مقالة منهجية

إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت

DOI:

10.3791/63799

⸱

يونيو 27, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تطور الفقاريات ، تهاجر خلايا القمة العصبية (NCCs) على نطاق واسع وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا التي تساهم في هياكل مثل الهيكل العظمي القحفي الوجهي والجهاز العصبي المحيطي. في حين أنه من الأهمية بمكان فهم هجرة NCC في سياق الجنين 3D ، فإن عزل الخلايا المهاجرة في ثقافة 2D يسهل التصور والتوصيف الوظيفي ، مكملا الدراسات الجنينية. يوضح البروتوكول الحالي طريقة لعزل الطيات العصبية القحفية للكتاكيت لتوليد مزارع NCC الأولية. تنبثق NCCs المهاجرة من الطيات العصبية المطلية على ركيزة مغلفة بالفيبرونيكتين. وينتج عن ذلك مجموعات سكانية مشتتة ومترابطة تابعة ل NCC يمكن تقييمها عن طريق التحليق والتحليلات المورفولوجية الكمية. هذا النهج الثقافي المبسط قابل للتكيف بشكل كبير ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى. على سبيل المثال، يمكن تقييم سلوكيات الهجرة والهجرة NCC عن طريق التصوير بالفاصل الزمني أو الاستعلام عنها وظيفيا من خلال تضمين مثبطات أو تلاعبات تجريبية بالتعبير الجيني (على سبيل المثال، الحمض النووي، أو مورفولينو، أو كريسبر إلكتروبوراتيون). بسبب تنوعها ، توفر هذه الطريقة نظاما قويا للتحقيق في تطوير NCC في الجمجمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا عابرة في أجنة الفقاريات. يتم تحديد NCCs عند حدود الصفيحة العصبية وتخضع لانتقال ظهاري إلى وسيط (EMT) للهجرة من الأنبوب العصبي الظهري1. بعد EMT ، تنتشر NCCs على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى التمييز والمساهمة في هياكل مختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي القحفي الوجهي ، ومسار التدفق الخارجي للقلب ، وغالبية الجهاز العصبي المحيطي2. التغيرات في قطبية الخلية ، والهيكل الخلوي ، وخصائص الالتصاق وراء هذا التحول من مجموعة الخلايا المهاجرة إلى الخلايا المهاجرة3. توفر دراسة NCC EMT والهجرة نظرة ثاقبة على الآليات الأساسية لحركية الخلايا وإبلاغ الجهود المبذولة لمنع وعلاج العيوب الخلقية وورم خبيث السرطان.

في حين أن التحليل في الجسم الحي أمر حيوي لفهم العمليات التنموية NCC في سياق جنيني ، فإن الأساليب في المختبر توفر إمكانية الوصول البصري والمادي التي تسهل طرقا تجريبية إضافية. في بيئة 2D مبسطة ، يمكن تقييم مورفولوجيا NCC والهياكل الهيكلية الخلوية والمسافة التي تم ترحيلها. علاوة على ذلك ، يمكن تحليل آثار اضطراب العوامل الوراثية أو القابلة للذوبان على سلوكيات الهجرة ل NCCs المتحركة 4,5,6,7,8,9,10. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع NCCs المعزولة قبل الهجرة أو الهجرة وتجميعها واستخدامها في منهجيات عالية الإنتاجية لدراسة التنظيم التنموي ل NCCs من خلال التنميط البروتيني والنسخي واللاجينومي 7,11. في حين أن الطرق متاحة لإعداد NCCs الجمجمة من مختلف الكائنات الحية النموذجية التنموية12،13،14 ، توضح هذه المقالة آليات النهج لأولئك الذين يتعلمون أولا لزراعة NCC الجمجمة من أجنة الكتاكيت.

يصف البروتوكول الحالي تقنية متعددة الاستخدامات لإعداد مزارع NCC في الجمجمة الفركتية (الشكل 1). نظرا لأن NCCs تهاجر بسهولة من الطيات العصبية المزروعة إلى ركيزة مستزرعة ، فإن NCCs الكتاكيت تنفصل بشكل طبيعي عن الأنسجة الجنينية ، ويتم توليد الثقافات الأولية بسهولة. مع هجرة NCCs في الدماغ المتوسط بشكل جماعي من الطيات العصبية القحفية (على النقيض من التفكيك المطول لكل خلية على حدة في الجذع15) ، تتكون هذه الثقافات بشكل رئيسي من خلايا القمة العصبية القحفية المهاجرة ، مع استئصال الطية العصبية الأولية التي توفر طريقة جمع ل NCCs المهاجرة. يتم تفصيل طريقة أساسية لتشريح وزراعة الطيات العصبية القحفية للكتاكيت ، ويتم تقديم اقتراحات لتطبيقات واختلافات مختلفة على هذه الطريقة.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة (A,B) يتم استئصال الطيات العصبية القحفية (الموضحة باللون الأزرق) من جنين الفرخ مع خمسة سوميت (كما هو موضح في المنظر الظهري في A). العصابات الرمادية ، الهلال القلبي. (ج) عندما تكون مطلية على الفيبرونيكتين ، تخرج خلايا القمة العصبية المهاجرة من الطيات العصبية وتنتشر على الركيزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام أي مجموعة متنوعة من سلالات جالوس جالوس ، بما في ذلك White Leghorn أو Golden Sex Link أو Rhode Island Red. كان بيض الدجاج المستخدم في هذه الدراسة من سلالات مختلفة وتم الحصول عليه من مصادر متعددة ، بما في ذلك المزارع المحلية والمفرخات.

1. إعداد الحلول والمواد

  1. قم بإعداد محلول Ringer عن طريق خلط 123.3 mM NaCl و 1.53 mM CaCl 2 و 4.96 mM KCl و 0.809 mM Na 2 HPO 4 و 0.147 mM KH 2PO4 (انظر جدول المواد). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 وقم بتصفية التعقيم في زجاجات سعة 100 مل. يخزن في مكان نظيف وجاف. لا تغسل الزجاجات بالصابون (تعامل معها على أنها أواني زجاجية لزراعة الأنسجة).
  2. تحضير 1 ملغ / مل محلول مخزون فيبرونيكتين (FN) (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة FN في محلول رينجر المعقم وتخزينها في 100 ميكرولتر أليكوتس عند -80 درجة مئوية (مستقرة لمدة 4 سنوات على الأقل).
  3. قم بإعداد وسائط استزراع كاملة عن طريق استكمال وسائط L15 بنسبة 0.8٪ L-glutamine و 0.08٪ بنسلين / ستربتومايسين و 10٪ FBS و 10٪ مستخلص جنين الفرخ12. قم بإنشاء 3 مل من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا تم احتضان الثقافات في حاضنة CO2 ، فيجب استبدال DMEM / F12 ب L15 ، الذي يتم تخزينه مؤقتا للهواء.
  4. تحضير 4 ٪ محلول بارافورمالديهايد في 1x PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. قم بإنشاء 10 مل من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    تحذير: يجب التعامل مع بارافورمالدهيد في غطاء الدخان.
  5. قم بإعداد إطارات دعم ورق الترشيح (حوالي 1 سم × 1.5 سم مستطيلات من الورق مع وجود ثقبين أو ثلاثة ثقوب مثقوبة متداخلة على المحور الطويل).
    1. قم بثقب الثقوب على طول حافة قطعة كبيرة من ورق الترشيح باستخدام ثقب قياسي ثلاثي الثقوب ، وقم بقص / تقليم الحافة المثقوبة في شريط ، ثم قم بقطع الشريط بين الثقوب إلى مستطيلات بطول ~ 1.5 سم. أوراق تصفية الأوتوكلاف قبل الاستخدام (اختياري).
  6. اجمع أدوات التشريح ، بما في ذلك الملقط الناعم ، والملقط الحاد ، ومقص التشريح ، ومقص الزنبرك ، وإبر التنغستن الحادة16.

