فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية

الغشاء الحيوي الرقيق هو مجتمع من الميكروبات المرتبطة بالسطح أو الركام غير المرتبط المغلف بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS)^1,2. تحمي هذه المجتمعات الكائنات الحية الدقيقة المغلفة من الضغوطات البيئية ، بما في ذلك تحمل العوامل المضادة للميكروبات والجهاز المناعي³. تشكل العديد من الأنواع الميكروبية المسببة للأمراض الأغشية الحيوية التي ارتبطت بالعدوى المزمنة⁴. تطوير الأغشية الحيوية هو عملية معقدة تنطوي على التعلق بالأسطح ، وإنتاج EPS ، وتكاثر الخلايا ، وهيكلة الأغشية الحيوية ، وانفصال الخلية⁵. بمجرد أن تتشتت الخلايا لتشكل غشاء حيوي، فإنها تظل عوالق أو تنتقل إلى طبقة تحتية جديدة وتعيد بدء تطور الأغشية الحيوية⁶.

تتبع المكورات العنقودية الذهبية ، وهي ممرض انتهازي ، مخططا عاما لتطور الأغشية الحيوية ، بما في ذلك التعلق والانتشار والنضج والتشتت⁷. تملي عملية التعلق في الأغشية الحيوية S. aureus من خلال التفاعلات الكارهة للماء ، وأحماض teichoic ، ومكونات السطح الميكروبية التي تتعرف على جزيئات المصفوفة اللاصقة (MSCRAMMs)^8,9. مع بدء تكاثر العقدية الذهبية ، يتم إنتاج EPS ، الذي يتكون بشكل أساسي من السكريات والبروتينات والحمض النووي خارج الخلية وأحماض teichoic ،⁵. أثناء إنتاج مكونات EPS ، يتم أيضا إنتاج العديد من الإنزيمات الخارجية والجزيئات الصغيرة ، مما يساهم في بنية الأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد ويساعد في الانفصال⁵. تستفيد S. aureus من نمط الحياة المنسق للغاية هذا لإنشاء العديد من الالتهابات المزمنة ، بما في ذلك الالتهابات الناجمة عن سكن الأجهزة الطبية¹⁰.

تعد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) أحد الأسباب الرئيسية للعدوى المتعلقة بالأجهزة الطبية الساكنة ، مثل القسطرة الوريدية والبولية المركزية ، والمفاصل الاصطناعية ، وأجهزة تنظيم ضربات القلب ، وصمامات القلب الميكانيكية ، والأجهزة داخل الرحم¹¹. خلال مثل هذه العدوى ، تكون العدلات هي أول خلايا مناعية مضيفة يتم تجنيدها في موقع العدوى لمكافحة مسببات الأمراض عبر استراتيجيات متعددة¹². وتشمل هذه البلعمة ، وإزالة الحبيبات ، وإنتاج أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية (ROS / RNS) ، أو إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) للقضاء على مسببات الأمراض¹³.

يعد توليد أنواع الأكسجين التفاعلية عند البلعمة من الميكروبات أحد الاستجابات الرئيسية المضادة للميكروبات التي تظهرها العدلات¹⁴. تتعزز البلعمة إذا كانت الميكروبات مغلفة بالأوبسونين ، وخاصة الغلوبولين المناعي والمكونات التكميلية الموجودة في المصل¹⁵. ثم يتم التعرف على الميكروبات الأوبسونية بواسطة مستقبلات سطح الخلية على العدلات وتبتلعها ، وتشكل حجرة تسمى البلعمة¹⁵. تولد العدلات وتطلق أنواع الأكسجين التفاعلية في البلعمة عبر NADPH-oxidase¹⁶ المرتبط بالغشاء. يولد مركب الإنزيم متعدد المكونات هذا أنيونات الأكسيد الفائق عن طريق نقل الإلكترونات إلى الأكسجين الجزيئي¹⁶. بالإضافة إلى ذلك ، تولد العدلات أيضا RNS من خلال التعبير عن سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS)¹⁷. هذه الجذور عالية الأكسيد وأكسيد النيتريك داخل البلعمة لها أنشطة واسعة مضادة للميكروبات. يمكن أن تتفاعل مع المراكز المعدنية في الإنزيمات وتتلف الأحماض النووية والبروتينات والأغشية الخلوية لمسبب المرض¹⁸،¹⁹،^20،21. تتبنى العديد من الميكروبات أسلوب حياة الأغشية الحيوية وتوظف استراتيجيات مختلفة للتهرب من القتل بواسطة ROS^22,23. وبالتالي ، فإن المقايسات الموحدة التي تربط الأغشية الحيوية مع العدلات لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة للحصول على نتائج متسقة.

