يتيح الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM) التصوير فائق الدقة ووضع العلامات عالي الكفاءة

تم استخدام المجهر التوسعي (ExM) من قبل الباحثين منذ تقديمه لأول مرة كنهج مناسب لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام المجاهر التقليدية ، مثل المجاهر فوق الفلورية والمجاهر البؤرية¹،²،³،⁴،^5،6،7 . باستخدام ExM ، من الممكن تحقيق دقة جانبية ~ 70 نانومتر حتى مع المجاهر البؤرية العادية. عندما يتم دمج ExM مع التصوير فائق الدقة ، يتم تحسين الدقة بشكل أكبر. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تحقيق دقة 30 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر الإضاءة المنظم (SIM) ، ودقة 4 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر إعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM) ^1,5.

ومع ذلك ، فإن كفاءة وضع العلامات المنخفضة هي مشكلة حرجة في طرق ExM القياسية. يمكن أن يختلف فقدان التألق بناء على نوع مجموعات الفلورسنت ووقت الهضم. ومع ذلك ، في المتوسط ، تم الإبلاغ عن فقدان أكثر من 50٪ من الفلوروفورات بعد البلمرة وخطوات هضم البروتين في ExM ، مما يضر بجودة التصوير ^3,4.

وهكذا، تم تطوير الفحص المجهري لتوسيع نطاق الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM)، والذي يمكنه الاحتفاظ بالملصقات بكفاءة وتقليل فقدان الإشارة¹. الابتكار الرئيسي ل LR-ExM هو استخدام مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف بدلا من مجرد استخدام أصباغ الفلورسنت - كما هو الحال في إجراء ExM القياسي - لتلطيخ البروتينات ذات الأهمية. تتكون هذه الروابط ثلاثية الوظائف من ثلاثة أجزاء: (1) الموصل (على سبيل المثال ، N-hydroxysuccinimide (NHS)) للاتصال بالجسم المضاد ، (2) المرساة (على سبيل المثال ، ميثاكريلاميد (MA)) لتثبيت البروتينات على البوليمر ، و (3) المراسل (على سبيل المثال ، البيوتين أو الديجوكسيجينين (DIG)) للاقتران بصبغة عضوية. تنجو المراسي ثلاثية الوظائف من خطوات البلمرة وهضم البروتين ، وبالتالي تمنع فقدان الفلوروفور.

علاوة على ذلك ، تحمل هذه الطريقة إمكانات كبيرة لأنها متوافقة مع العلامات الأنزيمية ذاتية التصنيف مثل SNAP أو CLIP. نهج العلامة الأنزيمية لها بعض الفوائد على نهج تلطيخ المناعة فيما يتعلق بالخصوصية العالية وكفاءة وضع العلامات^8،9،10.

في هذه المخطوطة، يظهر إجراء مفصل ل LR-ExM. LR-ExM هي طريقة فعالة ومرنة للغاية لتحقيق دقة مكانية عالية مع تحسين كفاءة وضع العلامات.

1. زراعة الخلايا

1. استخدم خلايا U2OS المستزرعة في وسط 5A من McCoy مع 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
2. خلايا الاستزراع على 16 غطاء زجاجي قابل للإزالة بشكل جيد (منطقة الاستزراع 0.4 سم²) لسهولة التعامل.

2. التثبيت والنفاذية

ملاحظة: تعتمد ظروف التثبيت والنفاذية على بروتوكولات التلطيخ المناعي المحسنة. فيما يلي بروتوكول التثبيت والتخلل للنبيبات الدقيقة المناعية المشتركة والحفر المطلية بالكلاثرين (CCPs).

1. بمجرد أن يصل عدد الخلايا إلى ~ 0.04 × 10 6 ، قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 100 ميكرولتر من 3.2٪ paraformaldehyde (PFA) في المخزن المؤقت PEM (أنابيب 100 mM ، 1 mM EGTA ، و 1 mM MgCl₂ ، الرقم الهيدروجيني^6.9) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1).
   ملاحظة: يتم إجراء التثبيت باستخدام PFA في غطاء أمان معتمد.
2. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 200 ميكرولتر من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
3. تخلل الخلايا مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (الجدول 1).
   ملاحظة: تابع وضع العلامات في أقرب وقت ممكن لتجنب البروتين المستهدف أو الحمض النووي الريبي أو تدهور الحمض النووي ، والحصول على النتيجة المثلى. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات الثابتة لفترة طويلة (تصل إلى شهر) في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية. استبدل أي PBS متبخر وقم بحماية العينة من التبييض الضوئي.

3. الستربتافيدين الذاتية المنشأ ومنع البيوتين

1. احتضان الخلايا بمحلول الستربتافيدين المخفف في مخزن مؤقت لحجب الخلايا (100 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1).
2. شطف لفترة وجيزة مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت حجب الخلايا.
3. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول البيوتين المخفف في مخزن مؤقت لمنع الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: عند استخدام نهج وضع العلامات الذاتي التصنيف، مثل استخدام علامات SNAP أو CLIP، تخطي الخطوة 4، وانتقل إلى الخطوة 5.1: نهج وضع العلامات على التسمية الذاتية.

4. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية

1. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد للفئران المضادة α-توبولين (تخفيف 1:500) والأجسام المضادة المضادة للأرنب المضادة للكلاثرين ذات السلسلة الثقيلة (تخفيف 1:100) في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخلايا لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. مضاعفة وقت الحضانة لعينات الأنسجة.
2. اغسل العينات أربع مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

5. LR-ExM محددة تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية

1. اقترن الأجسام المضادة IgG مع الروابط ثلاثية الوظائف مثل N-hydroxysuccinimide (NHS) - ميثاكريلاميد (MA) - البيوتين أو NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (الشكل 1B). تم إدخال توليف المراسي ثلاثية الوظائف واقتران الأجسام المضادة الثانوية سابقا في Shi et ^al.1. نهج وضع العلامات الذاتي: اقتران الأجسام المضادة IgG مع الروابط ثلاثية الوظائف ، مثل MA- البنزيل الغوانين (BG) - البيوتين أو MA- البنزيلسيتوزين (BC) - الحفر (الشكل 1B). تم إدخال توليف المراسي ثلاثية الوظائف واقتران الأجسام المضادة الثانوية سابقا في Shi et ^al.1.
2. احتضان الخلايا مع الحمار المضاد للأرانب-Dig-MA (تخفيف 1:100) والحمار المضاد للفئران البيوتين-MA (1:100 تخفيف) الأجسام المضادة الثانوية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضاعف وقت الحضانة هذا لعينات الأنسجة.
3. اغسل العينات أربع مرات في 200 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

6. إرساء إضافي

1. احتضان الخلايا مع 0.25٪ glutaraldehyde (GA) في PBS (100 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل تثبيت البروتينات على هيدروجيل. بدلا من ذلك ، استخدم 25 mM حمض الميثاكريليك N-hydroxysuccinimide ester (MA-NHS) للتثبيت. يتم تشجيع الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
2. اغسل العينات ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

7. الهلام

ملاحظة: يتم تحديد سرعة التمدد من خلال وقت انتشار الملح والماء خارج أو في الجل. وبالتالي ، فإن صب المواد الهلامية الرقيقة يسرع وقت التوسع.

1. قم بإزالة الهيكل العلوي للوحة الجل المكونة من 16 بئرا. أضف 40 ميكرولتر من محلول المونومر إلى كل بئر لتكييف الخلايا على الجليد. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
   1. لإعداد حل مونومر، انظر الجدول 2.
2. تحضير محلول التبلور على الجليد. أضف الماء المقطر المزدوج ومسرع 10٪ N ، N ، N ′ ، N ′ رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) إلى محلول المونومر (10٪ TEMED: محلول المونومر = 1:47) ؛ لا تقم بإضافة البادئ بعد (الجدول 3).
3. بالنسبة لغرفة زراعة الخلايا التي تبلغ مساحتها 0.4 سم² ، استخدم حجم محلول هلام يبلغ حوالي 40 ميكرولتر.
4. أضف 10٪ من بيرسلفات الأمونيوم (APS) إلى محلول الهلام ، واحتضن على الجليد ، وقم على الفور بماصة 40 ميكرولتر من محلول الهلام في كل طوقا سيليكون جيدا على الجليد. احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق (10٪ APS: 10٪ TEMED: محلول مونومر = 1: 1: 47).
5. احم العينة من الضوء وانقل الغطاء الزجاجي في طبق بتري 10 سم إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للتبلور. للحفاظ على رطوبة الجل أثناء حضانة 37 درجة مئوية ، قم بتغطية طبق بتري بالغطاء ، ووضع بضع قطرات من الماء في طبق بتري.

8. الهضم

1. بعد التبلور ، قم بإزالة الزجاج لفصل الجل ونقل الجل إلى 6 أطباق جيدة. هضم الخلايا المدمجة مع 2 مل من مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. استخدم ما لا يقل عن 10 أضعاف الحجم الزائد من المخزن المؤقت للهضم.
2. اغسل المواد الهلامية بحجم زائد من الماء لا يقل عن 10 أضعاف حجم الجل النهائي. كرر خطوة الغسيل أربع مرات لمدة 20 إلى 30 دقيقة في كل مرة. يتوسع الجل بحوالي ضعفين في كل بعد.
   ملاحظة: يمكن تخزين عينات الجل لمدة تصل إلى 1 شهر في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية. استبدل أي ماء متبخر لتجنب التجفيف، وقم بحماية العينة من الضوء أثناء التخزين. لتجنب تدهور المراسي ثلاثية الوظائف ، يجب تلطيخ العينات في أقرب وقت ممكن بعد الهضم والغسيل.

9. تلطيخ التألق بعد الهضم

1. احتضان المواد الهلامية في حجم 2 مل من الستربتافيدين (STV) / الديجوكسيجينين (DIG) العازلة تلطيخ مع 2 إلى 5 ميكرومتر STV-صبغة و / أو المضادة ل DIG-dye لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بالعينات في الظلام.

10. التوسع

1. اغسل الجل وقم بتوسيعه أربع مرات بالماء الزائد (2-3 مل) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في كل مرة.
2. لتسهيل تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI خلال ثلث عمليات الغسيل الخمسة. تخفيف تركيز مخزون DAPI (5 ملغ / مل ، مخزنة عند 4 درجات مئوية) في 1: 5000 تخفيف في مياه الغسيل. احتضن الجل بمحلول ماء DAPI (2 مل) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
3. اغسل مرتين إضافيتين ب 3 مل من الماء.
4. قم بتوسيع المواد الهلامية في أي طبق مسطح كبير بما يكفي لاحتواء العينات. المواد الهلامية الموسعة التي يتم إعدادها على 0.4 سم² منطقة coverglass تناسب بشكل جيد في لوحة زجاجية سفلية 6 آبار.
   ملاحظة: يمكن تخزين العينات الملطخة بعد التمدد لمدة تصل إلى 4 أشهر في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية، وأضف كمية كافية من الماء لتجنب التجفيف وحماية العينة من التبييض الضوئي. كرر خطوة التوسيع وتلطيخ DAPI قبل التصوير. لتجنب أي خطر من تدهور الفلوروفور ، يجب تصوير العينات في أقرب وقت ممكن.

11. التصوير

1. قم بتغطية غرفة التصوير ذات القاع الزجاجي المكون من 6 آبار بنسبة 0.01٪ من البولي إل-ليسين (3 مل لكل منهما) لشل حركة عينات الجل.
2. انقل عينات الجل إلى غرفة التصوير المطلية.
3. صور العينات مع أي نطاقات التألق المطلوبة.

الحفر المطلية بالكلاثرين (CCPs) ملطخة بالمناعة باستخدام مراسي ثلاثية الوظائف (الشكل 1B) ويتم تنفيذ LR-ExM كما هو موضح في الشكل 1A. وتبين LR-ExM (الشكل 2C,E) كثافة تألق أعلى بكثير مقارنة بالفحص المجهري لتوسع الاحتفاظ بالبروتين (proExM، الشكل 2A) أو البيوتين-ExM (الشكل 2B)؛ كانت إشارة LR-ExM أعلى بنحو ست مرات من proExM (الشكل 2D). يمكن ل LR-ExM التقاط الهياكل الصغيرة بشكل فعال مثل CCPs ، والتي تكون أصغر من حد الحيود (الشكل 2F ، G).

يتم عرض بعض النتائج التمثيلية ل LR-ExM باستخدام نهج التلطيخ المناعي. يتم تلطيخ الأنابيب الدقيقة و CCPs بشكل مشترك باستخدام مراسي ثلاثية الوظائف ، بما في ذلك NHS-MA-DIG و NHS-MA-biotin (الشكل 3A ، B). يتوفر LR-ExM للنهج القائم على العلامات الأنزيمية. يتم توضيح النتيجة باستخدام المراسي ثلاثية الوظائف BG-MA-biotin (ل SNAP-tag) و BC-MA-DIG (ل CLIP-tag) في الشكل 3C-F. علاوة على ذلك ، يمكن للمرء أن يجمع بين كل من التلطيخ المناعي ونهج علامة البروتين في LR-ExM كما هو موضح في الشكل 3G-J. من هذه النتائج ، تم التأكيد على أن LR-ExM مفيد للحصول على صور عالية الجودة مع تحسين كفاءة ودقة وضع العلامات.

تظهر LR-ExM أداء رائعا في عينات الأنسجة أيضا. يتم تنفيذ LR-ExM على أنسجة دماغ الفأر عن طريق المشاركة في تلطيخ علامة ما قبل المشبكي باسون وعلامة ما بعد المشبكي Homer1. العلامتان واضحتان ومنفصلتان بشكل جيد ، مما يدعم الدقة العالية وكفاءة وضع العلامات (الشكل 4A-E).

الشكل 1: سير عمل الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM). (أ) سير عمل LR-ExM. (ب) مخططات المراسي ثلاثية الوظائف. وقد عدل هذا الرقم من Shi et al.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: القياس الكمي للصور المجهرية للتوسع المبؤري للاحتفاظ بالإشارة (A-C) للحفر المغلفة بالكلاثرين (CCPs) في خلايا U2OS الملطخة بالمناعة بشكل غير مباشر للسلسلة الثقيلة من الكلاثرين (POI). (أ) الاحتفاظ بالبروتين ExM (ProExM) باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة AF488. (ب) ExM مع وضع العلامات بعد التوسع باستخدام الأجسام المضادة المترافقة مع البيوتين. (ج) LR-ExM باستخدام الأجسام المضادة المترافقة مع المراسي ثلاثية الوظائف NHS-MA-biotin. العينات في B و C ملطخة بعد التمدد بالستربتافيدين-AF488. (د) التحديد الكمي لشدة A-C. تمثل أشرطة الخطأ SD. n = 3 لكل حالة. نسب تمدد الطول للصور في A و B و C و E-G هي 4.3 و 4.5 و 4.6 و 4.3 على التوالي. نسبة تمدد الطول للعينات المستخدمة في المخطط D هي 4.5 ± 0.2. أشرطة الميزان ، 500 نانومتر (A-C و E) ، و 100 نانومتر (F و G). جميع أشرطة الميزان في وحدات ما قبل التوسعة. عربي. u. ، الوحدات التعسفية ؛ STV ، ستربتافيدين. يتم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة للقرص الدوار (Nikon CSU-W1) مع هدف غمر مائي 60x (NA1.27). وقد عدل هذا الرقم من Shi et al.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج التمثيلية ل LR-ExM باستخدام المجاهر البؤرية (A,B) صور LR-ExM البؤرية للأنابيب الدقيقة الموسومة بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع NHS-MA-البيوتين (أرجواني) و CCPs الموسومة بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة NHS-MA-DIG-(الأخضر) في خلية U2OS. (ب) عرض مكبر. (C-F) صور LR-ExM متحدة البؤرة ل CCPs و / أو الميتوكوندريا في خلايا HeLa الموسومة باستخدام نهج علامة البروتين (C) SNAP المسمى clathrin ، (D) CLIP المسمى TOMM20 ، و (E) التصوير بلونين. (و) طريقة عرض مكبرة. (ز) صور LR-ExM متحدة البؤرة بلورين باستخدام مزيج من نهج التلطيخ المناعي (NPC، الأحمر الساخن) ونهج علامة البروتين (مكيف الهواء اللامين الموسوم بعلامة SNAP (سماوي)). (ح) طريقة العرض المكبرة. (I,J) وجهات نظر القنوات الفردية ل H. لاحظ أن الخلفية السيتوبلازمية في G ناتجة عن الجسم المضاد NUP153. نسب تمدد الطول للصور في A-B: 4.7 ، C-D: 4.4 ، E-F: 4.5 ، و G-J هي 4.5. أشرطة القياس، 1 ميكرومتر ل A، 200 نانومتر ل B و F، 500 نانومتر ل C-E، 2 ميكرومتر ل G، و 500 نانومتر ل H و I و J. جميع أشرطة الميزان في وحدات ما قبل التوسعة. يتم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة للقرص الدوار (Nikon CSU-W1) مع هدف غمر مائي 60x (NA1.27). وقد عدل هذا الرقم من Shi et al.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية ل LR-ExM على عينات الأنسجة. (أ) صورة متحدة البؤرة LR-ExM لشريحة دماغ الفأر الملطخة بشكل غير مباشر للعلامة قبل المشبكي باسون (أرجواني) وعلامة ما بعد المشبكي Homer1 (أخضر). (ب، ج) صور مكبرة لنقاط الاشتباك العصبي. (دال، هاء) ملامح كثافة عرضية على طول المحاور الطويلة للمربع الأصفر. يتم تصنيف الباسون بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع NHS-MA-DIG-CONJUGATED ، ويتم تصنيف Homer1 بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع NHS-MA-البيوتين. جميع العينات ملطخة بعد التمدد بالستربتافيندين-AF488 و أو المضادة للديجوكسين-AF594. نسب تمدد الطول للصور في A-C هي 4.2. أشرطة المقياس ، 1 ميكرومتر (A) ، و 200 نانومتر (B ، C). جميع أشرطة الميزان في وحدات ما قبل التوسعة. يتم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة للقرص الدوار (Nikon CSU-W1) مع هدف غمر مائي 60x (NA1.27). وقد عدل هذا الرقم من Shi et al.1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المواد الكيميائية والمخازن المؤقتة يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: حل مونومر يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: حل الهلام يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.