2. حضانة الأجنة

  1. الحصول على البويضات المخصبة من أي من المصادر المذكورة أعلاه.
  2. ضع البويضات المخصبة في وضع مستقيم (محور طويل من البويضة عموديا مع نهاية مدببة لأسفل / جانب حاد لأعلى) داخل حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت).
  3. احتضن حتى تتشكل أربعة إلى سبعة سوميت (المراحل 8+-9)17 ، والتي تستغرق حوالي 35 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة بشكل كبير اعتمادا على سلالة الدجاج وعمره والموسم وما إلى ذلك ، ويجب تحديده تجريبيا. تعد مؤقتات المخرج القابلة للبرمجة مفيدة لبدء الحضانة أثناء الليل للحصول على التوقيت المطلوب.
  4. بعد الإزالة من الحاضنة ، رش البيض جيدا بالإيثانول بنسبة 70٪ واتركه يجف لتطهير القذائف.
    ملاحظة: يمكن جمع الأجنة على الفور، ولكن ترك البيض يبرد إلى درجة حرارة الغرفة يقلل من هشاشة صفار البيض وفقدان الأجنة أثناء الجمع.

3. إعداد الأطباق الثقافية

  1. حدد أطباق زراعة الطيات العصبية (انظر جدول المواد) المناسبة للتطبيق النهائي.
    1. بالنسبة للثقافات التي ستكون ثابتة وملونة ، استخدم أغطية زجاجية موضوعة في أطباق زراعة الأنسجة متعددة الآبار.
      ملاحظة: ستتحرك الأغطية التي تتناسب مع حجم البئر بشكل أقل مع خلط السوائل ، مما يجعل explants أقل عرضة للتحول وأكثر عرضة للالتصاق بالغطاء بدلا من قاع الطبق.
    2. اختر أطباق حجرة واحدة ذات قاع زجاجي أو أطباق حجرة مقسمة (انظر جدول المواد) للتصوير المباشر باستخدام مجهر مقلوب.
    3. للتصوير الحي على مجهر مستقيم أو ستيريو، استخدم ألواح زراعة الأنسجة المناسبة بصريا من 6 أو 12 أو 24 بئرا.
    4. اختر أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية للجمع الشامل لخلايا القمة العصبية المهاجرة لإجراء تحليلات عالية الإنتاجية.
  2. أضف 10 U / mL من البنسلين و 10 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين إلى زجاجة 100 مل من محلول Ringer المعقم (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من 10000 U / mL البنسلين و 10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، لجعل Ringer's P / S). استخدم P / S من Ringer في غضون 1 أسبوع.
  3. قم بإذابة أليكوت من 1 ملغم / مل من FN على الجليد. تمييع مع P / S رينجر إلى تركيز 10-100 ميكروغرام / مل من FN.
  4. Pipet ما يكفي من حل FN لتغطية الجزء السفلي من البئر أو الطبق. على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر لكل بئر في طبق من 24 بئرا ، 500 ميكرولتر لطبق 35 مم.
  5. استبدل الغطاء واحتضن الأطباق أو الأطباق بمحلول FN في حاضنة مرطبة (أو صينية مغطاة بمناشف ورقية مقطرة غارقة في الماء) عند 38 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) لمدة ساعة واحدة على الأقل أثناء تشريح الطيات العصبية.

