، يصفون كيفية تحضير العينات ، وتضمين الأنسجة في الراتنج ، وتركيب العينات وتقليمها ، وإجراء SBEM ، وتحليل الصور لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. يولد هذا البروتوكول صورا عالية التباين مع أغشية محددة جيدا ويمكن تكييفها مع مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة.
أثناء تطور الجهاز العصبي ، تخضع الخلايا العصبية لتغيرات مورفولوجية جذرية حيث يتم تشكيل الوصلات المشبكية وصقلها بواسطة النشاط العصبي30،31. لتتبع النضوج العصبي في المخيخ النامي ، يوفر Chan et al.32 بروتوكولا للتثقيب الكهربائي بعد الولادة في الجسم الحي للخلايا العصبية الحبيبية النامية. هنا ، قام الباحثون بحقن الحمض النووي وتحويله بالكهرباء في الدماغ الخلفي لصغار الفئران بعد الولادة لنقل مجموعة متناثرة من الخلايا العصبية باستخدام البروتينات الفلورية. سمح الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة والتصوير ثلاثي الأبعاد للباحثين بتوصيف مورفولوجيا التشعبات والمخالب التغصنية على مدى عدة مراحل من تطور ما بعد الولادة. الأهم من ذلك ، أن هذا النهج يمكن أن يسمح بإدخال أو إزالة الجينات التي قد تؤثر على نضوج الخلايا الحبيبية ووظيفتها وستكون ذات أهمية كبيرة للباحثين الذين يدرسون تطور المخيخ ونضج الخلايا العصبية الحبيبية.
أخيرا ، تستخدم البروتوكولات التي أجراها كوينتاس كوندوري وميلر33 التصوير فائق الدقة34 ، وعلم البصرياتالوراثي 35 ، وتصوير الخلايا الحية لديناميكيات الكالسيوم36 لدراسة نشاط الخلايا العصبية GABAergic في الديدان الخيطية ، C. ايليجانس. باستخدام مجهر متحد البؤر مجهز للتصوير فائق الدقة37 ، يعبر المؤلفون عن بروتينات الفلورسنت في التشعبات لقياس تواتر أشكال العمود الفقري المختلفة. علاوة على ذلك ، يقوم المؤلفون بتقييم الوظيفة العصبية عن طريق التعبير عن بروتين بصري قبل المشبكي ومؤشر الكالسيوم بعد المشبكي. بعد التنشيط الضوئي للمحطات ، لوحظت عابرات الكالسيوم داخل العمود الفقري التغصني الفردي. تسلط هذه البروتوكولات ، جنبا إلى جنب مع النتائج الحديثة38 ، الضوء على الاستخدام المثير ل C. ايليجانس كنظام نموذجي قوي لتتبع مورفولوجيا العمود الفقري والنشاط المشبكي.
مجتمعة ، ستضيف البروتوكولات الموضحة في مجموعة الطرق هذه إلى صندوق الأدوات الغني بالفعل المتاح لتصور البنية العصبية والوظيفة21. من المحتمل أن يوفر تنفيذ هذه الأساليب في الدراسات المستقبلية رؤى إضافية حول العمليات التي تدفع اللدونة المشبكية المرتبطة بالتعلم والآليات الخلوية التي تكمن وراء حالات المرض.