مقالة منهجية

التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63778

⸱

مايو 19, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

في هذه المقالة

ملخص

الغشاء السفلي ضروري لتشكل الأنسجة والأعضاء أثناء التطوير. لفهم أفضل للآليات التي تؤدي إلى وضع هذا الهيكل بشكل صحيح ، يصف البروتوكول المقدم طرقا لتصور وتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي في الخلايا الظهارية باستخدام المجهر البؤري وفائق الدقة.

الملخص

الغشاء السفلي (BM) - وهو ورقة متخصصة من المصفوفة خارج الخلية الموجودة في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية - أمر بالغ الأهمية لإنشاء وصيانة مورفولوجيا الأنسجة الظهارية ومورفوجينيا الأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن BM ضروري لنمذجة الأنسجة ، حيث يعمل كمنصة إشارات ، ويوفر قوى خارجية لتشكيل الأنسجة والأعضاء. على الرغم من العديد من الأدوار الهامة التي يلعبها BM أثناء التطور الطبيعي والظروف المرضية ، فإن المسارات البيولوجية التي تتحكم في الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وكيف يؤدي الإفراز القاعدي إلى الترسيب المستقطب لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي ممتاز لدراسة الترسيب القاعدي لبروتينات غشاء BM ، لأنها تنتج وتفرز جميع المكونات الرئيسية ل BM. يسمح التصوير البؤري والفائق الدقة جنبا إلى جنب مع معالجة الصور في الأنسجة الثابتة بتحديد وتوصيف العوامل الخلوية المشاركة على وجه التحديد في الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM. تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ وتصوير الحويصلات المحتوية على BM و BM المودعة باستخدام بروتينات موسومة داخليا في الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة . يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعالجة كل من الأسئلة النوعية والكمية وتم تطويره لاستيعاب الفحص عالي الإنتاجية ، مما يسمح بالتحديد السريع والفعال للعوامل المشاركة في الاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز الحويصلات أثناء تطور الأنسجة الظهارية.

المقدمة

الغشاء السفلي (BM) هو ورقة رقيقة من مصفوفة خارج الخلية ملتصقة بالخلايا (ECM) ذات طبقات ضرورية للبنية الظهارية والتشكل1. وهو يتألف من ~ 50 بروتينا ويوجد في كل مكان وراء الخلايا الظهارية والبطانية ، ويغلف خلايا العضلات الهيكلية والملساء والقلبية والخلايا الشحمية1،2،3. المكونات الرئيسية الثلاثة ل BM في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية هي الكولاجين الرابع والبيرليكان واللامينين. BM يكمن وراء الخلايا الظهارية وهو مسؤول عن العديد من الوظائف ، بما في ذلك فصل الأنسجة وحاجزها ، والنمو والدعم ، واستقطاب الخلايا2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 . دورها كمنصة إشارات ينظم مورفولوجيا وتمايز الخلايا والأنسجة الظهارية أثناء التطور3،13،14. علاوة على ذلك ، فإن سوء تنظيم BM و / أو خرق سلامته هما السببان الرئيسيان للعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك ورم خبيثورم 2،15،16. على الرغم من الوظائف الأساسية التي يؤديها BM أثناء تكوين الأنسجة والأعضاء ، فإن مكونات المسار (المسارات) البيولوجية المخصصة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM معروفة بشكل غامض.

لدراسة الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وإفراز بروتينات BM بواسطة الخلايا الظهارية ، فإن الظهارة الجريبية (FE) لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي قوي (الشكل 1). يتكون مبيض ذبابة الفاكهة من 16-20 بنية طويلة تشبه الأنبوب ، تسمى المبيضات (الشكل 1A ، B) 17،18،19. يمكن اعتبار كل مبيض خط تجميع البيض ، مع التقدم العمري لغرف البيض (التي تؤدي كل منها إلى بويضة) التي تبدأ في الطرف الأمامي وتتحرك خلفيا ، حتى تخرج البويضة الناضجة عبر قناة البيض. يتم تغليف كل غرفة بويضة بواسطة FE ، وهي طبقة أحادية من خلايا الجريب الجسدية (FCs) ، التي تحيط بخلايا الخط الجرثومي المركزي (GCs). FE مستقطب للغاية مع قطبية قطبية قطبية قاعية مميزة حيث يواجه المجال القمي الخط الجرثومي ، ويتم إفراز بروتينات BM بشكل أساسي18,19. تفرز FCs بنشاط جميع المكونات الرئيسية ل BM ، بما في ذلك الكولاجين الرابع والبيرليكان و Laminins20,21. في الخلايا الظهارية مثل FCs ، يتم إنتاج مكونات BM وتتطلب مسار إفراز مستقطب متخصص لترسيبها خارج الخلايا. على سبيل المثال ، في حالة المكون الأكثر وفرة في BM ، الكولاجين IV (Coll IV) ، فإن التفاصيل المحيطة بالاتجار والإفراز المستقطبين داخل الخلايا غامضة على الرغم من أن إنتاجه وترسيبه هما محور العديد من الدراسات. يتم ترجمة Coll IV في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والتي يتم فيها أيضا تجميع كل ليف - يتكون من ثلاثة ببتيدات متعددة (سلسلتان α1 وسلسلة α2 واحدة) - في حلزون ثلاثي22. يتطلب الطي السليم ل Coll IV ووظيفته مرافقات وإنزيمات ER ، بما في ذلك lysyl و prolyl-hydroxylases مثل Plod و PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. تنظم هذه الإنزيمات ما بعد الانتقالية فرز ER ل Coll IV ، حيث يؤدي فقدان كل منها إلى محاصرة Coll IV في ER القاعدي20,23,24,25,26. بعد ذلك ، يخرج Coll IV المركب حديثا من ER ل Golgi في الحويصلات المغلفة ب COPII. يساعد مستقبل الشحن Tango1 في تعبئة الكولاجين في حويصلات كبيرة مرتبطة ب Golgi يمكنها استيعاب بروتينات كبيرة متعددة الوسائط20,27. بمجرد تعبئة Coll IV في حويصلات خارجية داخل الخلايا ، يتم إفرازه بشكل أساسي من الخلايا الظهارية. لتوجيه ترسب BM إلى الجانب القاعدي ، تتطلب الخلايا الظهارية مجموعة أخرى من العوامل المخصصة خصيصا لإفراز BM المستقطب. باستخدام FE من مبيض ذبابة الفاكهة ، تم توصيف بعض مكونات هذه العملية الخلوية الجديدة ، بما في ذلك عوامل تبادل النيوكليوتيدات (GEFs) Crag و Stratum ، و GTPases Rab8 و Rab10 ، بالإضافة إلى مستويات phosphoinositide PI (4,5) P2 ، و Kinesin 1 و 3 البروتينات الحركية 20,28,29,30,31 . هذه المكونات حاسمة في ضمان التوزيع المستقطب لبروتينات BM.

لمراقبة التوطين داخل الخلايا لبروتينات BM في FE ، يمكن استخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا (مصائد البروتين) ، مثل Viking-GFP (Vkg-GFP أو α2 Coll IV-GFP) و Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. وقد ثبت أن خطوط فخ البروتين هذه تعكس بدقة التوزيع الداخلي لبروتينات BM وتسمح باكتشاف أكثر حساسية للاتجار الحويصلي28,30. تم تمييز المكونات المشاركة في الترسيب المستقطب ل BM في FE لأول مرة باستخدام خطوط مصيدة البروتين ل Vkg-GFP و Pcan-GFP 20,28,29,30. يمكن استخدام مصائد البروتين في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الطفرات وخطوط Gal4 34. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مصائد البروتين مع أصباغ الفلورسنت و / أو تلطيخ المناعة الفلورية ، مما يسمح بتوصيف دقيق لتوطين بروتينات BM عند مقارنة النوع البري والظروف الطافرة35.

لتقييم توزيع وتوطين الحويصلات المحتوية على بروتين BM بدقة وكفاءة، يقدم الفحص المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) وتقنيات التصوير فائقة الدقة ميزة كبيرة لأساليب التصوير الأخرى. تجمع هذه الأساليب بين التصوير عالي الدقة وسهولة الاستخدام النسبية. CLSM هي تقنية الفحص المجهري التي تسمح بتحسين الدقة البصرية عن طريق مسح العينة بالليزر بطريقة المسح النقطي باستخدام الجلفانومترات. فتحة الثقب هي مكون أساسي في المجهر البؤري. من خلال حجب الإشارات خارج التركيز البؤري القادمة من أعلى أو أسفل المستوى البؤري، ينتج عن فتحة الثقب دقة فائقة للغاية في المحور z36. هذا يجعل من الممكن أيضا الحصول على سلسلة من الصور في المستوى z ، تسمى z-stack ، المقابلة لسلسلة من الأقسام البصرية. تقوم مكدسات z لاحقا بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للعينة ، عبر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ، بمساعدة برنامج التصوير. تسمح المجاهر التقليدية الفائقة التألق (واسعة المجال) ، على عكس المجاهر البؤرية ، للضوء خارج التركيز البؤري بالمساهمة في جودة الصورة ، مما يقلل من دقة الصورة والتباين36,37. وهذا يجعل المجهر الفائق التألق مرشحا أقل جاذبية عند دراسة توطين البروتين أو التوطين المشترك.

على الرغم من أن CLSM هو نهج مناسب لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك التصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا من بروتينات BM ، إلا أنه لا يزال يمثل مشكلة عند تصوير عينات أقل من حد حيود آبي للضوء (200-250 نانومتر). عند تصوير مثل هذه العينات ، يمكن أن يؤدي الفحص المجهري البؤري ، خاصة عند استخدام هدف نفطي ، إلى دقة عالية. ومع ذلك ، فإن تقنيات الدقة الفائقة تتجاوز حد الفحص المجهري البؤري. هناك العديد من الأساليب لتحقيق الفحص المجهري فائق الدقة ، لكل منها حدود دقة محددة ، وكل منها مناسب للتحليلات المختلفة. وتشمل هذه النهج مجهر التوطين المنشط ضوئيا (PALM) أو المجهر البصري العشوائي لإعادة البناء (STORM) ، والفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، ومجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر Airyscan (فائق الدقة)38،39،40،41،42،43،44،45،46 . على الرغم من أن Airyscan لديه دقة أكثر خشونة من PALM / STORM ، STED ، و SIM ، إلا أنه لا يزال بإمكانه تحقيق دقة تصل إلى ~ 120 نانومتر (حوالي ضعف دقة CLSM). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن نهج الفحص المجهري فائق الدقة هذا يتمتع بميزة على بطاقة SIM وغيرها من التقنيات فائقة الدقة عند تصوير عينات سميكة وعينات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة47,48.

Airyscan هي تقنية مجهرية بؤرية فائقة الدقة جديدة نسبيا46. على عكس CLSMs التقليدية ، التي تستخدم كاشفات الثقب والنقطة الواحدة لرفض الضوء خارج التركيز البؤري ، يستخدم هذا النهج فائق الدقة كاشف منطقة أنبوب المضاعف الضوئي لأنبوب الزرنيخيد الغاليوم (GaAsP) المكون من 32 قناة والذي يجمع كل الضوء في كل موضع مسحضوئي 45. يعمل كل جهاز من أجهزة الكشف ال 32 كثقب صغير ، مما يقلل من حجم الثقب من وحدة 1.0 Airy Unit التقليدية (A.U.) إلى 0.2 A.U. المحسنة ، مما يتيح دقة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء ، مع الحفاظ على كفاءة قطر 1.25 A.U.45. علاوة على ذلك ، فإن فك الالتفاف الخطي المستخدم من قبل Airyscan يؤدي إلى زيادة تصل إلى 2x في الدقة45. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، فإن CLSM ، وتحديدا الفحص المجهري فائق الدقة ، مناسب تماما لدراسة بروتينات BM والبروتينات التي تنظم الترسيب القاعدي لبروتينات BM ، حيث يمكنها إنتاج صور عالية الدقة للغاية لدراسات التوطين والتوطين المشترك ، وبالتالي توفير رؤى جديدة في الأحداث المكانية والزمانية والجزيئية التي تتحكم في هذه العمليات.

هناك نهج بديل للفحص المجهري البؤري الذي يمكن استخدامه لإجراء تجارب التوطين وهو إزالة التفاف الصورة. نظرا لأن الفحص المجهري واسع المجال يسمح للضوء خارج نطاق التركيز البؤري بالوصول إلى أجهزة الكشف ، يمكن تطبيق خوارزميات إزالة الالتفاف الرياضية والحسابية لإزالة أو إعادة تعيين الضوء خارج التركيز البؤري من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري واسع المجال ، وبالتالي تحسين دقة وتباين الصورة49. يمكن أيضا تطبيق خوارزميات فك الالتفاف على الصور متحدة البؤرة لزيادة الدقة والتباين ، مما ينتج صورا نهائية مماثلة تقريبا لتلك الموجودة في المجهر فائق الدقة50. تستفيد Airyscan من إزالة الالتفاف القائمة على مرشح Weiner إلى جانب إعادة تعيين بكسل Sheppard ، مما يؤدي إلى دقة مكانية محسنة للغاية ونسبة إشارة إلى ضوضاء. بالمقارنة مع المجهر البؤري ، لوحظت زيادة قدرها 2x في الدقة في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة (120 نانومتر في x و y ، و 350 نانومتر في z) عند استخدام تقنية الفحص المجهري فائقة الدقة45,51.

توفر هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة ومحسنة لتلطيخ واكتساب وتصور الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM باستخدام FE لمبيض ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي إلى جانب الفحص المجهري البؤري وفائق الدقة. خطوط ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، على سبيل المثال ، Vkg-GFP و Pcan-GFP ، هي أدوات فعالة ودقيقة لتصور الاتجار ببروتين BM وإفرازه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامها بسهولة في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الخطوط المتحورة و Gal4 / UAS 34. على الرغم من التوصية باستخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، إلا أن استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات BM محددة متوافق أيضا مع البروتوكولات الموصوفة. هذه البروتوكولات مفيدة بشكل خاص للعلماء المهتمين بدراسة الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM في الأنسجة الظهارية السليمة باستخدام التصوير البؤري وفائق الدقة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على الجمع بين تحليل الأنسجة الظهارية والأدوات الواسعة لعلم الوراثة ذبابة الفاكهة تجعل هذا النهج قويا بشكل خاص. وأخيرا، يمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لدراسة الاتجار بالحويصلات وفرز البروتينات الأخرى ذات الأهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. يطير التحضير لتسلخ المبيض

  1. ضع 10-15 ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ذبابة الفاكهة (1-2 أيام من العمر 1-2 أيام) من النمط الوراثي المطلوب في قارورة ضيقة تحتوي على ~ 8 مل من ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة المتوسطة مع رشها بكمية صغيرة من خميرة الخباز المحببة قبل 2-3 أيام من تشريحها عند 25 درجة مئوية. إضافة عدد قليل من الذكور إلى القارورة يمكن أن يعزز غلة غرفة البيض. ومع ذلك ، تأكد من أن العدد الإجمالي للذباب لا يتجاوز 20 لأن هذا يمكن أن يؤثر سلبا على نمو المبيض.
    ملاحظة: يمكن العثور على وصف ذبابة الفاكهة ذكورا وإناثا ، ونصائح ونصائح مفيدة للعلماء دون خبرة سابقة في ذبابة الفاكهة في المقالات المذكورة 34,52. إضافة الخميرة سوف تحفز إنتاج البيض وتولد المبيضين مع مراحل مختلفة ممثلة. علاوة على ذلك ، فإنه سيسمن المبيضين ويسهل استئصاله. يمكن أيضا استخدام الخميرة الرطبة بدلا من الخميرة المحببة ، ومع ذلك ، بالنسبة للمخزونات الأضعف ، قد يتعثر الذباب ويموت.

2. تشريح المبيض وتثبيته

ملاحظة: للحصول على موارد إضافية حول تشريح المبيض وتلطيخ المبيض ، يتم توجيه القراء إلى البروتوكولات المذكورة53،54،55.

  1. في يوم التشريح ، قم بإعداد محلول تثبيت جديد بتركيز نهائي قدره 4٪ من بارافورمالديهايد (PFA) عن طريق تخفيف محلول مخزون PFA في محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS).
  2. تخدير الذباب باستخدام CO2 ووضعها على وسادة ذبابة. حافظ على تخدير الذباب حتى تشريحه. فكر في تخدير الذباب بشكل صحيح بمجرد توقف حركاته ، والتي تستغرق عادة من 10 إلى 20 ثانية.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يوصى باستخدام CO2 كخيار أكثر أمانا وأسرع ، إلا أنه يمكن تخدير الذباب باستخدام الثلج.
  3. ضع شريحة زجاجية مقعرة أو طبق تلطيخ بآبار اكتئاب ضحلة تحت مجهر تشريح واملأ الآبار ب 1x PBS.
  4. أمسك بذبابة أنثى في الصدر السفلي باستخدام زوج من الملقط. تأكد من جنس الذباب من خلال عدم وجود الأعضاء التناسلية الذكرية في الطرف الخلفي من البطن وعدم وجود أمشاط جنسية على أرجلها الأمامية كخاصية ثانوية52. تشريح الذباب بشكل فردي باستخدام زوج آخر من الملقط (الخطوة 2.5) أثناء غمرها في آبار مليئة ب 1x PBS تحت المجهر تشريح (يوصى بالتكبير 20x).
  5. أثناء النظر من خلال المجهر التشريحي ، استخدم زوجا آخر من الملقط لسحب الجزء الخلفي من بطن الذبابة ، مما يجعل الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال ، المبيضين ، الأمعاء) مرئية.
  6. اضغط بلطف على الجزء الأمامي من البطن الذبابة (كما هو الحال مع أنبوب معجون الأسنان) لإجبار المبيضين على الخروج من البطن. يجب أن تحافظ هذه الطريقة على المبيضين سليمين. فصل وإزالة الأعضاء الأخرى بعناية ويطير الحطام.
  7. باستخدام ملقط أو إبر تشريح ، افصل مبيض المبيض مع الحفاظ على بنية المبيض الكلية سليمة. الغرض من هذه الخطوة هو كسر غمد العضلات الذي يغطي المبيضين والسماح بتلطيخ أكثر كفاءة وتجانسا.
  8. انقل المبيضين بسرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1x PBS واحتفظ بالأنبوب على الجليد حتى يتم تشريح جميع الذباب. لا تبقي الأنبوب على الجليد إذا كان سيتم تصور الأنابيب الدقيقة أو الخيوط الدقيقة (أو الحويصلات التي يتم الاتجار بها بواسطة هذه المكونات الخلوية الهيكلية) لأن هذا يمكن أن يسبب إزالة البلمرة.
  9. بمجرد تشريح جميع المبايض ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق ، اسمح لها بالغرق في قاع الأنبوب وإزالة جميع PBS باستثناء ~ 50 ميكرولتر. أضف 1 مل من 4٪ PFA وضعها على منصة الروك المغذية لمدة 15 دقيقة. الأهم من ذلك ، تحقق مما إذا كان المبيضان يتحركان ذهابا وإيابا في حل التثبيت للسماح بالتثبيت المناسب لأن التثبيت غير المكتمل يمكن أن يؤدي إلى مشاكل في التلطيخ والتصوير.
    ملاحظة: سرعة الجوزة ليست حاسمة. في حين أن بعض المغذيات لديها تحكم في السرعة ، فإن البعض الآخر يأتي بسرعة محددة مسبقا. السرعة المحددة مسبقا كافية ، وإذا كانت قابلة للتعديل ، فاضبطها على 40-50 دورة في الدقيقة.
  10. قم بإزالة محلول التثبيت (كما في الخطوة 2.9) ، ثم قم بإجراء غسلتين سريعتين باستخدام 1 مل من 1x PBS يحتوي على 0.1٪ Triton-X 100 (1x PBST) ، عن طريق عكس أنابيب microfuge بلطف 5-6 مرات. ثم ، تابع أربع غسلات لمدة 10-15 دقيقة (غسل طويل) مع 1 مل من 1x PBST (إجمالي 40-60 دقيقة).
    ملاحظة: يوصى باستخدام 1x PBS + 0.1٪ Triton-X 100 للغسيل لأن زيادة النسبة المئوية للمنظفات يمكن أن تؤدي إلى تمسخ GFP ، مما يؤدي إلى انخفاض التألق والكشف عن بروتينات BM الموسومة ب GFP.
  11. لتلطيخ الصبغة ، على سبيل المثال ، تلطيخ الحمض النووي و F-actin ، انتقل إلى الخطوة 3. للتلطيخ المناعي ، انتقل إلى الخطوة 4. يمكن تخزين المبيضين في 1x PBST عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل المتابعة.