4. عزل أجنة الفرخ

  1. احرص على الحفاظ على اتجاه البويضة (يطفو الجنين إلى أعلى صفار البيض أثناء الحضانة). استخدم المقص أو الملقط الحاد لكزة ثقب صغير في القشرة ، حوالي 1/4-1/3 من الطريق إلى أسفل طول البيضة.
    1. أدخل بعناية طرف المقص أو الملقط الحاد في الحفرة الصغيرة ، مما يضمن عدم تعطيل صفار البيض ، وقطع قشر البيض حول البيضة ، وإزالة الجزء العلوي من قشر البيض (الشكل 2A).
  2. ضع الجنين للعزل.
    ملاحظة: إذا لم يكن الجنين موجودا بشكل مثالي في كوب القشرة ، فاستخدم ملقطا حادا لتحويل صفار البيض بعناية ، بحيث يكون الجنين في الأعلى. بدلا من ذلك ، صب صفار البيض في يد محجبة ، مع الحرص على عدم كسر صفار البيض والسماح للألبومين بالتصريف (الشكل 2B). بعد ذلك ، يمكن وضع الجنين عن طريق تحريك صفار البيض من يد إلى أخرى.
  3. قم بتحضير الجنين باستخدام الحافة المسطحة للملقط الحاد المغلق بلطف لمسح أي ألبومين زائد يبقى على سطح صفار البيض الذي يغطي الجنين (الشكل 2C). يمكن أيضا إزالة الألبومين الزائد باستخدام ضغط لطيف باستخدام ممسحة مهام حساسة.
    ملاحظة: بمجرد إزالة الألبومين ، يجب أن يظهر سطح صفار البيض محكم بدلا من أن يكون ناعما. الفشل في مسح ما يكفي من الألبومين سيمنع التصاق دعم ورقة الترشيح في القسم 4 ، الخطوة 4.
  4. استخدم الملقط لوضع إطار دعم ورقة الترشيح فوق الجنين، مع وجود الجنين في نافذة الإطار. اضغط برفق لأسفل على ورقة الترشيح للصقها على صفار البيض.
  5. قطع حول الجزء الخارجي من إطار ورقة الترشيح مع مقص تشريح (الشكل 2D). استخدم الملقط أو أطراف المقص للإمساك بحافة الإطار ورفع الجنين برفق بعيدا عن صفار البيض (الشكل 2E). الرفع بعيدا بزاوية سيساعد على إزالة الجنين بشكل نظيف من صفار البيض.
  6. ضع الجنين مع الإطار الورقي جانبا لأسفل (الجانب البطني للجنين لأعلى) في طبق بتري 60 مم أو 100 مم مملوء ب P / S من Ringer (الشكل 2F). احتفظ بطبق الأجنة على الجليد إذا تم تجميعه لتطبيق الحمض النووي الريبي أو البروتين الحساس في المصب.
    ملاحظة: الفشل في وضع الأجنة من الجانب البطني لأعلى يهدد بفصلها عن إطاراتها الورقية. يمكن جمع أجنة متعددة وتخزينها في P / S من Ringer لمدة تصل إلى 1 ساعة قبل الانتقال إلى خطوات تشريح الطية العصبية.

5. تشريح الطيات العصبية

  1. انقل الجنين إلى طبق نظيف يحتوي على محلول P/S من رينجر وشطف الجنين عن طريق الإمساك بإطار ورق الترشيح بالملقط والتأرجح بلطف ذهابا وإيابا لإزالة أي صفار يحجب رؤية الجنين. استبدل P / S الخاص ب Ringer أو انقله إلى طبق طازج إذا أصبح غائما.
  2. ضع الجانب الظهري / الإطار للجنين لأعلى تحت مجهر تشريح. ترك الجنين على الإطار الورقي لإبقائه ممدودا مشدودا ومثبتا في مكانه ، قم بإزالة غشاء vitelline باستخدام ملقط لفضح الطيات العصبية.
    ملاحظة: إذا سقط الجنين من الإطار الورقي ، فيمكن وضعه بشكل مسطح في الطبق أو تثبيته على طبق مطلي بالسيلغارد18 للتشريح.
  3. باستخدام مقص الربيع أو إبرة التنغستن الحادة ، قم باستئصال الطيات العصبية في الدماغ المتوسط بعناية. قم بتضمين الأنسجة الذيلية إلى الحويصلات البصرية المتوسعة والسطح إلى الدماغ الخلفي ، حيث بدأت انقباضات المعين في الظهور للتو (الهلال القلبي هو أيضا مؤشر مفيد ، الشكل 3B ، C). احرص على استئصال الجانب الظهري الأكثر من الطية العصبية مع الحد الأدنى من الأنبوب العصبي الملوث والأديم الخارجي غير العصبي (الشكل 3C).
  4. انقل الطيات العصبية إلى طبق نظيف يحتوي على P/S من Ringer's باستخدام ماصة P20 أو ماصة باستور معقمة من الزجاج تشطف بصفار Ringer's P/S (هذا يمنع البلاستيك أو الزجاج لمنع الأنسجة من الالتصاق). تخزين الطيات المجمعة على الجليد أثناء تشريح طيات إضافية.

