يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أثناء تطور الفقاريات ، تهاجر خلايا القمة العصبية (NCCs) على نطاق واسع وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا التي تساهم في هياكل مثل الهيكل العظمي القحفي الوجهي والجهاز العصبي المحيطي. في حين أنه من الأهمية بمكان فهم هجرة NCC في سياق الجنين 3D ، فإن عزل الخلايا المهاجرة في ثقافة 2D يسهل التصور والتوصيف الوظيفي ، مكملا الدراسات الجنينية. يوضح البروتوكول الحالي طريقة لعزل الطيات العصبية القحفية للكتاكيت لتوليد مزارع NCC الأولية. تنبثق NCCs المهاجرة من الطيات العصبية المطلية على ركيزة مغلفة بالفيبرونيكتين. وينتج عن ذلك مجموعات سكانية مشتتة ومترابطة تابعة ل NCC يمكن تقييمها عن طريق التحليق والتحليلات المورفولوجية الكمية. هذا النهج الثقافي المبسط قابل للتكيف بشكل كبير ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى. على سبيل المثال، يمكن تقييم سلوكيات الهجرة والهجرة NCC عن طريق التصوير بالفاصل الزمني أو الاستعلام عنها وظيفيا من خلال تضمين مثبطات أو تلاعبات تجريبية بالتعبير الجيني (على سبيل المثال، الحمض النووي، أو مورفولينو، أو كريسبر إلكتروبوراتيون). بسبب تنوعها ، توفر هذه الطريقة نظاما قويا للتحقيق في تطوير NCC في الجمجمة.
المقدمة
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا عابرة في أجنة الفقاريات. يتم تحديد NCCs عند حدود الصفيحة العصبية وتخضع لانتقال ظهاري إلى وسيط (EMT) للهجرة من الأنبوب العصبي الظهري1. بعد EMT ، تنتشر NCCs على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى التمييز والمساهمة في هياكل مختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي القحفي الوجهي ، ومسار التدفق الخارجي للقلب ، وغالبية الجهاز العصبي المحيطي2. التغيرات في قطبية الخلية ، والهيكل الخلوي ، وخصائص الالتصاق وراء هذا التحول من مجموعة الخلايا المهاجرة إلى الخلايا المهاجرة3. توفر دراسة NCC EMT والهجرة نظرة ثاقبة على الآليات الأساسية لحركية الخلايا وإبلاغ ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يمكن استخدام أي مجموعة متنوعة من سلالات جالوس جالوس ، بما في ذلك White Leghorn أو Golden Sex Link أو Rhode Island Red. كان بيض الدجاج المستخدم في هذه الدراسة من سلالات مختلفة وتم الحصول عليه من مصادر متعددة ، بما في ذلك المزارع المحلية والمفرخات.
1. إعداد الحلول والمواد
- قم بإعداد محلول Ringer عن طريق خلط 123.3 mM NaCl و 1.53 mM CaCl 2 و 4.96 mM KCl و 0.809 mM Na 2 HPO 4 و 0.147 mM KH 2PO4 (انظر جدول المواد). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 وقم بتصفية التعقيم في زجاجات سعة 100 مل. يخزن في مكان نظيف وجاف. لا تغسل الزجاجات بالصابون (تعامل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1 عرض عام لهذا البروتوكول. تم فتح البيض المحتضن ، وتم عزل صفار البيض ، مع الجنين على السطح ، عن طريق سكبه بلطف في راحة يد قفاز (الشكل 2A ، B). بعد إزالة الألبومين (الشكل 2C) ، تم تطبيق إطارات ورق الترشيح على غشاء صفار البيض المحيط بالجنين لتسهيل قطع الجنين ورفعه من صفار البيض ، والذي يبدأ في التسرب بمجرد قطع أغشية صفار البيض (الشكل 2D ، E).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر التقنية الموصوفة هنا طريقة قابلة للتكيف لعزل الطيات العصبية للكتاكيت وطلائها لإنشاء ثقافات من NCCs الجمجمية المهاجرة. توفر هذه الثقافات ظروفا مبسطة ثنائية الأبعاد لسهولة تحليل هجرة NCC ومورفولوجيا الفرخ التي يمكن أن تكمل أكثر تحديا تقنيا في طرق تصوير البويضة 24،25،26. في حين أن هذه الطريقة في المختبر بسيطة نسبيا ، إلا أن النتائج المتسقة تعتمد على البيض والكواشف عالية الجودة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للتباين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر كورين أ. فيرتشايلد وكاتي ل. فيرمليون ، اللتين شاركتا في تطوير نسختنا من بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة الفرخية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| AxioObserver مجهزة برأس مسح متحد البؤر LSM710 يتم التحكم فيه بواسطة برنامج ZEN 3.0 SR | استخدم Zeiss | alpha Plan-Apochromat 100x / 1.46 Oil DIC M27 الموضوعي | |
| CaCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| أطباق الغرفة (قاع زجاجي ، مفرد أو مقسم) | MatTek ؛ خلية فيس | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) غرفة | واحدة 35 مم أو 4 غرف 35 مم |
| غطاء زجاجي | شركة Carolina Biological Supply | Company 633029 ، 633031 ، 633033 ، 633035 ، 633037 | دوائر ، 0.13 & ndash ؛ سمك 0.17 مم ، متوفر بقطر 12-25 مم ؛ |
| DMEM / F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | بديل لوسائل الإعلام L15 |
| حاضنة البيض | Sportsman | 1502 | |
| FBS & nbsp ؛ | تقنيات الحياة | 10437-028 | |
| فيبرونيكتين | فيشر العلمي | CB-40008A | |
| ورق ترشيح | واتمان | الصف 3 مم كروماتوغرافيا | |
| ملقط (حاد) | فيشر العلمي ؛ توماس ساینتفيك | 08-890 (فيشر) ؛ 1141W97 (توماس) | |
| ملقط (جيد) أدوات | العلوم الدقيقة | 11252-20 | دومون # 5 |
| صورة J | https://fiji.sc/ | برنامج تحليل الصور | |
| المجاني KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| تصاعد وسائل الإعلام (Vectashield أو ProLong Gold) | مختبرات ناقلات ؛ ثيرموفيشر العلمي | H-1700 (Vectashield) ؛ P36930 (ProLong Gold) | |
| Na 2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 وحدة / مل البنسلين ؛ 10,000 مجم / مل من الستربتومايسين |
| أطباق بتري | VWR (أو ما شابه) | 60 مم ، 100 مم | |
| فالودين | سيجما-ألدريتش | P1951 | فلوروفورات متعددة متوفرة |
| حامل دبوس | أدوات العلوم الدقيقة | 26016-12 | لإبرة التنغستن (بديل لمقص الربيع) |
| مقص (تشريح) | أدوات العلوم الدقيقة | 14061-10 | |
| العلوم | الدقيقة15000-08 | 2.5 مم حافة القطع (بديل لإبرة التنغستن) | |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| مرشحات حقنة | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV وحدة تصفية حقنة ، 0.22 & micro ؛ م ، PVDF ، 33 مم ، |
| أطباق زراعة الأنسجة | جاما Sarstedt | 83-3900 | أطباق ثقافة 35 مم لثقافات الطيات العصبية السائبة |
| سلك التنغستن Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| مجموعة متنوعة من المصادر | 0.01 بوصة قطر لإبرة التنغستن (بديل لمقص الربيع) |
المراجع
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
