مقالة منهجية

إظهار تعصيب الجلد المشعر و Glabrous في نمط 3D باستخدام أساليب تلطيخ الفلورسنت المتعددة وإزالة الأنسجة

DOI:

10.3791/63807

⸱

مايو 20, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حد سمك أقسام الأنسجة من الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة لإزالة الأنسجة لتصور الألياف العصبية الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي تبلغ سماكتها 300 ميكرومتر تحت المجهر البؤري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعصيب الجلد هو جزء مهم من الجهاز العصبي المحيطي. على الرغم من أن دراسة الألياف العصبية الجلدية قد تقدمت بسرعة ، إلا أن معظم فهم خصائصها التوزيعية والكيميائية يأتي من تلطيخ الأنسجة الكيميائية التقليدية والكيميائية المناعية على أقسام الأنسجة الرقيقة. مع تطور تقنية إزالة الأنسجة ، أصبح من الممكن عرض الألياف العصبية الجلدية على أقسام الأنسجة الأكثر سمكا. يصف هذا البروتوكول تلطيخ الفلورسنت المتعدد على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر من الجلد الأخمصي والظهري للقدم الخلفية للفئران ، وهما موقعان نموذجيان للبشرة المشعرة والزجاجية. هنا ، يقوم الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين بتسمية الألياف العصبية الحسية ، في حين أن الفيلويدين ومستقبل الهيالورونان البطاني البطاني للأوعية اللمفاوية 1 يصنفان الأوعية الدموية واللمفاوية ، على التوالي. تحت المجهر البؤري ، تم اتباع الألياف العصبية الحسية المسماة بالكامل على مسافة أطول ، وتعمل في حزم في الطبقة الجلدية العميقة وحرة في الطبقة السطحية. ركضت هذه الألياف العصبية بالتوازي مع الأوعية الدموية أو تحيط بها ، وشكلت الأوعية اللمفاوية شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجلد المشعر والزجاجي. يوفر البروتوكول الحالي نهجا أكثر فعالية لدراسة تعصيب الجلد من الطرق التقليدية الحالية من منظور المنهجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد ، أكبر عضو في الجسم ، بمثابة واجهة رئيسية للبيئة ، يتم تعصيبه بكثافة من قبل العديد من الألياف العصبية1،2،3. على الرغم من أن تعصيب الجلد قد تمت دراسته على نطاق واسع سابقا باستخدام طرق نسيجية مختلفة ، مثل التلطيخ على أقسام الجلد والأنسجة الكاملة4،5،6 ، إلا أن العرض الفعال المفصل للألياف العصبية الجلدية لا يزال يمثل تحديا7،8. وبالنظر إلى ذلك، طور البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لإظهار الألياف العصبية الجلدية بشكل أكثر وضوحا في قسم الأنسجة السميكة.

بسبب الحد الأقصى لسمك الأقسام ، فإن مراقبة الألياف العصبية الجلدية المعصوبة ليست دقيقة بما يكفي لتصوير العلاقة بين الألياف العصبية للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والأنسجة والأعضاء المحلية بدقة من معلومات الصورة المكتسبة. يوفر ظهور تقنية إزالة الأنسجة ثلاثية الأبعاد طريقة مجدية لحل هذه المشكلة 9,10. قدم التطور السريع لنهج تطهير الأنسجة العديد من الأدوات لدراسة هياكل الأنسجة والأعضاء بأكملها والإسقاطات العصبية والحيوانات الكاملة في الآونة الأخيرة11. يمكن تصوير أنسجة الجلد الشفافة في قسم أكثر سمكا بواسطة المجهر البؤري للحصول على البيانات اللازمة لتصور الألياف العصبية الجلدية.

في الدراسة الحالية ، تم اختيار الجلد الأخمصي والظهري للفئران الخلفية كموقعين مستهدفين للجلد المشعر والزجاجي3،4،7. لتتبع الألياف العصبية الجلدية على مسافة أطول ، تم تقطيع أنسجة الجلد بسماكة 300 ميكرومتر للتلطيخ الكيميائي المناعي والكيميائي النسيجي ، يليه علاج إزالة الأنسجة. تم استخدام CGRP لتسمية الألياف العصبية الحسية12,13. بالإضافة إلى ذلك ، لتسليط الضوء على الألياف العصبية الجلدية على خلفية الأنسجة ، تم استخدام phalloidin و lymphatic الأوعية البطانية hyaluronan receptor 1 (LYVE1) لتسمية الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية ، على التوالي14,15.