6. طلاء الطيات العصبية

  1. إذابة عنوان "وسائل الإعلام الثقافية الكاملة" (القسم 1، الخطوة 3). أضف 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وقم بتعقيم المرشح. حافظ على إعداد الوسائط عند 37-38 درجة مئوية أثناء تنفيذ خطوات أخرى.
  2. قم بإزالة أطباق الثقافة من الحاضنة (القسم 3 ، الخطوة 5). باستخدام ماصة أو ماصة باستور ، قم بإزالة محلول FN من الأغطية أو الأطباق أو الآبار. بعد شطف الركيزة المطلية ب FN باستخدام P / S من Ringer ، أضف حجما مناسبا من وسائط الثقافة الكاملة إلى الأطباق أو الآبار (500 ميكرولتر للآبار في طبق مكون من 24 بئرا ، أو 2 مل لطبق 35 مم أو طبق من ستة آبار).
    ملاحظة: يمكن للأحجام الأصغر أن تحافظ على كواشف باهظة الثمن (على سبيل المثال ، منخفضة تصل إلى 200 ميكرولتر لطبق من 24 بئرا) ولكنها تضمن ترطيب الطبق بما فيه الكفاية لتجنب التبخر.
  3. باستخدام ماصة p20 أو p200 ، أولا ، اشطف طرف الماصة باستخدام P / S من Ringer لحظر البلاستيك ومنع الأنسجة من الالتصاق. بعد ذلك ، انقل الطيات العصبية المعزولة إلى أغطية FN المطلية ، مع الحرص على نقل أقل قدر ممكن من P / S من Ringer. ضع الطية (الطيات) باتجاه وسط الغطاء المطلي ب FN.
    ملاحظة: يمكن طلاء واحدة أو بضع طيات عصبية على غطاء 12 مم في بئر 19 مم ، وما يصل إلى 50 على لوحة 35 مم.
  4. بعد السماح للنباتات بالاستقرار لمدة 10-15 دقيقة ، ضعها في غرفة رطبة عند 38 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) عن طريق حمل الأطباق الثقافية ببطء وبعناية مع طيات عصبية مطلية. سيؤدي ذلك إلى تقليل تحول الطيات العصبية في الآبار ، مما يضمن بقائها مشتتة والتمسك بأي أغطية جانبية.
    ملاحظة: عند استخدام L15 (وليس DMEM) ، يمكن أيضا احتضان أطباق زراعة الإكسبلانت في حاضنة البيض باستخدام صينية مغطاة بمناشف ورقية مبللة.
  5. احتضان ثقافات الطيات العصبية في الحاضنة الرطبة طوال مدة الهجرة النشطة (حوالي 16-20 ساعة إجمالا ، الشكل 4).