في حين أن المقايسات ، مثل تحديد إنتاج ROS العدلات ، توفر معلومات حول استجابات العدلات للأغشية الحيوية ، فإن القدرة على تصور تفاعلات العدلات داخل الأغشية الحيوية يمكن أن تكون أيضا بمثابة أداة قوية. غالبا ما يتطلب استخدام الأصباغ الفلورية للفحص المجهري تحسينا للحصول على صور عالية الجودة يمكن استخدامها لتحليل التصوير المجهري. المرونة لتحسين بعض الظروف محدودة حيث يمكن أن تخضع العدلات لموت الخلايا بعد العزل. علاوة على ذلك ، يتم غسل الأغشية الحيوية عادة لإزالة العوالق من الإعداد التجريبي قبل إضافة العدلات. أثناء الغسيل ، قد ينشأ التباين بين الأغشية الحيوية المكررة بسبب فقدان الكتلة الحيوية الجزئية إذا كانت الأغشية الحيوية ملتصقة بشكل فضفاض بالسطح.

على نطاق واسع ، تشمل الطرق الحالية في هذا المجال لتحليل التفاعلات بين العدلات والأغشية الحيوية بشكل أساسي الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي وتعداد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU)²⁴،^25،26،27. يتضمن الفحص المجهري استخدام الأصباغ التي إما تلطخ العدلات والأغشية الحيوية مباشرة ، أو تستهدف استجابات العدلات المختلفة ضد الميكروبات مثل تكوين NET ، والتحلل ، وموت الخلايا^25,28. يمكن أيضا تحليل مجموعة فرعية من هذه الاستجابات ، مثل موت الخلايا العدلة وتحلل الخلايا ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ولكنها تتطلب أن تكون العدلات غير مرتبطة بشكل تفضيلي بمجاميع كبيرة من الميكروبات في الغشاء الحيوي^28,29. يمكن لقياس التدفق الخلوي أيضا تحديد بعض معلمات الأغشية الحيوية ، مثل صلاحية الخلية²⁷. ومع ذلك ، تتطلب هذه العمليات تعطيل الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي ولن تكون مفيدة لتصور تفاعلات مهمة أخرى مثل التوزيع المكاني للعدلات ومكوناتها داخل الغشاء الحيوي²⁷،^29،30.

يركز البروتوكول الحالي على تكييف بعض الطرق المستخدمة تقليديا لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي على الأغشية الحيوية التي تم تحسينها لتوفير الحد الأدنى من التباين أثناء المناولة. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول طرقا موحدة لزراعة الأغشية الحيوية وقياسها كميا ، وعزل العدلات البشرية الأولية عن الدم المحيطي ، وتحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتصور تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات عبر الفحص المجهري. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة مختلفة لفهم تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات مع مراعاة عدم التجانس بين تجمعات المانحين.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة ولاية أوهايو (IRB) (2014H0154). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين لجمع الدم المحيطي لعزل العدلات البشرية الأولية. تم استخدام المكورات العنقودية الذهبية (USA300 LAC)³¹ ككائن نموذجي لإجراء التجارب. تم إجراء التجارب باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بسبب التعرض المحتمل لمسببات الأمراض المنقولة بالدم.