3. معيار الحمض النووي / F-الأكتين تلطيخ

  1. بعد التثبيت والغسيل ، قم بإزالة PBST. أضف 500 ميكرولتر من الحمض النووي ومحلول تلطيخ F-Actin. لإعداد محلول الحمض النووي / F-Actin ، امزج Hoechst (بقعة الحمض النووي ؛ 1:1000 تخفيف محلول مخزون 1 mg / mL) و phalloidin الموسوم بالفلوروفور (بقعة F-actin ؛ تخفيف 1:500 ل Alexa Fluor 546 أو 1:100 تخفيف ل Alexa Fluor 647 ، كل من محلول مخزون 66 ميكرومتر) في 500 ميكرولتر من PBST.
  2. قم بتغطية الأنابيب بورق الألومنيوم للحفاظ على المبيضين والأصباغ في الظلام للحفاظ على التألق للتصوير الفعال واحتضان على هزاز منصة الجوز لمدة 15 دقيقة.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول DNA / F-Actin (كما هو الحال في الخطوة 2.9). قم بإجراء غسلتين سريعتين وثلاث غسلات طويلة (10-15 دقيقة) في 1x PBST كما هو موضح في الخطوة 2.10. انتقل إلى التركيب كما هو موضح في الخطوة 5.

4. تلطيخ مناعي التألق

ملاحظة: هذا بروتوكول تلطيخ مناعي قياسي للتصوير الفلوري ومتوافق مع معظم الأجسام المضادة الأولية.

  1. حجب وتلطيخ مناعي أولي للأجسام المضادة (اليوم 1)
    1. بعد التثبيت والغسيل، قم بإزالة PBST كما هو موضح في الخطوة 2.9. أضف 1 مل من محلول الحجب (PBS + 5٪ BSA) وقم بحظر المبيضين على هزاز منصة الجوز لمدة 1 ساعة كحد أدنى.
      ملاحظة: بالإضافة إلى BSA ، يمكن إضافة مصل البقر الجنيني (FBS) أو مصل الماعز العادي (NGS) إلى محلول الحظر. بدلا من ذلك ، يمكن حظر المبيضين بين عشية وضحاها على منصة الروك المغذية عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة محلول الحجب كما في الخطوة 2.9 وأضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على أجسام مضادة أولية مخففة بتركيزاتها المناسبة (خاصة بالجسم المضاد المستخدم) في محلول الحظر. احتضن بين عشية وضحاها على منصة الروك المغذية عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي وانتقل إلى تلطيخ مناعي الأجسام المضادة الثانوي.
      ملاحظة: يمكن حفظ بعض الأجسام المضادة الأولية وإعادة استخدامها. في بعض الحالات ، يمكن للأجسام المضادة الأولية المعاد استخدامها أن تقلل من تلطيخ الخلفية ، مما يؤدي إلى تصوير أفضل. ومع ذلك ، يجب اختبار إعادة الاستخدام لكل جسم مضاد لضمان الكفاءة.
  2. تلطيخ مناعي ثانوي للأجسام المضادة (اليوم 2)
    1. بعد إزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي ، قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة (10-15 دقيقة) كما في الخطوة 2.10. إن عمليات الغسيل المتكررة التي تتم بعناية باستخدام 1x PBST الطازج ستقلل من الخلفية غير المحددة وتؤدي إلى التصوير الأمثل.
    2. قم بإزالة PBST كما في الخطوة 2.9 وأضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على أجسام مضادة ثانوية فلورسنت تكشف عن الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. قم بحماية الأنبوب من الضوء عن طريق تغطيته بورق الألومنيوم من هذه النقطة فصاعدا للحفاظ الأمثل على التألق ، وهو أمر بالغ الأهمية للحصول على الصور وتحليلها.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي محلول الأجسام المضادة الثانوي على أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالفلوروفورات التي لا تتداخل مع البروتينات الموسومة داخليا. على سبيل المثال ، في حالة استخدام البروتينات الموسومة ب GFP ، يوصى باستخدام الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor بأطوال موجية حمراء أو حمراء بعيدة (على سبيل المثال ، 546 أو 568 أو 647 نانومتر). يمكن إضافة أصباغ الفلورسنت ، مثل Hoechst و Alexa Fluor 546 أو 647 phalloidin المترافق ، إلى المحلول الثانوي. يمكن أن تكون هذه البقع مفيدة لتحديد بنية الخلية الكلية (أي النوى و F-Actin). ارجع إلى الخطوة 3.1 لمعرفة التركيزات.
    3. احتضان المبيضين في محلول الأجسام المضادة الثانوي على منصة الجوز الروك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة (10-15 دقيقة) في 1x PBST كما في الخطوة 2.10. انتقل إلى التركيب كما في الخطوة 5.

5. تركيب المبيضين الملطخين

ملاحظة: تعمل هذه الطريقة بشكل جيد للغاية إذا كان المبيضان متطورين ووفيرين. يعد التركيب الدقيق للمبايض على الشريحة أمرا بالغ الأهمية للتصوير الأمثل.

  1. بعد الغسيل الأخير ، استخدم ماصة p1000 لسحب المبيضين بلطف لأعلى ولأسفل في الأنبوب لفصل غرف البيض. اسمح لغرف البيض بالغرق في القاع عن طريق الحفاظ على الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 5-10 دقائق. يعد الفصل الدقيق لغرف البيض الفردية أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الحصول على الصورة المثلى.
  2. قم بإزالة PBST باستخدام ماصة باستور ، تاركا ~ 50 ميكرولتر. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBST المتبقي باستخدام ماصة p200. أضف قطرتين من وسط التركيب ، وهو ما يكفي للانتشار بالتساوي على غطاء 22 مم × 22 مم. يمكن تخزين المبايض في وسط تركيب في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر قبل التركيب.
    ملاحظة: تتوفر العديد من وسائط التركيب المختلفة تجاريا؛ يوصى باستخدام حوامل صلبة ، مثل Aqua-Poly / Mount أو ProLong Glass Antifade Mountant ، لتحقيق ظروف التصوير المثلى. يتم تثبيط استخدام الجلسرين كوسيلة للتركيب لأنه يمكن أن يؤدي إلى ظروف تصوير سيئة (على سبيل المثال ، عدم استقرار الفلوروفور). بالنسبة لوسائط التركيب التي لا تتبلمر ، قم بإغلاق الغطاء باستخدام مانع تسرب / طلاء أظافر لتثبيته في مكانه.
  3. قم بتسمية شريحة زجاجية وامسحها بورق ناعم خال من الغبار لإزالة الغبار وبصمات الأصابع. اقطع نهاية طرف ماصة p200 للسماح بسهولة نقل وسط التركيب اللزج إلى الشريحة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، انقل ببطء جميع غرف البيض في وسط التركيب إلى الشريحة الزجاجية ، مما يضمن عدم إنشاء فقاعات.
  4. تحت مجهر تشريح ، انشر بلطف وسط التركيب وغرف البيض المنفصلة باستخدام طرف أو ملقط p200 جديد لتغطية منطقة بحجم الغطاء تقريبا.
  5. باستخدام الملقط ، ضع الغطاء بعناية (تنظيفه بورق خال من الغبار) على غرف البيض بزاوية لتجنب الفقاعات.
  6. تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو في الظلام لمدة 2 أيام للبلمرة. بمجرد معالجة وسائط التركيب ، يمكن تخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية في الظلام لبضعة أسابيع للتصوير.
    ملاحظة: من المهم أن تتبلمر وسائط التركيب ذات الإعداد الثابت قبل التصوير. إذا لم يكن الوسط قد بلمر بعد ، فسوف يطفو المبيضان تحت الغطاء ، مما يؤثر على اكتساب الصورة. علاوة على ذلك ، لا يتم تحقيق المؤشر العاكس الأمثل لوسائط التركيب إلا بعد ضبطه بالكامل (راجع معلومات الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل).
  7. طريقة التركيب البديلة: يوصى بهذه الطريقة لتقليل فقدان الأنسجة إذا لم تكن المبايض وفيرة. في هذه الطريقة (الموضحة أدناه) ، افصل المبيضات وغرف البيض على الشريحة أثناء التركيب ، بدلا من فصلها في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق عن طريق السحب كما هو موضح في الخطوة 5.1.
    1. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة كل محلول الغسيل باستثناء ~ 100 ميكرولتر. باستخدام ماصة باستور أو ماصة p1000 ، انقل المبيضين السليمين في PBS إلى الشريحة. باستخدام ماصة p200 ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBST بعناية من الشريحة. استخدم ورقا خاليا من الغبار لمسح PBST، إذا لزم الأمر. لا تلمس المبيضين.
    2. أضف قطرتين من وسائط التركيب. افصل المبيضات وغرف البيض بعناية باستخدام ملقط أو إبر تشريح. قم بإزالة الأنسجة الدخيلة والتخلص منها ، ثم انشر غرف البيض والمبيضات في وسط التركيب. انتقل إلى الخطوات 5.5-5.6.

6. الحصول على صورة متحدة البؤرة

ملاحظة: يوفر هذا القسم معلمات رئيسية لتحقيق الحصول الأمثل على الصور باستخدام أي مجهر متحد البؤرة (الشكل 2).

  1. قم بإعداد المجهر وتحديد موقع العينة كما هو موضح أدناه.
    1. قبل التصوير ، من الأهمية بمكان تحديد موقع المنطقة ذات الأهمية (ROI) باستخدام عدسة المجهر الفلوري. استخدم هدف تكبير منخفض (20x) أو الهدف المراد استخدامه للحصول على الصورة (أي 40x أو 63x). حدد غرفة البيض لتصويرها.
      ملاحظة: للحصول على الصور، يوصى باستخدام أهداف تكبير عالية مثل 40x أو 63x (انظر 6.2.1).
    2. بمجرد تحديد عائد الاستثمار ، انتقل إلى الحصول على الصور ؛ انتقل إلى الخطوة 6.2 للتصوير البؤري ، والخطوة 7 للتصوير فائق الدقة.
  2. حدد المعلمات الرئيسية للحصول على الصورة المثلى كما هو موضح أدناه (ترد أمثلة على المعلمات الرئيسية للصور التمثيلية في الجدول 1).
    1. اختيار هدف: للحصول على صورة متحدة البؤرة للاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM في FE ، استخدم هدفا 40x أو 63x.
      ملاحظة: لتحقيق أفضل دقة ممكنة، يوصى بشدة باستخدام أهداف Plan-Apochromat ذات الفتحة العددية العالية (NA) التي توفر أعلى تصحيح لوني.
    2. اختيار الليزر لكل قناة / مسار: بالنسبة ل GFP ، استخدم الليزر 488 نانومتر ؛ ل DAPI أو Hoechst ، استخدم الليزر 405 نانومتر ؛ ل Alexa Fluor 546 أو 568 ، استخدم الليزر 561 نانومتر ؛ وبالنسبة ل Alexa Fluor 647 ، استخدم الليزر 640 نانومتر.
      ملاحظة: سيؤدي كل اختيار ليزر إلى تكوين قناة/مسار مختلف. هنا ، يشير مصطلح القناة إلى الصورة التي تم تشكيلها من خلال توزيع الكثافة المسجل للفلوروفورات المثارة لعائد الاستثمار المحدد عند الطول الموجي المحدد لكل قناة.
    3. إعداد الثقب: لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري أثناء الحصول على الصورة، اضبط الثقب لكل قناة على 1 وحدة فلكية.
    4. إعدادات كثافة الليزر واكتساب الكاشف: لضبط حساسية الصورة، استخدم كلا من الكسب الرئيسي للكاشف وطاقة الليزر. لضبط حساسية الصورة بشكل صحيح، يوصى باستخدام مؤشر نطاق. اضبط كل من الكسب الرئيسي وقوة الليزر للحصول على حساسية مناسبة حيث تكون الهياكل ذات الأهمية (على سبيل المثال ، الحويصلات المحتوية على BM) مرئية بوضوح مع تجنب تشبع الكاشف.
      ملاحظة: لتجنب التبييض الضوئي، استخدم الحد الأدنى من طاقة الليزر اللازمة. يوصى بزيادة كسب الكاشف أولا أثناء استخدام أقل طاقة ليزر ممكنة. إذا لم تتمكن زيادة كسب الكاشف من تحقيق الكثافة المطلوبة ، فقم بزيادة قوة الليزر. يوصى باستخدام كثافة طاقة الليزر بين 0.5٪ -1.2٪.
    5. حجم الإطار: يوصى باستخدام حجم الصورة الأمثل الذي يحدده برنامج الاقتناء. بالنسبة لمعظم التطبيقات، استخدم دقة قصوى تبلغ 1024 × 1024. الدقة العالية ستزيد بشكل كبير من وقت الاستحواذ.
    6. سرعة المسح الضوئي: استخدم سرعة مسح ضوئي تتراوح بين 6-9 ، وهي آمنة لمعظم العينات. إذا كانت العينة صاخبة، فاستخدم سرعة مسح أبطأ لتحسين نسب الإشارة إلى الضوضاء. ومع ذلك ، فإن سرعات المسح الضوئي المنخفضة تزيد من وقت التبييض الضوئي والاستحواذ.
    7. متوسط الكثافة: لتحسين جودة الصورة، استخدم متوسط الكثافة عبر عمليات المسح الضوئي المتتالية بإعدادات متطابقة. في معظم الحالات، استخدم متوسطين لتحسين نسب الإشارة إلى الضوضاء دون تبييض العينة.
    8. التكبير/التصغير: اضبط منطقة المسح الضوئي باستخدام وظيفة التكبير/التصغير. استخدم التكبير/التصغير بين 2x-4x مع أهداف 40x و 63x كقيمة أكثر فعالية لتصور الحويصلات المحتوية على BM بوضوح في FE. حدد بعناية الحد الأدنى من عائد الاستثمار لتقليل وقت الاستحواذ.
  3. للحصول على مكدس z باستخدام برنامج Zeiss Zen ، استخدم معلمات تقسيم Z التالية وقم بتعيينها كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: الحويصلات وغيرها من الهياكل داخل الخلايا التي تحتوي على بروتينات BM هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). سيؤدي الحصول على مكدس z من خلال FE إلى تحسين جودة الصورة ودقتها بشكل كبير. عادة ما يكون النطاق الذي يمتد على سمك / عمق الأنسجة كافيا لتصور التوطين داخل الخلايا بكفاءة. لإعادة بناء 3D الأمثل ، يوصى باستخدام الفاصل الزمني الأمثل الذي يحدده البرنامج. بالنسبة لأهداف 40x و 63x ، تجنب الفواصل الزمنية التي تزيد عن 0.5 ميكرومتر بين كل قسم z للسماح بإعادة الإعمار 3D المثلى.
    1. انقر فوق خانة الاختيار z-Stack في المنطقة الرئيسية ضمن علامة التبويب الاستحواذ . حدد وضع المسح الضوئي لكل مسار لكل شريحة ل z-stack. سيؤدي ذلك إلى تغيير في مسارات القناة لكل شريحة موضع z.
    2. حدد القناة المطلوبة لمراقبة العينة وانقر على Live لبدء فحص مباشر. يوصى باستخدام القناة اللازمة للكشف عن بروتين BM الموسوم ب GFP.
    3. قم بتعيين نطاق ل z-stack كما هو موضح. باستخدام مقبض الضبط الدقيق على المجهر ، ابحث عن موقع z لأحد طرفي العينة ، وانقر فوق Set First. وبالمثل ، ابحث عن موقع z للطرف الآخر من العينة وانقر فوق Set Last.
    4. لكل موقع في مكدس z، انقر فوق كل قناة على حدة مع تحديد مؤشر النطاق، واضبط شدة الليزر والكسب الرئيسي حسب الحاجة، كما هو موضح في الخطوة 6.2.4.
    5. قم بتعيين الفاصل الزمني ل z-stack لتعيين حجم الخطوة كما هو موصى به في الملاحظة أدناه الخطوة 6.3. انقر فوق بدء التجربة لبدء اكتساب z-stack.

7. الحصول على صورة فائقة الدقة

  1. حدد هدفا متوافقا مع Airyscan . لتصور التوطين داخل الخلايا لبروتين BM ، يعد استخدام هدف الزيت 63x هو الأمثل (الشكل 3). اضبط الهدف على 63x وضع قطرة من زيت الغمر برفق على عدستها. ضع الشريحة على الهدف مع غطاء يواجه الهدف لتحديد موقع العينة.
  2. حدد تكوينا يحتوي على الإعدادات المناسبة للفلوروفور للتصوير كما هو موضح أدناه.
    1. انقر فوق الزر "إعداد ذكي " في علامة التبويب " اقتناء" لتكوين تجربة جديدة. حدد Airyscan (دقة فائقة) ؛ عند تحديد ذلك، ستكون هناك حاجة إلى اختيار آخر بين الدقة (Airyscan SR) و SNR/الحساسية (Airyscan Confocal) والسرعة (Multiplex SR-2Y). بالنسبة للأنسجة الثابتة، حدد الدقة لأن ذلك سيؤدي إلى أفضل اكتساب.
    2. انقر على + في المربع تكوين تجربتك لإضافة مسارات/قنوات. حدد المسارات الخاصة بأصباغ معينة من قاعدة بيانات الصبغة. بالنسبة إلى تجربة متعددة القنوات، أضف كل مسار حسب الحاجة عن طريق تحديد الأصباغ المناسبة.
    3. بعد إضافة جميع المسارات ، حدد أحد مقترحات التجربة التي يوفرها البرنامج. في هذه التجربة ، استخدم Best Signal ، على الرغم من أن السرعة ستكون أبطأ قليلا مقارنة باقتراح أذكى (خط) ، إلا أنها ستنشئ أفضل إعدادات الأجهزة لكل صبغة ، مما يؤدي إلى أقصى قدر من كسب الإشارة والحد الأدنى من المحادثة المتقاطعة للانبعاثات. بمجرد تعيين التجربة وتحميلها، ستظهر في نافذة إعداد التصوير في علامة التبويب الاستحواذ.
    4. بمجرد تحديد إعداد ذكي ، سيتم تحديد نطاق الأطوال الموجية للكاشف GaAsP-PMT تلقائيا. اضبط النطاق عن طريق تحريك شريط التمرير في الأسفل لزيادة النطاق أو تقليله أو نقل النطاق بالكامل إلى منطقة أخرى كما هو مطلوب. استخدم هذا للتأكد من عدم تداخل نطاقات قناتين مختلفتين لتجنب الأحاديث المتقاطعة. احفظ التكوين لإعادة استخدامه في المستقبل.
  3. بمجرد تعيين التكوين، تابع لضبط منطقة التكبير/التصغير والمسح الضوئي كما في الخطوة 6.2.8. قم بتحسين منطقة المسح الضوئي للتركيز على المنطقة ذات الأهمية لتقليل وقت المسح الضوئي ومساحة التخزين. انتقل إلى الحصول على الصور.
  4. لكل قناة على حدة، حدد مسارا ضمن القناة وانقر على بث مباشر. اضبط الكسب الرئيسي وطاقة الليزر باستخدام أداة مؤشر النطاق كما هو موضح في الخطوة 6.2.4 واتبع جميع الإرشادات الموضحة لتجنب وحدات البكسل المشبعة. تأكد من أن عرض الكاشف السداسي متمركز ومحاذاة بالنقر فوق الزر عرض كاشف Airyscan . في معظم الحالات، يتم توسيط طريقة عرض الكاشف السداسي ومحاذاتها تلقائيا. كرر ذلك للقنوات الإضافية.
  5. في نافذة تبديل وضع الاستحواذ، ضمن حجم الصورة، انقر فوق SR (عدد وحدات البكسل المحدودة الدقة الفائقة) لزيادة قدرات الكاشف إلى أقصى حد. سيؤدي ذلك إلى ضبط حجم الإطار تلقائيا.
  6. احتفظ بالمتوسط إلى لا شيء لأنه عادة ما يكون غير ضروري ، وهذا سيقلل من وقت الفحص. في بعض الحالات ، قد يؤدي متوسط 2x إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  7. جمع البيانات الخام مع أعماق البيانات 8 بت. انقر على Snap للحصول على صورة. للحصول على مكدس z، اتبع الخطوة 6.3.
  8. قم بإجراء معالجة الصور كما هو موضح أدناه. سيؤدي ذلك إلى إنتاج صورة 16 بت.
    1. بمجرد الحصول على الصورة أو z-stack ، انقر فوق طريقة المعالجة > وحدد معالجة Airyscan .
    2. قم بإجراء تصفية تلقائية للبدء بها وإجراء مزيد من المعالجة اليدوية عن طريق تغيير قيمة SR للحصول على أفضل النتائج للعينة. بمجرد تحديد قيمة ريال سعودي المثلى، انقر فوق تطبيق لإنشاء صورة تمت معالجتها. في حالة صور z-stack ، قم بالمعالجة إما كشريحة z واحدة (الصورة الحالية [2D]) أو كمكدس z بالكامل بالنقر فوق مربع المعالجة ثلاثية الأبعاد .