7. إصلاح وتلطيخ NCCs المهاجرة المستزرعة للتحليل المورفولوجي

  1. قم بإزالة وسائط الاستزراع باستخدام ماصة باستور وشطف الآبار باستخدام 1x PBS معقمة بالفلتر.
  2. أضف 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد يلزم تحديد وقت التثبيت تجريبيا. من الممكن أيضا إضافة بارافورمالديهايد مباشرة إلى الوسائط لمدة 10 دقائق (50:50) ، وإزالتها ، واستبدالها ببارافورمالديهايد 4٪ غير المخفف لمدة 10 دقائق للاحتفاظ بالهياكل الخلوية الأكثر حساسية.
  3. إزالة بارافورمالديهايد وشطف ثلاث مرات مع 1x PBS.
  4. وصمة عار NCCs ثابتة مع صبغة مناسبة للتقييم المورفولوجي. على سبيل المثال ، يتم تفصيل التلطيخ مع الفيلويدين المترافق في ولاية أوريغون الخضراء هنا.
    ملاحظة: يكشف تصور الهيكل الخلوي للأكتين باستخدام phalloidin19 عن التعقيد الهيكلي ل NCC المهاجر مع كثافة تلطيخ موحدة نسبيا ؛ ومع ذلك ، قد لا يسلط الفيلويدين الضوء على جميع مناطق الخلايا. يمكن أيضا استخدام الأصباغ التي تضع علامات على غشاء البلازما (على سبيل المثال ، جرثومة القمح agglutinin أو DiI) أو السيتوبلازم ، ولكنها تعقد تصوير النتوءات الدقيقة بالنسبة لجسم الخلية الملطخ بشكل مشرق. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التألق المناعي في وقت واحد لتسمية خلايا القمة العصبية ب HNK-1 أو لتحديد التوطين تحت الخلوي لبروتين ذي أهمية 7,20.
    1. قم بإزالة شطف PBS النهائي وإضافة PBS + 0.5٪ Triton X-100 (PBST) + مصل 5٪ (FBS أو من آخر مناسب للتلطيخ مع جسم مضاد) لتغطية الغطاء واحتضانه لمدة 10 دقائق على شاكر منصة في درجة حرارة الغرفة.
    2. Pipet 200 نانومتر من الفيلويدين المترافق في ولاية أوريغون الخضراء (المخفف في PBST + مصل 5٪) على سطح أملس (مثل فيلم ختم البارافين المرن) لكل غطاء. للحصول على غطاء 12 مم ، قم بماصة بحجم 30 ميكرولتر.
    3. باستخدام زوج من الملقط ، قم بإزالة الغطاء من مصل PBST + 5٪ ، مما يضمن الحفاظ على اتجاه الخلايا التي تواجه الأعلى. المس لفترة وجيزة حافة الغطاء إلى ممسحة مهمة حساسة للتخلص من السائل الزائد.
    4. ضع بلطف كل خلية غطاء جانبا لأسفل على قطرة من الفلويدين المخفف. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأغطية الغطاء في الظلام أثناء التلطيخ (قم بتغطيتها بطبق مغطى بورق الألمنيوم أو ضعها في درج).
    5. أثناء الحضانة ، أضف PBST إلى آبار طبق الاستزراع (750 ميكرولتر من PBST لكل بئر من طبق 24 بئرا).
    6. بعد فترة الحضانة ، ارفع الغطاء عن محلول التلطيخ وضعه مرة أخرى في طبق الثقافة ، واقلب الغطاء بحيث يكون جانب الخلية لأعلى. تأكد من تغطية الغطاء ب PBST ووضعه على شاكر المنصة لمدة 10 دقائق ، مع الحفاظ على أغطية الغطاء مغطاة وفي الظلام. قم بإزالة PBST وكرر هذه الخطوة مرتين ، لما مجموعه ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق.
    7. ضع قطرة واحدة (لكل غطاء) من وسائط التركيب (انظر جدول المواد) على شريحة المجهر. حجم 25 ميكرولتر يعمل بشكل جيد لغطاء 12 ملم.
    8. بعد الغسيل النهائي باستخدام PBST ، المس حافة الغطاء إلى ممسحة مهمة حساسة لإزالة السائل الزائد ، مع تتبع جانب الخلية من الغطاء .
    9. قم بتركيب خلية الغطاء جانبا لأسفل عن طريق خفض الغطاء ببطء بزاوية على وسائط التركيب لتجنب إنشاء فقاعات. اسمح للوسائط بتعيين قبل التصوير.

8. التقييم المورفولوجي للمراكز الوطنية المهاجرة المستزرعة

  1. صورة الخلايا الملطخة وتصديرها كملفات .tiff.
    ملاحظة: يعمل هدف 40x بشكل جيد مع ثقافات التصوير ، ولكن يمكن استخدام الأهداف التي تتراوح من 10x (لالتقاط حقل كامل من NCCs المهاجرة) إلى 100x (NCCs واحدة) لجمع الصور للتقييم المورفولوجي. تم التقاط الصور في هذه الدراسة باستخدام منصة تصوير متعددة الوسائط مقلوبة (انظر جدول المواد).
  2. قم بتحميل الصور إلى برنامج تحليل الصور (ImageJ21، انظر جدول المواد). انقر فوق Image > Duplicate لإنشاء نسخة ثانية من كل صورة لاستخدامها في التحليل ، وبالتالي ترك النسخة الأصلية دون تحرير ، حيث لا يمكن عكس معظم معالجة الصور.
  3. انقر فوق الصورة > ضبط السطوع / التباين > واستخدام أشرطة منزلقة لضبط سطوع أو تباين الصور.
  4. قم بتحويل الصور إلى تدرج رمادي باتباع الخطوات أدناه.
    1. إذا تم تصدير الصور في RGB ، تحميلها في RGB كقناة مدمجة. لفصل الصور ، انقر فوق Image > Color > Split Channels للحصول على صور ذات تدرج رمادي أحادي القناة.
    2. إذا كانت الصور منفصلة بالفعل، فانتقل إلى Image > Type > 8 بت لتحويل الملف إلى تدرج رمادي.
  5. انقر فوق Image > Adjust > Threshold للتحويل إلى صورة ثنائية حيث يتم تعريف وحدات البكسل كخلايا (أمامية ؛ أسود) أو خلفية (بيضاء). استخدم الشريط المنزلق و / أو انقر فوق تلقائي لتحديد إعداد العتبة الذي يحدد بوضوح الخلايا من الخلفية.
    1. إذا كانت الخلايا متداخلة أو لم يكن التلطيخ مستمرا ، فقد يكون من الضروري معالجة المزيد باستخدام وظيفتي مستجمعات المياه أو ثقوب التعبئة22. سيؤدي ذلك إلى فصل الخلايا عن بعضها البعض أو ملء الفجوات داخل الخلايا المراد تحليلها. انقر فوق Process > Binary > Make Binary لتحويل الصورة أولا إلى تنسيق ثنائي 8 بت. ثم انقر فوق معالجة > مستجمعات المياه الثنائية > أو ملء الثقوب.
      ملاحظة: سيجعل البرنامج أكثر ملاءمة للمكان الذي تحتاج فيه الإشارات إلى فصلها أو ملئها ، والتي يمكن تعديلها بشكل أكبر باستخدام المكونات الإضافية إذا لزم الأمر.
  6. حدد القياسات المراد التقاطها. انقر فوق تحليل > مجموعة القياسات وحدد مربعات واصفات الشكل لتحليل الدائرية (دائرية) ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR) والاستدارة (الجولة) والصلابة.
    ملاحظة: يمكن أيضا تضمين قياسات أخرى، مثل المساحة والمحيط، اعتمادا على نوع التحليل المطلوب.
  7. انقر فوق تحليل > تحليل الجسيمات ، وتعيين المعلمات من قائمة "تحليل الجسيمات".
    1. تحت عنوان "الحجم"، قم بتقدير حجم الخلايا أو الجسيمات ذات الأهمية تقريبا بالبكسل، حيث سيتم أيضا تضمين إشارة الخلفية أو حطام الخلايا الأصغر إذا ظلت معلمة الحجم محددة عند 0-Infinity (على سبيل المثال، تم تعيينها على أنها 500-Infinity في الشكل 5).
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي ضبط الحجم إلى نطاق أكثر إحكاما إلى استبعاد جزيئات أصغر أو أكبر من تلك اللازمة للتحليل.
    2. ضمن "الدائرية"، اترك عند 0-1.0 لقياس جميع أشكال الخلايا في الصورة.
    3. ضمن "إظهار"، حدد الخطوط العريضة العارية من القائمة المنسدلة لفحص الخطوط العريضة للخلية المحددة باستخدام وظيفة "تحليل الجسيمات". امسح الخطوط العريضة ضوئيا للتأكد من تمييز الخلايا المتداخلة، ولكن لا يتم تقسيم الخلايا دون داع. حدد أيضا مربعات القائمة الخاصة ب "عرض النتائج" و "تلخيص" و "إضافة إلى المدير".
  8. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، انقر فوق موافق.
    ملاحظة: ستظهر أربع نوافذ منفصلة، تعرض (1) الخطوط العريضة العارية للخلايا المحددة في الصورة، (2) الخلايا التي تم حسابها في الصورة، (3) نتائج قياسات كل خلية، و (4) ملخصا للعدد الإجمالي للخلايا التي تم حسابها ومتوسط قياساتها.
    1. إذا تم حساب الحطام، تم حساب الخلايا المتداخلة كخلية واحدة، أو تم حساب الخلايا المفردة كمضاعفات، أو تم حذف العديد من الخلايا من العد، والعودة إلى الصورة الأصلية غير المحررة، وعمل نسخة مكررة أخرى، وضبط "العتبة" أو غيرها من المعلمات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1 عرض عام لهذا البروتوكول. تم فتح البيض المحتضن ، وتم عزل صفار البيض ، مع الجنين على السطح ، عن طريق سكبه بلطف في راحة يد قفاز (الشكل 2A ، B). بعد إزالة الألبومين (الشكل 2C) ، تم تطبيق إطارات ورق الترشيح على غشاء صفار البيض المحيط بالجنين لتسهيل قطع الجنين ورفعه من صفار البيض ، والذي يبدأ في التسرب بمجرد قطع أغشية صفار البيض (الشكل 2D ، E).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر التقنية الموصوفة هنا طريقة قابلة للتكيف لعزل الطيات العصبية للكتاكيت وطلائها لإنشاء ثقافات من NCCs الجمجمية المهاجرة. توفر هذه الثقافات ظروفا مبسطة ثنائية الأبعاد لسهولة تحليل هجرة NCC ومورفولوجيا الفرخ التي يمكن أن تكمل أكثر تحديا تقنيا في طرق تصوير البويضة 24،25،26. في حين أن هذه الطريقة في المختبر بسيطة نسبيا ، إلا أن النتائج المتسقة تعتمد على البيض والكواشف عالية الجودة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للتباين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر كورين أ. فيرتشايلد وكاتي ل. فيرمليون ، اللتين شاركتا في تطوير نسختنا من بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة الفرخية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AxioObserver مجهزة برأس مسح متحد البؤر LSM710 يتم التحكم فيه بواسطة برنامج ZEN 3.0 SRاستخدم Zeissalpha Plan-Apochromat 100x / 1.46 Oil DIC M27 الموضوعي
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC3306
أطباق الغرفة (قاع زجاجي ، مفرد أو مقسم)MatTek ؛ خلية فيسP35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis) غرفة		واحدة 35 مم أو 4 غرف 35 مم
غطاء زجاجيشركة Carolina Biological SupplyCompany 633029 ، 633031 ، 633033 ، 633035 ، 633037دوائر ، 0.13 & ndash ؛ سمك 0.17 مم ، متوفر بقطر 12-25 مم ؛
DMEM / F12ThermoFisher Scientific11320033بديل لوسائل الإعلام L15
حاضنة البيضSportsman1502
FBS & nbsp ؛تقنيات الحياة10437-028
فيبرونيكتينفيشر العلميCB-40008A
ورق ترشيحواتمانالصف 3 مم كروماتوغرافيا
ملقط (حاد)فيشر العلمي ؛ توماس ساینتفيك08-890 (فيشر) ؛ 1141W97 (توماس)
ملقط (جيد) أدواتالعلوم الدقيقة11252-20دومون # 5
صورة Jhttps://fiji.sc/برنامج تحليل الصور
المجاني KClSigma-AldrichP3911
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichP0662
L15 mediaInvitrogen11415064
L-glutamineInvitrogen25030
تصاعد وسائل الإعلام (Vectashield أو ProLong Gold)مختبرات ناقلات ؛ ثيرموفيشر العلميH-1700 (Vectashield) ؛ P36930 (ProLong Gold)
Na 2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-AldrichS9638
NaClSigma-AldrichS9888
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin / StreptomycinLife Technologies15140-14810,000 وحدة / مل البنسلين ؛ 10,000 مجم / مل من الستربتومايسين
أطباق بتريVWR (أو ما شابه)60 مم ، 100 مم
فالودينسيجما-ألدريتشP1951فلوروفورات متعددة متوفرة
حامل دبوسأدوات العلوم الدقيقة26016-12لإبرة التنغستن (بديل لمقص الربيع)
مقص (تشريح)أدوات العلوم الدقيقة14061-10
العلومالدقيقة15000-082.5 مم حافة القطع (بديل لإبرة التنغستن)
SylgardKraydenSylgard 184
مرشحات حقنةSigma-AldrichSLGVM33RSMillex-GV وحدة تصفية حقنة ، 0.22 & micro ؛ م ، PVDF ، 33 مم ،
أطباق زراعة الأنسجةجاما Sarstedt83-3900أطباق ثقافة 35 مم لثقافات الطيات العصبية السائبة
سلك التنغستن Triton X-100Sigma-AldrichX100
مجموعة متنوعة من المصادر0.01 بوصة قطر لإبرة التنغستن (بديل لمقص الربيع)
أدوات المعقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231(2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ

مقالات ذات صلة