1. تحضير الأغشية الحيوية المختبرية

1. احصل على مستعمرات معزولة من S. aureus من مخزون محفوظ بالتبريد³¹ باستخدام تقنية لوحة مخططة^32,33 على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل Tryptic Soy Agar (انظر جدول المواد).
2. قم بتغطية الآبار الفردية للوحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من 0.001٪ (v / v) poly-L-Lysine (PLL) المخفف في H₂O المعقم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بشكل معقم ، قم بشفط محلول PLL باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الشفط في البروتوكول باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ ما لم ينص على خلاف ذلك.
3. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من S. aureus في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ألفا (MEMα) المكملة بجلوكوز 2٪ واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، وتهتز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة.
4. قم بتخفيف الثقافة الليلية عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى 5 مل من MEMα الطازج المكمل بجلوكوز 2٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، والاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى منتصف المرحلة اللوغاريتمية ، بشكل عام بين الكثافة البصرية 600 (OD_{600 نانومتر}) من 0.5-0.8. استخدم MEMα لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلى_{OD 600nm} من 0.1.
5. انقل 150 ميكرولتر من الاستزراع الطبيعي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا المعالجة ب BILL. احتضان ثابت لمدة 18-20 ساعة في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أيضا زراعة الأغشية الحيوية بتنسيقات أخرى مثل شرائح μ القناة (انظر جدول المواد).
6. نضح الطاف لإزالة الخلايا العوالق. اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس لإزالة الخلايا غير المرتبطة. أضف HBSS قطرة لتجنب تعطيل الغشاء الحيوي.
   ملاحظة: أثناء استنشاق المادة الطافية و HBSS أثناء الغسيل ، اترك سائلا كافيا (طاف أو HBSS) في الآبار التي تحتوي على غشاء حيوي بحيث لا يزال الغشاء الحيوي مغمورا. هذا يمنع تعطيل بنية الأغشية الحيوية عند إضافة HBSS بالتنقيط لغسل الغشاء الحيوي.
7. كرر الخطوة 1.6 مرتين أخريين على الأقل لإزالة جميع خلايا العوالق. في هذه المرحلة ، تكون الأغشية الحيوية جاهزة للتجارب الفورية في المصب.
   ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغشية الحيوية في تجارب العدلات ، فيمكن استبدال HBSS بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يفضل HBSS على PBS حيث يحتوي HBSS على مكونات ، بما في ذلك الجلوكوز ، التي توفر الظروف المثلى لتنشيط العدلات³⁴.

2. القياس الكمي للكتلة الحيوية للغشاء الحيوي

1. قم بإعداد مخزون بنسبة 0.1٪ (وزن / حجم) محلول بنفسجي بلوري (CV) (انظر جدول المواد) عن طريق الذوبان في 20٪ (v / v) إيثانول و 80٪ (v / v) H 2 O. تأكدمن إذابة السيرة الذاتية تماما في الإيثانول قبل إضافة H₂O. قم بتصفية وتعقيم المحلول.
2. أضف 150 ميكرولتر من محلول CV 0.1٪ إلى الغشاء الحيوي المغسول واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم ثلاثة آبار فارغة على الأقل كعناصر تحكم للوسائط فقط.
3. استنشاق محلول CV 0.1٪ من الأغشية الحيوية وغسل الأغشية الحيوية الملطخة ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. كرر هذه العملية لما مجموعه ثلاث غسلات لإزالة أي سيرة ذاتية زائدة من الآبار.
4. أضف 150 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي المخفف بنسبة 33٪ (v / v) المخفف ب H₂O. احتضان في درجة حرارة الغرفة على هزاز عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة للسماح للسيرة الذاتية المرتبطة بالكتلة الحيوية بالذوبان تماما.
   تنبيه: نفذ هذه الخطوة في غطاء التدفق الصفحي مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة لأن حمض الخليك الجليدي مادة كيميائية أكالة.
5. في غضون ذلك ، قم بإعداد قارئ الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد) لقراءة قيم صبغة السيرة الذاتية. بعد معالجة حمض الخليك الجليدي ، اقرأ اللوحة بطول موجة 595 نانومتر.
   ملاحظة: يمكن أن يتراوح الطول الموجي المستخدم لقياس OD ل CV من 500-600 نانومتر³⁵.

3. عزل العدلات

ملاحظة: تم عزل العدلات باتباع طريقة منشورة مسبقا مع تغييرات طفيفة³⁶. يجمع بروتوكول العزل هذا بين الطرد المركزي المتدرج الكثافة أولا ، يليه ترسيب ديكستران بنسبة 3٪. يغطي هذا القسم فقط بروتوكول عزل العدلات الشامل ، مع التركيز على التغييرات التي تم إجراؤها على البروتوكول المنشور. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أدناه هو أحد الطرق العديدة التي يمكنها عزل العدلات ، ويمكن استبدالها حسب الحاجة. تشمل الطرق الأخرى لعزل العدلات استخدام وسائط فصل الخلايا أو فصل خلايا الأجسام المضادة المغناطيسية³⁷.

1. سحب الدم من متبرع بالغ عن طريق بزل الوريد ، وفقا للبروتوكول الموضح في IRB المؤسسي. قبل سحب الدم ، تأكد من أن المحقنة تحتوي على ما يكفي من الهيبارين الخالي من المواد الحافظة ، بحيث يكون التركيز النهائي للهيبارين 20 وحدة / مل.
2. تمييع الدم الهيبارين مع 3/4 حجم خالية من السموم الداخلية 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (انظر جدول المواد) في H₂O في درجة حرارة الغرفة.
3. لكل 20 مل من عينة الدم المخففة ، حاصل 14 مل من وسط تدرج الكثافة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. ضع بعناية عينة الدم المخففة فوق وسط تدرج الكثافة.
4. جهاز طرد مركزي لعينة الدم ذات الطبقات عند 400 × جم لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن جهاز الطرد المركزي لديه كسر بطيء لتجنب إزعاج الطبقة بمجرد اكتمال الطرد المركزي.
   ملاحظة: ستحتوي عينة الدم على خمس طبقات تحتوي على خليط من المحلول الملحي والبلازما ، وطبقة خلية أحادية النواة ، ووسط تدرج الكثافة ، والعدلات ، وكريات الدم الحمراء.
5. باستخدام ماصة مصلية ، استنشاق جميع الطبقات فوق العدلات وحبيبات كرات الدم الحمراء ، متبوعة بإعادة تعليق لطيفة للحبيبات في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الخالي من السموم الداخلية الباردة في H₂O. لكل حبيبة تم إنشاؤها من عينة دم 20 مل ، أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى إلى إجمالي حجم 20 مل. أضف حجم 1: 1 من ديكستران 3٪ (انظر جدول المواد). احتضان الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 18-20 دقيقة على الجليد.
   ملاحظة: تأكد من أن ديكستران 3٪ مصنوع من كلوريد الصوديوم 0.9٪ خال من السموم الداخلية في H₂O.
6. قم بإزالة 20 مل من الطبقة العليا التي تحتوي على العدلات وبعض كريات الدم الحمراء على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 355 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب الطافت تاركا وراءه كرية حمراء.
7. أعد تعليق الحبيبات برفق في 10 مل من H₂O البارد والمعقم لمدة 30 ثانية لتحلل كريات الدم الحمراء المتبقية. أضف على الفور 10 مل من محلول ملحي بارد خال من السموم الداخلية بنسبة 0.9٪ إلى الخليط لاستعادة التوتر. جهاز طرد مركزي للمحلول عند 233 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على 95٪ -97٪ من العدلات في 1 مل HBSS بارد لكل 20 مل من عينة الدم.
9. نقل 10 ميكرولتر من العدلات المعاد تعليقها في 90 ميكرولتر من صبغة استبعاد التريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: الخلايا غير القابلة للحياة ملطخة باللون الأزرق لأن صبغة استبعاد التريبان الزرقاء غير منفذة في الخلايا القابلة للحياة. يوفر هذا البروتوكول >99٪ صلاحية الخلية^37,38.
10. أضف HBSS إضافيا بحيث يكون التركيز النهائي للعدلات 4 × 10⁶ خلايا / مل.
    ملاحظة: بالنسبة للحالات التي تتمتع فيها بصلاحية خلية <99٪ ، لا يزال من الممكن تحقيق التركيز النهائي البالغ 4 × 10⁶ خلايا / مل ؛ ومع ذلك ، فإن الحجم الكلي للمحلول الذي يحتوي على 4 × 10⁶ خلايا / مل تم الحصول عليها سينخفض. يمكن تعديل التركيز النهائي للعدلات وفقا لاحتياجات المستخدم التجريبية. تم إعادة تعليق العدلات بتركيز نهائي 4 × 10⁶ خلايا / مل لجميع التجارب الموضحة أدناه. لمراعاة التباين من مانح إلى متبرع ، يوصى بشدة بإجراء جميع التجارب التي تنطوي عليها العدلات مع ثلاثة متبرعين مختلفين على الأقل.

4. قياس أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنتجها العدلات

1. أضف 100 ميكرولتر من مصل بشري طبيعي بنسبة 20٪ (مخفف في HBSS) بالتنقيط إلى الغشاء الحيوي المغسول (الخطوة 1.6) واحتضانه عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة لمدة 30 دقيقة لامتصاص الغشاء الحيوي.
2. شفاط محلول المصل 20٪ واغسل الأغشية الحيوية بالتنقيط باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS مرة واحدة. نضح HBSS ، تاركا وراءه آبارا ذات أغشية حيوية أوبسونية.
   ملاحظة: لتفسير التجربة، يوصى بأربع مجموعات على الأقل: (أ) العدلات + الأغشية الحيوية، (ب) العدلات + PMA (التحكم الإيجابي، انظر جدول المواد)، (ج) العدلات فقط، (د) الأغشية الحيوية فقط.
3. أضف لومينول (انظر جدول المواد) إلى العدلات المعاد تعليقها في HBSS بتركيز 4 × 10⁶ خلايا / مل بحيث يكون تركيز اللومينول النهائي 50 ميكرومتر. هذا الحل جاهز للاستخدام للمجموعتين (أ) و(ج). أضف 4 × 10⁵ عدلات ممزوجة باللومينول إلى الآبار مع الأغشية الحيوية الأوبسونية.
4. في أنبوب منفصل ، قم بإعداد محلول لومينول 50 ميكرومتر في HBSS دون أي عدلات وأضفه إلى البئر الذي يحتوي على الأغشية الحيوية (المجموعة D).
5. حصة 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة مع اللومينول وإضافة phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) بتركيز نهائي قدره 500 نانوغرام / مل إلى الخليط. بالنسبة إلى المجموعة (ب)، أضف 4 × 10⁵ عدلات من هذا الخليط إلى آبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة السيطرة الإيجابية.
   ملاحظة: تركيز PMA المشار إليه في هذه الخطوة مرتفع نسبيا لضمان استجابة قوية للانفجار حيث أن العدلات المحفزة PMA هي عنصر تحكم إيجابي. يمكن استخدام PMA بتركيز أقل لتنشيط العدلات ، اعتمادا على التجربة.
6. جهاز طرد مركزي للوحة عند 270 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
7. تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية مع إعداد التلألؤ والقراءة الحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها 3 دقائق. ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة.
   ملاحظة: بالنسبة لهذا الفحص ، تمت زراعة الأغشية الحيوية في ألواح بيضاء تستخدم في فحوصات التلألؤ. PMA هو ناهض معروف لاستجابة الانفجار التأكسدي³⁹. عند إجراء دراسات تتضمن PMA ، تأكد من إضافة PMA في الخطوة الأخيرة بينما يكون المحلول الذي يحتوي على العدلات باردا لأن PMA يبدأ على الفور استجابة الانفجار.

5. تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات

1. قم بإعداد غشاء حيوي باستخدام الخطوات 1.2-1.6. لتسهيل التصوير بالأغشية الحيوية، استخدم سلالة فلورية من المكورات العنقودية الذهبية، مثل USA300 التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP)^40،41، لزيادة سهولة التصوير المجهري.
   ملاحظة: تم استخدام شريحة ذات 6 قنوات μ (انظر جدول المواد) بدلا من لوحة ذات 96 بئرا لتوضيح نموذج الأغشية الحيوية في المختبر (الخطوة 1).
2. احتضان 4 × 10⁶ خلايا / مل من العدلات مع 100 ميكرومتر من صبغة CMAC الزرقاء (7-أمينو-4-كلوروميثيل كومارين) (BCD ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في الروك عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. تأكد من تحضين العينات في الظلام والحد من التعرض للضوء للخطوات المتبقية.
3. لغسل BCD الزائد ، العدلات الطرد المركزي في 270 × غرام لمدة 5 دقائق وشفط الطاف. أعد تعليق العدلات في HBSS الطازجة. في هذه المرحلة ، أضف إيثيديوم هوموديمر -1 (انظر جدول المواد) إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي قدره 4 ميكرومتر لمراقبة العدلات والموت البكتيري.
4. أضف 150 ميكرولتر من العدلات إلى الغشاء الحيوي S . aureus الذي نما في شرائح μ ، بحيث تكون نسبة العدلات إلى البكتيريا 1:30 (العدلات: البكتيريا). احتضان شرائح μ في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة. يعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء غشاء حيوي لمدة 18 ساعة.
5. تصوير تفاعل العدلات والغشاء الحيوي باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة لأطوال موجات الإثارة والانبعاث للأصباغ / البروتينات الفلورية.
   ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، BCD هو 353/466 نانومتر ، إيثيديوم هوموديمر -1 هو 528/617 نانومتر ، و GFP هو 395/509 نانومتر. الحد من تعرض العينة لليزر أو الضوء لمنع التبييض الضوئي للعينات.
6. قم بتحليل الصور باستخدام برامج أو برامج تحليل الصور المجهرية مثل FIJI / ImageJ و COMSTAT2 و BiofilmQ و BAIT ، من بين العديد من البرامج الأخرى⁴²،^43،44،45.
   ملاحظة: عند العمل مع البقع ، من المهم مراعاة خصوصية الأصباغ المستخدمة. تعمل بعض البقع على الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، بينما يعمل البعض الآخر على خلية واحدة فقط. إذا تم تلطيخ العدلات والأغشية الحيوية بشكل منفصل باستخدام أصباغ يمكن أن تلطخ كلا النوعين من الخلايا ، فتأكد من غسل أي صبغة متبقية قبل الجمع بين العدلات والأغشية الحيوية لمنع تلطيخ متقاطع.

تؤثر الوسائط المستخدمة لزراعة الأغشية الحيوية البكتيرية على بقاء العدلات. تم اختبار وسائط مختلفة لتقليل تأثير الوسائط وحدها على صلاحية العدلات لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي (الشكل 1). تقلل وسائط النمو البكتيري مثل Tryptic Soy Broth من صلاحية العدلات ، بحيث ~ 60٪ من العدلات على قيد الحياة بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. لا تؤثر وسائط زراعة خلايا الثدييات ، مثل MEMα ، على صلاحية العدلات وتدعم نمو الأغشية الحيوية S. aureus. في الواقع ، يعزز الحد الأدنى من الوسائط النمو القوي للأغشية الحيوية في البكتيريا الأخرى46,47.

لتقييم تأثير الوسائط على نمو الأغشية الحيوية والتباين في تحديد كمية الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي بعد غسل الكتلة الحيوية للقضاء على الخلايا العوالق ، تم زراعة غشاء حيوي S. aureus لمدة 18 ساعة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مع معالجة الآبار أو معالجتها باستخدام poly-L-Lysine. تم استخدام وسائط غنية بالمغذيات (مرق الصويا التربتيك (TSB)) والحد الأدنى (MEMα) كما هي أو مكملة بجلوكوز 2٪. كشفت الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي الملطخة بالسيرة الذاتية أن الغشاء الحيوي S . aureus المزروع في MEMα المكمل بجلوكوز 2٪ أنتج الغشاء الحيوي الأقوى بين جميع الوسائط المختبرة (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، أظهرت الأغشية الحيوية المزروعة في آبار PLL المعالجة مسبقا التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز تباينا أقل من الأغشية الحيوية في الآبار غير المعالجة التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز. أظهرت هذه الأغشية الحيوية تباينا أقل في القياس الكمي عبر مقايسة CV35 و CFU / mL عند طلائها بعد التعامل بدقة مع الأغشية الحيوية لتحديد كمية الكتلة الحيوية. تحتوي هذه الأغشية الحيوية ، في المتوسط ، على 1 × 108 CFU / مل ، كما يتضح من طلاء الأغشية الحيوية في 3 أيام منفصلة (الشكل 2B). هذا الرقم مفيد في تحديد عدد العدلات التي يجب إضافتها إلى الأغشية الحيوية لمقايسات وظائف العدلات.

لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات استجابة للأغشية الحيوية ، تمت زراعة الأغشية الحيوية S. aureus بشكل ثابت لمدة 18-20 ساعة في لوحة 96 بئرا. ثم تم استخدام الأغشية الحيوية ، وأضيفت العدلات. ثم تم قياس إنتاج ROS لمدة 60 دقيقة (الشكل 3 أ). يتم حساب المساحة الموجودة أسفل المنحنى من المنحنى الحركي لتحديد إجمالي إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات. تظهر العدلات المعالجة بناهض ، مثل PMA ، المستخدمة كعنصر تحكم ، زيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. في غياب الأغشية الحيوية ، أظهرت العدلات المعالجة ب PMA إنتاجا قويا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). في وجود S. aureus biofilm ، انخفض إجمالي إنتاج ROS بواسطة العدلات المعالجة ب PMA. في غياب PMA ، تعتمد العدلات فقط على تفاعلها مع الغشاء الحيوي ، مما يقلل من كمية أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة (الشكل 3 ب).

لتصور تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي باستخدام المجهر الفلوري ، تم استخدام سلالة معبرة عن GFP من S. aureus وصبغة Blue CMAC و ethidium homodimer-1 ، التي تلطخ سيتوبلازم الخلايا الحية والحمض النووي للخلايا الميتة ، على التوالي. نمت S. aureus biofilm لمدة 18 ساعة في شريحة 6 μ القنوات. تمت إضافة العدلات الزرقاء ذات العلامات الصبغية CMAC جنبا إلى جنب مع إيثيديوم هوموديمر-1 إلى الأغشية الحيوية المغسولة وتم تحضينها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 قبل التصوير. كشف الفحص المجهري الفلوري واسع المجال أن العديد من العدلات كانت موضعية على سطح الأغشية الحيوية S. aureus ، في حين أن القليل منها موجود داخل الغشاء الحيوي (الشكل 4 أ). كان التفاعل بين خلايا المكورات العنقودية الذهبية داخل العدلات واضحا أيضا (الشكل 4C). كانت معظم خلايا S. aureus التي تتفاعل مع العدلات (سماوي) ميتة (أرجوانية) ، بينما بقي عدد قليل منها على قيد الحياة (أصفر) كما هو محدد من خلال تلطيخ الأحياء والموتى (الشكل 4C). وعلى سبيل المقارنة، كانت الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية المعبرة عن GFP ملطخة بإيثيديوم هوموديمر-1، والتي كشفت عن جزء صغير من أعداد المكورات العنقودية الذهبية الميتة داخل الأغشية الحيوية (الشكل 4 ب). تم قياس العدلات غير القابلة للحياة التي كانت إيجابية ل ethidium homodimer-1 باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد) بعد الحضانة مع الأغشية الحيوية S. aureus. ما يقرب من 48 ٪ من العدلات قد ماتت بالفعل في غضون 30 دقيقة من الحضانة مع S. aureus biofilm. أثناء تحسين بروتوكول الفحص المجهري ، تم أيضا تقييم تأثير غسل الأغشية الحيوية والعدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة لإزالة العدلات غير الملتصقة ، مما كشف عن حوالي 33٪ من العدلات الميتة التي لا تزال مرتبطة بالغشاء الحيوي (الشكل 4 د).

الشكل 1: يقارن اختبار LIVE-DEAD بقاء العدلات بين وسائط النمو البكتيرية والثدييات. تم عزل العدلات وحضنها في HBSS أو MEMα أو TSB أو 0.1٪ SDS لمدة 30 دقيقة. تم إجراء تلطيخ LIVE-DEAD باستخدام Calcein AM (حي) وإيثيديوم هوموديمر -1 (ميت). تم تحديد النسبة المئوية للعدلات الحية ، حيث تم التعامل مع العدلات المحتضنة HBSS على أنها عدلات حية بنسبة 100٪. تمثل النتائج في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ ، مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (* p < 0.05 ، ****p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: القياس الكمي للكتلة الحيوية للأغشية الحيوية في ظروف مختلفة وعدد الصلاحية البكتيرية للأغشية الحيوية المزروعة في الظروف المثلى. (أ) تم زرع S. aureus في صفيحة مكونة من 96 بئرا إما مطلية أو غير مطلية ببولي L-Lysine (PLL). نمت الأغشية الحيوية في TSB أو MEMα أو أي من الوسائط المكملة بجلوكوز 2٪ في ظل ظروف ثابتة لمدة 18 ساعة. تم إجراء تلطيخ الكريستال البنفسجي (CV) لتلطيخ الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي. تم تخفيف وصمة عار السيرة الذاتية في الساعة 1:10 وقراءتها في قارئ الصفيحة الدقيقة. تمثل النتائج في المتوسط ثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. يظهر SD لكل مجموعة في الأسفل لإظهار تباين ظروف نمو الأغشية الحيوية المختلفة. (ب) تم الحصول على عدد CFU البكتيري من الأغشية الحيوية المزروعة في وسط محسن (MEMα + 2٪ جلوكوز). تم إخضاع الأغشية الحيوية الثابتة لمدة 18 ساعة لنفس العدد من عمليات الغسيل متبوعة بصوتنة لمدة 10 دقائق لتخفيف الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي وتمريرها عبر إبرة 22G لتعطيل الركام قبل الطلاء. تمثل النتائج ثلاث نسخ مكررة يتم إجراؤها في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (ns = غير مهم. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: القياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات عن طريق مقايسة التلألؤ الكيميائي. (أ) تم تحضين العدلات (PMN) بأغشية حيوية S. aureus المغسولة HBSS (BF) إما في وجود (مثلث رمادي مغلق) أو غياب (مثلث رمادي مقلوب مفتوح) ل PMA لقياس إنتاج ROS بواسطة العدلات. تم استخدام Luminol للكشف عن ROS كل 3 دقائق لمدة 60 دقيقة في قارئ microplate. في حين أن العدلات التي عولجت ب PMA في غياب الأغشية الحيوية (الدائرة السوداء المغلقة) كانت بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، فإن مجموعات العدلات فقط (الدائرة السوداء المفتوحة) والأغشية الحيوية فقط (المثلث الرمادي المفتوح) كانت بمثابة عناصر تحكم سلبية. تمثل البيانات في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. (ب) تم حساب المساحة تحت المنحنى من (A) لتحديد إجمالي ROS الناتج عن العدلات. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. (***p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تصور التفاعل بين الغشاء الحيوي للمكورات العنقودية الذهبية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تم استكمال العدلات الزرقاء CMAC ذات العلامات الصبغية (السماوي) بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني ؛ ميت) قبل الحضانة بغشاء حيوي S. aureus 18 ساعة (أصفر). تم تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال ومعالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور. أجريت التجارب مع ثلاثة متبرعين مختلفين. يتم تقديم الصور التمثيلية على النحو التالي: (أ) عرض ثلاثي الأبعاد ل S. aureus biofilm مع العدلات الحية (السماوية) والميتة (أرجواني ؛ يشار إلى عدد قليل منها بأسهم بيضاء) ، (B) منظر ثلاثي الأبعاد لغشاء حيوي S. aureus في حالة عدم وجود عدلات مع S. aureus الحية التي تعبر عن GFP (الأصفر) أو الميتة S. aureus ملطخة بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني) ، (C) منظر متعامد للمكورات العنقودية الذهبية وتفاعل العدلات كما هو موضح في المستويات xy و yz و xz ، و (D) القياس الكمي لصلاحية العدلات في وجود الأغشية الحيوية S. aureus بعد 30 دقيقة إما على الفور (غير مغسولة) أو بعد ثلاث جولات من الغسيل باستخدام HBSS لإزالة العدلات غير الملتصقة (المغسولة). يتم تقديم موت خلايا العدلات كمتوسط ± SD (اختبار t للطالب). يشير شريط المقياس إلى 50 ميكرومتر في (A) و (B) و 10 ميكرومتر في (C). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.