قدمت هذه الأساليب طريقة مباشرة يمكن تطبيقها لإظهار رؤية عالية الدقة للألياف العصبية الجلدية وأيضا لتصور العلاقة المكانية بين الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد ، والتي قد توفر المزيد من المعلومات لفهم توازن الجلد الطبيعي والتغيير الجلدي في ظل الظروف المرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والكى ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الرقم المرجعي D2018-04-13-1). وأجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن العاصمة، 1996). تم استخدام ثلاثة فئران ذكور بالغة (Sprague-Dawley ، الوزن 230 ± 15 جم) في هذه الدراسة. تم إيواء جميع الحيوانات في دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة مع درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها والسماح لها بحرية الوصول إلى الطعام والماء.

1. التروية وإعداد العينات

  1. حقن 250 مغ/كغ من محلول ثلاثي برومو الإيثانول (انظر جدول المواد) داخل الصفاق في الفئران للحث على القتل الرحيم.
  2. بمجرد توقف التنفس ، استخدم مقص جراحي من الفولاذ المقاوم للصدأ لفتح التجويف الصدري للفئران. استخدم إبر 20 جم للتنقل عبر البطين القلبي الأيسر13 بمعدل 3 مل / دقيقة مع 100 مل من محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ متبوعا ب 250-300 مل من 4٪ بارافورمالديهايد في مخزن فوسفات 0.1 م (PB ، درجة الحموضة 7.4) (الشكل 1A ، B).
  3. بعد التروية ، استخدم مشرطا لإزالة جلد الظهرية والنعل من المخلب الخلفي.
    1. بالنسبة للعينات التي تتطلب قسما مجمدا ، قم بعد إصلاح الأنسجة في 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M PB لمدة 2 ساعة ؛ ثم بالتبريد حماية الأنسجة في 25٪ السكروز في 0.1 M PB لأكثر من 24 ساعة عند 4 درجة مئوية
    2. بالنسبة للعينات ذات القسم السميك الذي يتطلب إزالة الأنسجة ، قم بعد إصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ paraformaldehyde في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) لمدة 2 ساعة ؛ ثم قم بتجميد الأنسجة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية (الشكل 1C-E).

2. تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP ، phalloidin ، و LYVE1 تليها معالجة إزالة الأنسجة

ملاحظة: تم تطبيق تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP و phalloidin و LYVE1 للكشف عن الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد المشعر والزجاجي على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر بعد علاج إزالة الأنسجة.

  1. تحضير 2٪ من الأغاروز في 1x PBS عن طريق التسخين في فرن صغير لمدة دقيقتين حتى يذوب الأغاروز (انظر جدول المواد).
  2. بعد الغسيل ، قم بتضمين أنسجة الجلد في 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية ، وضعها داخل صندوق الثلج للتبريد (الشكل 1F ، G).
  3. ثبت الأنسجة المثبتة على الميكروتوم الاهتزازي بالماء المثلج وقطعها بسماكة 500 ميكرومتر في الاتجاه المستعرض. استخدم المعلمات التالية لضبط قطاعة الاهتزاز وإنهاء التقطيع: السرعة، 0.50 مم/ثانية، والسعة، 1.5 مم (الشكل 1H-K).
  4. بعد التقطيع ، قم بإزالة الأغاروز من الأقسام ، وتخزينها في لوحة من ستة آبار مع 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) (الشكل 1L).
  5. احتضان أقسام الأنسجة في محلول 2٪ Triton X-100 في 1x PBS (TriX-PB) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. انظر الشكل 2 للاطلاع على الإجراء التالي.
  6. ضع أقسام الأنسجة في المخزن المؤقت المانع وقم بتدويرها عند 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت المانع هي 10٪ مصل الحمير العادي ، و 1٪ Triton-X 100 ، و 0.2٪ أزيد الصوديوم في 1x PBS (انظر جدول المواد).
  7. انقل أقسام الأنسجة إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP (1:500) والجسم المضاد متعدد النسيلة متعدد النسيلة LYVE1 (1:500) في مخزن مؤقت للتخفيف في أنبوب الطرد المركزي الدقيق (انظر جدول المواد) ، وقم بالتدوير على الخلاط لمدة يومين عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت للتخفيف هو 1٪ مصل الحمير العادي ، 0.2٪ Triton-X 100 ، و 0.2٪ أزيد الصوديوم في 1x PBS.
  8. اغسل أقسام المناديل مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية في مخزن الغسيل المؤقت.
    ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت للغسيل هي 0.2٪ Triton-X 100 في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
  9. في اليوم التالي ، انقل أقسام الأنسجة إلى محلول مختلط يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية للحمار المضاد للفأر IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) والحمار المضاد للأغنام IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ، وكذلك Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (انظر جدول المواد) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتدور عند 72 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  10. اغسل أقسام الأنسجة في طبق من ستة آبار مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة 1 ساعة ، مرتين ، في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأقسام الأنسجة في مخزن الغسيل المؤقت على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  11. انقل مقاطع الأنسجة إلى كاشف إزالة الأنسجة (انظر جدول المواد ، كان حجمه أكبر بخمس مرات من حجم العينة) وقم بالتدوير عند 60 دورة في الدقيقة على الخلاط بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد هذا العلاج ، تصبح أقسام الأنسجة واضحة (الشكل 2B).
  12. قم بتركيب الأنسجة التي تم تطهيرها على الشريحة ، وقم بتدوير الأنسجة باستخدام فاصل ، والتمسك بالفجوة باستخدام كاشف إزالة الأنسجة الطازجة والغطاء .

3. تلطيخ الفلورسنت الثلاثي مع CGRP ، phalloidin ، و LYVE1 باتباع النهج التقليدي

ملاحظة: على سبيل المقارنة، تم إجراء نفس التلطيخ على أقسام الأنسجة بسماكة 30 ميكرومتر وفقا للتقنيات التقليدية.

  1. قم بتقطيع مقاطع الأنسجة عند 30 ميكرومتر على ميكروتوم في الاتجاه العرضي وقم بتركيبها على الشريحة.
  2. أضف محلول الحجب مع مصل الحمار العادي بنسبة 3٪ و 0.3٪ Triton X-100 في 0.1 M PB واحتضن الأقسام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة محلول الحجب واحتضن الأقسام بالمحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP (1:500) والجسم المضاد المضاد LYVE1 متعدد النسيلة (1:500) في مخزن مؤقت للتخفيف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  4. في اليوم التالي ، اغسل أقسام الأنسجة ب 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثلاث مرات ، وأضف المحلول المختلط الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية للحمار المضاد للفأر IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) والحمار المضاد للأغنام IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ، وكذلك Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) على الأقسام واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قبل المراقبة المجهرية ، اغسل الأقسام في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثلاث مرات ، ثم قم بتغطيتها بأغطية في 50٪ من الجلسرين.

4. التصوير والتحليلات

  1. راقب العينات الملطخة تحت مجهر الفلورسنت، ثم التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة.
  2. التقط 30 صورة (مكدسات Z)، كل منها في إطارات 10 ميكرومتر، من كل مقطع بسمك 300 ميكرومتر ودمج صورة واحدة في التركيز البؤري باستخدام معالج صور من نظام الفحص المجهري البؤري (انظر جدول المواد).
    1. قم بتنفيذ الخطوات التالية في برنامج معالجة الصور الخاص بالإعداد البؤري للتحليل ثلاثي الأبعاد (3D): تعيين بدء تشغيل المستوى البؤري | تعيين | المستوى البؤري النهائي تعيين | حجم الخطوة اختر نمط العمق | | التقاط الصور سلسلة Z.
      ملاحظة: كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأزرق 401 نانومتر و 421 نانومتر على التوالي. كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأخضر 499 نانومتر و 519 نانومتر ، على التوالي. كانت الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لإشارات التألق الأحمر 591 نانومتر و 618 نانومتر على التوالي. 152 ميكرومتر هو قطر الثقب البؤري (عدسة موضوعية 10x ، NA: 0.4). كانت دقة التقاط الصورة 1024 × 1024 بكسل.
  3. بالنسبة للعينات التقليدية (الخطوة 3) ، التقط 30 صورة (مكدسات Z) في إطارات 1 ميكرومتر من كل مقطع بسمك 30 ميكرومتر وتعامل مع هذه الصور كما هو مذكور أعلاه (الخطوات 4.1-4.2).
  4. إظهار الصور في نمط إعادة الإعمار 3D مع نظام معالجة الصور.
  5. قم بإجراء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عن طريق استيراد صور متحدة البؤرة Z-stack إلى Imaris 9.0 (برنامج تصوير الخلايا ، انظر جدول المواد) وإنشاء عروض سطحية بناء على كثافة البقع: إضافة أسطح جديدة | اختر مصدر القناة | حدد المعلمات في الخيار السلس لتفاصيل الأسطح | تحديد المعلمات في خيار العتبة للكثافة المطلقة | تصنيف الأسطح | انتهى.
  6. الحصول على البيانات في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية باستخدام برنامج تصوير الخلايا. حدد | الصورة المعروضة الإحصائيات | | مفصلة | قيم محددة الحجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تلطيخ الفلورسنت الثلاثي ، تم تصنيف الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية بوضوح مع CGRP و phalloidin و LYVE1 ، على التوالي ، في الجلد المشعر و glabrous (الشكل 3,4). مع العلاج المقاصة ، يمكن تصوير الألياف العصبية الإيجابية CGRP ، والأوعية الدموية الإيجابية للفالويدين ، والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE1 على عمق أكبر للحصول على المعلومات الهيكلية الكاملة للجلد (الشكل 3). عندما تم إعادة بناء هياكل الأنسجة هذه في نمط 3D ، أصبح توزيع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة عرضا مفصلا للألياف العصبية الجلدية في الجلد المشعر واللامع باستخدام التألق المناعي على أقسام الأنسجة السميكة مع علاج واضح وعرض 3D لفهم تعصيب الجلد بشكل أفضل. وقت حضانة الأجسام المضادة يصل إلى 1-2 أيام وعملية التنظيف بين عشية وضحاها مهمة. تؤثر هاتان الخطوتان الرئيسيتان بشكل مباشر على تأثير تلطيخ التألق المناعي للأقسام السميكة. أثيرت مشكلة أخرى من اختيار الأجسام المضادة ، ليست كلها مناسبة للأقسام السميكة. نتوقع أن الأجسام المضادة ذات الأوزان الجزيئية الأصغر قد تكون مثالية لتلطيخ التألق المناعي للأقسام السم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية صندوق الابتكار (رمز المشروع رقم. CI2021A03404) والصندوق الوطني للابتكار متعدد التخصصات في الطب الصيني التقليدي (رمز المشروع رقم. ZYYCXTD-D-202202).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفاتSolarbio Life SciencesP1020درجة الحموضة 7.2-7.4 ، 0.01 مول
2،2،2-TribromoethanolSigma Life ScienceT48402-5G
الفحص المجهري الفلوري متحد البؤرOlympus CorporationFluoview FV1200
الحمار المضاد للفأر IgG H& L Alexa-Flour488Abcam plc.ab150105
الحمار المضادة للأغنام IgG H& L Alexa-Flour405Abcam plc.ab175676
أنبوب EPWuxi NEST للتكنولوجيا الحيوية6150011.5 مل
نظام ميكروتوم انزلاق مرحلة التجميدLeica BiosystemsCM1860
Imaris SoftwareOxford Instrumentsv.9.0.1
مقص قياسي IRISWPI (World Precision Instruments Inc.)503242
iSpacerSunJin LabIS005
ملقط صغير-StrRWDF11020-11
ماوس أحادي النسيلة المضاد CGRP الأجسام المضادةسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، Inc.sc-57053
محايد مخزن FormalinSolarbio Life SciencesG216110٪
مصل الحمار العاديمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية017-000-1210 مل
مضخة معججةشركة مضخة الدقة الأطول المحدودةBT300-2J
فالودين أليكسا فلور 594ثيرمو فيشر العلميA12381
RapiClear 1.52 حلSunJin LabRC15200110 مل
من شركة أغاز الجينات العاديةالمحدودةG-10
SEMKEN 1 × 2 ملقط أنسجة الأسنان-StrRWDF13038-12
الأغنام متعددة النسيلة المضادة للأجسام المضادة ل LYVE1R & دي سيستمز ، إنك.AF7939
صفيحة بستة آباركورنينج إنكوربوريتد3335
أزيد الصوديومسيجما لايف ساينسS200225 جم
سكروزسيجما لايف ساينسV900116500 جم
سوبر غراءHenkel AG & Co.باتكس 502
مقابض جراحيةRWDS32003-12
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 مل
UrethaneSigma Life ScienceU2500500 g
VANNAS مقص زنبركيRWDS1014-12
ميكروتوم اهتزازيLeica BiosystemsVT1200S
شركة شركة شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181(2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Skin InnervationHairy SkinGlabrous SkinTissue ClearingFluorescent StainingConfocal MicroscopySensory Nerve FibersBlood VesselsLymphatic VesselsCGRP Staining

مقالات ذات صلة