8. معالجة الصور وتحليل البيانات (الإسقاط المتعامد ، إعادة بناء 3D وملف تعريف الكثافة)

ملاحظة: بالنسبة لهذه الطريقة، يتم وصف الخطوات المستخدمة لإنشاء إسقاطات متعامدة وإعادة بناء 3D وملفات تعريف الكثافة لبرنامج Zen (راجع جدول المواد). يمكن أيضا إجراء تحليلات بيانات مماثلة باستخدام برنامج ImageJ56.

  1. قم بإجراء إسقاط متعامد كما هو موضح أدناه (الشكل 4).
    1. بمجرد الحصول على مكدس z باستخدام المجهر البؤري أو فائق الدقة ، قم بإنشاء إسقاط متعامد لعرض الحويصلات في المحور z للخلية في عرض 2D (مقارنة بإعادة البناء 3D). للقيام بذلك ، انقر فوق طريقة > المعالجة وحدد الإسقاط المتعامد.
    2. ضمن المعلمات، حدد مستوى العرض المطلوب. للحصول على إسقاط للمحور z (z-stack)، حدد المستوى الأمامي (XY ). ضمن الطريقة، حدد الحد الأقصى للحصول على أعلى جودة للإسقاط.
    3. بعد ذلك ، حدد سمك الإسقاط عن طريق تحديد موضع البدء (بدء شريحة z) ، وتحديد السماكة (إجمالي عدد شرائح z) في الإسقاط. من المثالي تحديد سمك يساوي سمك خلية واحدة في المحور z.
    4. بمجرد تعيين المعلمات ، انقر فوق تطبيق لإنشاء إسقاط z-stack بطريقة مستوى XY.
      ملاحظة: عند إنشاء إسقاطات متعامدة لمكدسات z متعددة لمقارنة مقدار كائن معين ذي أهمية، من الضروري الحفاظ على سمك الإسقاط كما هو (أو أقرب ما يمكن) لدقة البيانات.
  2. قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح أدناه (الشكل 5).
    1. إنشاء إعادة بناء 3D من z-stacks لمراقبة توطين وشكل الهياكل. قم بذلك بالنسبة إلى مكدسات z التي تم الحصول عليها باستخدام أساليب متحدة البؤرة وفائقة الدقة. معالجة مكدسات z فائقة الدقة أولا باستخدام المعالجة ثلاثية الأبعاد كما هو الحال في الخطوة 7.8 لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد.
    2. لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد ، انقر فوق رمز 3D في نافذة المعاينة. بمجرد النقر ، ستظهر علامة تبويب 3D في قسم التحكم في العرض في النصف السفلي من الشاشة. ستكون طرق العرض 3D ، مثل الشفافية والحجم والحد الأقصى والسطح والمختلط مرئية. استخدم طرق العرض Surface أو Mixed عند عرض بنية الحويصلات (مفضل).
    3. للحصول على صورة عالية الجودة ، حدد الإعداد الدقيق ، لأن الإعداد الأسرع سيكون أقل دقة ويؤدي إلى عرض 3D ضعيف.
    4. بمجرد إنشاء الصورة، قم بمعالجتها عن طريق التدوير والتكبير/التصغير للتركيز على الموقع المفضل لعرض الكائنات المثيرة للاهتمام. معالجة صورة 3D ضمن علامة التبويب المظهر .
    5. بمجرد الحصول على عرض مرض ، ضمن علامة التبويب 3D ، حدد الدقة المعروضة ، ثم انقر فوق إنشاء صورة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء لقطة للصورة في نفس الاتجاه الذي تم عرضه ويمكن حفظه وتصديره بتنسيقات ملفات مختلفة.
  3. قم بإنشاء ملف تعريف كثافة كما هو موضح أدناه (الشكل 7).
    ملاحظة: يمكن عرض ملفات تعريف التوزيع والكثافة للبيكسلات المرتبطة بإشارات الفلورسنت المختلفة كصورة تراكب لتحديد توطينها المشترك.
    1. بمجرد الحصول على صورة مثالية عبر التصوير متحد البؤرة أو فائق الدقة ، في لوحة العرض في نافذة المعاينة ، انقر فوق ملف التعريف. في نافذة المعاينة، سيظهر رسم بياني يعرض ملف تعريف الكثافة كدالة للمسافة، بالإضافة إلى جدول يعرض المسافات وقيم الكثافة.
    2. في منطقة عناصر التحكم في العرض في أسفل الشاشة ، انقر فوق أداة السهم في علامة التبويب تعريف ملف التعريف . ارسم سهما على طول الكائن الذي يحتاج إلى تقييم ملف تعريف كثافة وحدات البكسل المختلفة. لرسم السهم، قم بتكبير الصورة.
    3. سيظهر ملف تعريف الكثافة على يسار معاينة الصورة ، حيث سيتم عرض المسافة والقمم المقابلة على طول مسار السهم. لإزالة الرسم البياني المعروض على الصورة نفسها، قم بإلغاء تحديد المربع إظهار ملف التعريف في الرسومات .
    4. في علامة التبويب الأبعاد في منطقة التحكم في العرض، قم بإلغاء تحديد أي قنوات لا يجب تضمينها في ملف تعريف الكثافة.
    5. في علامة التبويب الرسومات، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف التعريف الموضح ضمن المربع التعليقات التوضيحية/القياسات لفتح المربع المنبثق تنسيق العناصر الرسومية. استخدم هذا لتغيير لون السهم بالإضافة إلى نمطه وسماكة الحد. أغلق المربع بعد تحديد الإعدادات المطلوبة.
    6. انقر فوق علامة التبويب عرض الملف الشخصي . في قسم الصورة الجديدة ، انقر فوق طريقة العرض الحالية ثم فوق حفظ باسم لحفظ الملف. يوصى بحفظ الملف كملف .tif لتجنب ضغط البيانات وفقدانها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام الطرق الموضحة هنا لتصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM داخل الخلايا في الخلايا الظهارية المستقطبة ، مثل FE من مبيض ذبابة الفاكهة . بعد ذلك ، نقدم النتائج المتوقعة التي تم الحصول عليها باستخدام الطرق الموصوفة ، بالإضافة إلى المشورة المفيدة والمزالق المحتملة. للقيام بذلك ، يتم استخدام Vkg-GFP ، وهو Vkg موسوم داخليا (ذبابة الفاكهة Col IV). ومع ذلك ، يمكن تحقيق نفس النتائج مع بروتينات BM الأخرى الموسومة داخليا مثل Pcan-GFP.

وضع معلمات الاستحو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

BM أمر بالغ الأهمية للتكوين الجنيني والأعضاء ، والوظائف الفسيولوجية للبالغين. علاوة على ذلك ، يعمل BM كمنصة إشارات لإنشاء وصيانة القطبية الظهارية ويوفر الأنسجة مع الدعم2. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تنظم الموضع السليم لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. يتطلب الفهم الأفضل للمسارات البيولوجية المخصصة للاتجار داخل الخلايا والإفراز المستقطب لبروتينات BM تحليلا دقيقا لمكونات هذه المسارات وأدوارها في معالجة BM. إحدى الطرق لتحقيق ذلك هي استخدام التصوير البؤري وفائق الدقة. هنا ، وصفنا طرقا لإعداد وتلطيخ أو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المؤلفون ممتنون لجولي ميركل على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM137236 إلى O.D. تم الحصول على الصور البؤرية وفائقة الدقة باستخدام Zeiss LSM 900 مع Airyscan 2 ، والتي تم شراؤها باستخدام منحة التصوير بالرنين المغناطيسي NSF 2018748.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 546 phalloidinInvitrogenA22283F-Actin Stain (1/500 من 66 & micro; م)
أليكسا فلور 647 فالويدإنفيتروجينA22287F-أكتين صبغة (1/100 من 66 & micro; م))
المضادة للجسم المضاد GM130abcamab30637لصبغة جولجي (colocalization) ؛ استخدم كتركيز 7 & micro ؛ g / uL
Aqua-PolymountPolysciences، Inc.1860620تصاعد خميرة
الخبازين المتوسطة (الخميرة الجافة النشطة)Genesee Scientific62-103لتسمين الزائدات لتشريح
ألبومين مصل الأبقار (محلول 30٪)Sigma-AldrichA7284لمنع المحلول
آبار الاكتئابعلوم المجهر الإلكتروني7156101للتشريح (يمكن استخدام شريحة التقعر الزجاجي بدلا من ذلك)
إبرة تشريحFisher scientifc13-820-024
ذبابة الفاكهة حاضنةجينيسي العلمية / Invictus
ذبابة الذبابة مخزون: Perlecan-GFP ذبابة الفاكهة < / em>line (ZCL1700) مورينوآخرون ، 2001
ذباب<ة الفاكهة / em<>> ذبابة الفاكهة خط (خط TRIP HMS00241)ذبابة الفاكهة33594RNAi ضد Crag
مخزون الذبابة: Viking-GFP ذبابة الفاكهة خط (CC00791)Buszczak et al. ، 2007
Fly Stock: Vkg-GFP ، tj-Gal4Devergne et al. ، 2017. قم بقيادة التعبير عن Crag RNAi في ملقط FE
(Dumont 5)أدوات العلومالدقيقة 11251-30لتشريح
الزجاج المقعر شرائحعلوم المجهر الإلكتروني7187804للتشريح (يمكن استخدام آبار الاكتئاب بدلا من ذلك)
الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568InvitrogenA11036الجسم المضاد الثانوي (الجسم المضاد GM130) (5 & micro; جم / مل)
Hoechst (Hoechst 33342)InvitrogenH3570DNA Stain (1 ug / mL)
KimwipesKimtechFisher Scientific: 06-666مهمة حساسة
Leica Fluorescent Stereoscope   ؛ M165 FCLeicaلتصوير المبيض
المجهر الشرائحCorning294875X25مجهر الشرائح
منصة الروكCorning LifeSciences 6720لتثبيت المبيض وتلطيخه
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121Fly Food
Paraformaldehyde 20٪ محلولالمجهر الإلكترونيفيشر علمي: 15713ل PFA 4٪
ملحية مخزنة بالفوسفاتفيشر BP2944100 العلميةلحل PBS
ProLong Glass Antifade MountantInvitrogenP36980تصاعد غطاء
مربع متوسط زجاجCorning285022زجاجي لشرائح المجهر
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5ل PBST
Zeiss LSM 900 مع Airyscan 2Zeissمجهر متحد البؤر وفائق الدقة
Zeiss Stemi 305 مجهر ستيريوZeissمجهر
Zeiss Zen الإصدار 3.3 (الإصدار الأزرق)Zeissالحصول على الصور ومعالجتها
مركز مساحات علوم أقراص غطاء تشريح

المراجع

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660(2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77(2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59(2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050(2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377(2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648(2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754(2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52(2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629(2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة