هنا ، نقدم بروتوكولا لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين الداخلي المنشأ وبروتيناتها المتفاعلة من الخلايا والأنسجة وتحديدها وتحديدها كميا بواسطة البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي.
مقالة منهجية
نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تنظيم معظم العمليات الخلوية عن طريق فسفرة البروتين الديناميكية. أكثر من ثلاثة أرباع البروتينات مفسفرة ، وفوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتيني (PPPs) تنسق أكثر من 90٪ من جميع عمليات إزالة الفوسفور الخلوية من السيرين / الثريونين. وقد تورط تحرير فسفرة البروتين في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والتنكس العصبي. وعلى الرغم من نشاطها الواسع النطاق، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في الشراكات بين القطاعين العام والخاص وتلك التي تسيطر عليها الشراكات بين القطاعين العام والخاص لا تتسم بخصائص كافية. هنا ، يتم وصف نهج بروتيني يسمى حبات مثبطات الفوسفاتيز وقياس الطيف الكتلي (PIB-MS) لتحديد وقياس PPPs ، وتعديلاتها بعد الترجمة ، ومفاعلاتها المتفاعلة في أقل من 12 ساعة باستخدام أي خط خلية أو أنسجة. يستخدم PIB-MS مثبطا غير انتقائي لتعادل القوة الشرائية ، microcystin-LR (MCLR) ، مثبتا على حبات السيفاروز لالتقاط وإثراء PPPpps الذاتية المنشأ والبروتينات المرتبطة بها (تسمى PPPome). لا تتطلب هذه الطريقة التعبير الخارجي للإصدارات الموسومة من PPPs أو استخدام أجسام مضادة محددة. يقدم PIB-MS طريقة مبتكرة لدراسة الشراكات بين القطاعين العام والخاص المحفوظة تطوريا وتوسيع فهمنا الحالي لإشارات إزالة الفسفرة.
المقدمة
تتحكم فسفرة البروتين في معظم العمليات الخلوية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاستجابة لتلف الحمض النووي ، وإشارات عامل النمو ، والمرور عبر الانقسام1،2،3. في خلايا الثدييات ، يتم فسفوريلات غالبية البروتينات في واحد أو أكثر من بقايا سيرين أو ثريونين أو التيروزين في وقت ما ، مع فوسفوسرين وفوسفوثريونين يشكلون حوالي 98 ٪ من جميع مواقع الفسفرة 2,3. في حين تمت دراسة الكينازات على نطاق واسع في الإشارات الخلوية ، فإن دور الشراكات بين القطاعين العام والخاص في تنظيم العمليات الخلوية الديناميكية لا يزال ناشئا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم توليد PIBs كما هو موضح من قبل Moorhead et al. ، حيث يقترن 1 ملغ من microcystin وحوالي 6 مل من sepharose لتوليد PIBs بقدرة ربط تصل إلى 5 mg / mL17.
1. إعداد العينات
ملاحظة: كمية البدء النموذجية ل PIB-MS هي 1 ملغ من البروتين الكلي لكل حالة. في هذه التجربة ، تم استخدام ما يقرب من 2.5 × 106 خلايا HeLa لاستخراج 1 ملغ من البروتين. يجب إجراء هذا الحساب لكل خط خلية أو نسيج يتم استخدامه في تجربة18. إذا كانت العينة محدودة ولا يمكن الحصول على 1 ملغ ، يمكن تقليل كمية المدخلات مع فقدان طفيف للكشف عن الوحدة الفرعية PPP. بدلا من ذلك ، يمكن است....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 2: تحديد روابط PIBs محددة . (أ) يمكن تحليل مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة أو الخلايا عبر PIB-MS. تمت معالجة خلايا HeLa في الثلاثي البيولوجي إما باستخدام DMSO أو MCLR المثبط ل PPP ، وتم احتضانها باستخدام PIBs ، وتم تحليلها عبر LC-MS / MS. (B) مخطط بركان لتحليل PIB-MS في DMSO و MCLR معالج ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
PIB-MS هو نهج بروتينات كيميائية يستخدم لتحديد ملامح PPPome كميا من مصادر عينة مختلفة في تحليل واحد. تم القيام بالكثير من العمل باستخدام حبات مثبطات كيناز لدراسة الكينوم وكيف يتغير في السرطان والحالات المرضية الأخرى10،11،12،13. ومع ذلك، فإن دراسة PPPome متخلفة عن الركب. نتوقع أن يكون هذا النهج قادرا على سد هذه الفجوة وإلقاء الضوء على تنظيم إزالة الفسفرة الخلوية. هنا ، نظهر أنه باستخدام PIBs ، يم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه ولا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تعترف A.N.K. بالدعم المقدم من NIH R33 CA225458 و R35 GM119455. نشكر مختبري Kettenbach و Gerber على مناقشتهما المفيدة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأسيتونيتريل (ACN) | هانيويل | AH015-4 | تحذير: ACN قابل للاشتعال وسام ؛ ارتد القفازات ، واعمل في غطاء دخان كيميائي. |
| الأسيتونيتريل اللامائي | سيجما ألدريتش | 271004-100 مل | تحذير: ACN قابل للاشتعال وسام ؛ ارتد القفازات واعمل في غطاء دخان كيميائي. |
| جهاز طرد مركزي على الطاولة | Eppendorf | موديل رقم 5424 | |
| حمض بيتا جليسيروفوسفوريك ، ملح ثنائي الصوديوم خماسي هيدرات | Acros Organics | 410991000 | |
| أجهزة طرد مركزي | Eppendorf | نموذج رقم 5810 R 15 أمبير إصدار | |
| الماء | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce الأنسجة مطحنة | فيشربراند بيليه بيستلز | 12-141-363 | |
| قرص استخراج الطور الصلب Empore ، C18 | CDS التحليلي | 76333-132 | |
| أنابيب Eppendorf ، 1.5 مل | Eppendorf | 22363204 | حرجة: قد تتسرب الأنابيب الأخرى إلى البوليمر في العينة ، مما يؤدي إلى تلويث التحليل. |
| أنابيب Eppendorf ، 2 مل | Eppendorf | 22363352 | حرجة: قد تتسرب الأنابيب الأخرى إلى البوليمر في العينة ، مما يؤدي إلى تلويث التحليل. |
| مشعب لوحة الاستخراج | Waters | WAT097944 | |
| Falcon ، 50 مل | VWR | 21008 | |
| إبرة نهاية حادة عامة ومكبس | |||
| رف | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| كلوريد الهيدروجين (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | تنبيه: حمض الهيدروكلوريك مادة أكالة. ارتد القفازات واعمل في غطاء الدخان الكيميائي. |
| محلول هيدروكسيلامين 50٪ (بالوزن / الحجم) | 467804 | سيجما ألدريتش | |
| ، 65 درجة ؛ C | VWR | موديل رقم 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol ، 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol ل HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | تحذير: MeOH قابل للاشتعال وسام ؛ ارتد القفازات ، واعمل في غطاء دخان كيميائي. |
| Microcystin LR (MCLR) | كايمان كيميكال | 10007188 | تحذير: MCLR سام ؛ ارتد القفازات عند التعامل مع الجلد وتجنب ملامسة الجلد. |
| PBS, 1× بدون الكالسيوم والمغنيسيوم, الرقم الهيدروجيني 7.4 ± 0.1 | Corning | شرائط اختبار الأس الهيدروجيني 21-040-CV | |
| ، مثل شرائط اختبار الأس الهيدروجيني MilliporeSigma MColorpHast وأوراق المؤشرات | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | للحصول على بروتوكول لتوليد PIBs ، انظر Moorhead et al. ، 2007. | ||
| مجموعة فحص البروتين بيرس BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| أطراف ماصة ، 10 & مو ؛ L | Eppendorf | 22491504 | حرج: قد تتسرب النصائح الأخرى إلى عينات ، مما يؤدي إلى تلويث التحليل. |
| أطراف الماصة ، 1000 مو ؛ إل | إيبندورف | 22491555 | حرجة: قد تتسرب النصائح الأخرى إلى عينات ، مما يؤدي إلى تلويث التحليل. |
| أطراف الماصة ، 200 مو ؛ L | Eppendorf | 22491539 | حرجة: قد تتسرب النصائح الأخرى إلى البوليمر في العينات ، مما يؤدي إلى تلويث التحليل. |
| حقنة بلاستيكية ، 10 مل | BD | 309604 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز III | منتجات الأبحاث الدولية | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ، Oribtrap Fusion Lumos ، أو Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer ؛ | من Thermo Scientific | ||
| Eppendorf | موديل رقم 5424 R | ||
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | دوران 8 دورة في الدقيقة |
| لوحة جمع العينات ، 96- بئر ، 1 مل | ووتر | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| درجة التسلسل معدل التربسين | Promega | V511C | |
| أزيد الصوديوم | EMD Chemicals | SX0299-1 | تنبيه: أزيد الصوديوم متفجر وسام ؛ ارتد القفازات ، واعمل في غطاء الدخان الكيميائي وتجنب ملامسة المعادن. |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر | كيميكال | S27110 | |
| سونيكاتور (سونيفايير برانسون الرقمي) | نموذج رقم. SFX 250 | ||
| SPE C18 لوحة تحلية | المياه | 186001828BA | |
| SpeedBeads جزيئات الكربوكسيل المغناطيسية المعدلة (حبات SP3) | Cytiva | 6.51521E + 13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | نموذج رقم 5350 | |
| مجموعة كاشف الملصقات متساوي الضغط TMT10plex بالإضافة إلى كاشف الملصقات TMT11-131C ، 3 مرات ؛ 0.8 مجم لكل علامة | ThermoFisher | A37725 | |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | تحذير: TFA مادة أكالة وتهيج الجلد عند ملامستها. ارتد القفازات وواقي العين ، واعمل في غطاء الدخان الكيميائي. |
| تريس بیس | ريش للمنتجات الدولية | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| أجهزة الطرد المركزي الفراغية ومصيدة البخار | النموذج العلمي الحراري | . SpeedVac SPD120 و RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | العلمية | ||
| للمياه LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
المراجع
- Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Bra....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن