تصور تطور الندبة باستخدام فحص SCAD - فحص تندب الجلد خارج الموقع الطبيعي

التئام الجروح هو عملية لاستعادة الجروح المخترقة. تؤدي إصابات الأنسجة في اللافقاريات إلى تجديد جزئي أو كامل. في المقابل، تستجيب الثدييات للإصابات العميقة عن طريق التندب، وهي عملية مصممة خصيصا لإغلاق الجروح بسرعة باستخدام سدادات كثيفة من ألياف المصفوفة التي تقلل من المنطقة المخترقة وفي الوقت نفسه تشوه الموقع المصاب بشكل دائم¹،^2،3. حروق الجلد الكبيرة أو الجروح المفتوحة العميقة في الثدييات تؤدي إلى أنماط ظاهرية مرضية مثل الندوب الضخامية أو الجدرة ^4,5. هذه الندوب الوفيرة تسبب عبئا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية السريرية والعالمية. في الولايات المتحدة وحدها ، تكلف إدارة الندوب حوالي 10 مليارات دولار سنويا ^6,7. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير منهجيات ذات صلة لفهم العمليات والآليات الأساسية التي ينطوي عليها تكوين الندبات بشكل أفضل.

في السنوات الأخيرة ، كشفت مجموعة واسعة من الدراسات التي أجريت على الفئران عن مجموعات من الخلايا الليفية غير المتجانسة ذات القدرات الوظيفية المتميزة بناء على أصولها في مواقع جلدية معينة⁸،^9،10. في الجلد الخلفي ، حدد Rinkevich et al. ، 2015 ، أن مجموعة محددة من الخلايا الليفية مع تعبير جنيني مبكر عن Engrailed-1 (En1) ، تسمى EPF (Engrailed positive Fibroblast) تساهم في تندب الجلد عند الجرح. وعلى العكس من ذلك، فإن سلالة أخرى من الخلايا الليفية ليس لها تاريخ من التعبير المتشابك، وهي الخلايا الليفية السلبية المسننة (ENF)، لا تساهم في تكوين الندبة⁸. يسمح رسم خرائط المصير لهذه السلالات En1 باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تحركها Cre والتي تم عبورها إلى خطوط ماوس مراسل التألق مثل R26 mTmG (En1Cre x R26^mTmG) بتصور مجموعات EPF و ENF.

دراسة هجرة الخلايا الليفية في الجسم الحي على مدى عدة أيام محدودة بسبب القيود الأخلاقية والتقنية. علاوة على ذلك ، فإن شاشات مكتبة الأجسام المضادة المركبة والفيروسية والمحايدة لتعديل المسارات المشاركة في الندوب تمثل تحديا تقنيا. تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى القدرة على تصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للبشرة الحقيقية ، والتوحيد في تطور الندبة ، بالإضافة إلى تعقيد الأنسجة التي تحاكي بيئات الجلد في الجسم الحي ^11,12. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير اختبار تندب خارج الجسم الحي يسمى SCAD (الأنسجة الشبيهة ب SCar في طبق) ^13،14. يمكن إجراء هذا الفحص البسيط عن طريق استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم الذي يحتوي على البشرة والأدمة ومناطق اللفافة تحت الجلد وزراعتها في وسائط DMSO المكملة بالمصل لمدة تصل إلى 5 أيام. الندوب الناتجة عن SCAD تكرر بشكل موثوق السمات المميزة للنسخ والبروتينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن SCADs الناتجة عن خطوط الفئران المعدلة وراثيا ذات الصلة (على سبيل المثال ، الفئران En1) التي تم عبورها مع خطوط فأر مراسل الفلورسنت تسمح بتصور ديناميكيات هجرة الخلايا الليفية وتطوير الندوب بدقة غير مسبوقة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لأي تطبيقات عالية الإنتاجية (على سبيل المثال ، المكتبة المركبة أو مكتبة الأجسام المضادة أو الفحص الفيروسي)^13،14. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا محسنا لإنشاء SCADs وتطبيقات المعالجة اللاحقة لدراسة ديناميكيات الخلايا والمصفوفة في تطوير الندبة.

يقدم النموذج المعروض أدناه وصفا مفصلا خطوة بخطوة لجيل فحص SCAD كما هو موضح بإيجاز في Jiang et al.، 2020¹³. تم إجراء تحضيرات عينة SCAD بعد التضحية بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وحكومة بافاريا العليا. تم إيواء الحيوانات في منشأة الحيوانات في مركز هيلمهولتز في ميونيخ. تم الحفاظ على الغرف مع الرطوبة المثلى ودرجة حرارة ثابتة مع دورة ضوء 12 ساعة. تم تزويد الحيوانات بالطعام والماء المجاني.

1. إعداد أنسجة SCAD

1. التضحية الجراء حديثي الولادة في يوم ما بعد الولادة 0 أو اليوم 1 (P0 أو P1).
2. قم باستئصال الجلد الظهري الظهري كامل السماكة بعناية 1.5 سم على الأقل 1.5 سم حتى طبقة العضلات الهيكلية باستخدام مشرط جراحي معقم.
3. قشر الجلد باستخدام ملقط منحني معقم ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسوس الكامنة.
4. اغسل الأنسجة المستأصلة ب 50-100 مل من وسائط DMEM/F-12 الباردة لإزالة الدم الملوث.
5. اغسل مرة واحدة باستخدام محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس للحفاظ على صلاحية الأنسجة والخلايا.
6. ضع الجلد رأسا على عقب (اللفافة السطحية في الأعلى) في طبق بتري 10 سم يحتوي على وسائط DMEM/F12.
7. باستخدام لكمة خزعة 2 مم يمكن التخلص منها ، قم باستئصال قطع الجلد المستديرة كاملة السماكة ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسية الكامنة حتى البشرة لتوليد أنسجة SCAD.
8. قم بإعداد وملء 200 ميكرولتر من DMEM / F12 (بدون الفينول الأحمر) وسائط كاملة - DMEM / F12 مكملة ب 10٪ FBS و 1x GlutaMAX و 1x MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية و 1x Penicillin / streptomycin في آبار فردية من صفيحة 96 بئرا.
9. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل أنسجة SCAD الفردية بعناية وغمرها بالكامل رأسا على عقب (اللفافة متجهة لأعلى) إلى آبار لوحة 96 بئرا.
10. انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ظل الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 21٪ (v / v) الأكسجين ، 5٪ (v / v) C0₂ ، و 95٪ رطوبة).

2. SCAD - زراعة الأنسجة

1. ثقافة SCADs في حاضنة لمدة تصل إلى 5 أيام.
2. في اليوم 2 واليوم 4 من الثقافة، استبدل الوسائط ب 200 ميكرولتر من الوسائط الكاملة DMEM/F12 الطازجة التي تم تسخينها مسبقا لضمان استمرار ظروف بقاء الخلايا والأنسجة. استبدل مركبات المعالجة أثناء كل تغيير في الوسائط.
   ملاحظة: تأكد من ترك 10 ميكرولتر من الوسائط في البئر لتجنب التصاق الأنسجة بالآبار.
3. قم بإعداد SCADs للتجارب التالية: التصوير الحي (القسم 3) ، وحصاد الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي 2D / 3D (القسم 4).

3. التصوير الحي ل SCADs

1. تحضير ما لا يقل عن 30 مل من 2٪ -3٪ (ث / v) محلول الأغاروز منخفض الذوبان في PBS في زجاجة زجاجية عن طريق تسخينه في الميكروويف حتى الغليان.
2. انقل الزجاجة على الفور وقم بتبريد محلول الأغاروز السائل في حمام مائي 40 درجة مئوية.
3. انقل نسيج SCAD مع واجهة / ندبة متجهة لأعلى إلى وسط طبق 35 مم.
4. قم بتضمين SCAD في درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق نقل الأغاروز السائل 40 درجة مئوية ببطء إلى طبق 35 مم باستخدام ماصة باستور. يتبلمر Agarose في غضون 2 دقيقة.
5. أضف 2 مل من وسائط DMEM/F12 الكاملة التي تم تسخينها مسبقا (بدون مؤشر أحمر الفينول).
6. احصل على صور بفاصل زمني لليوم 0 SCADs تصل إلى 48 ساعة باستخدام مجهر بؤري أو متعدد الفوتونات مجهز بنظام حضانة مناسب مضبوط على 37 درجة مئوية و 21٪ (v / v) أكسجين و 5٪ (v / v) C0₂ ورطوبة 95٪.

4. حصاد الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي 2D / 3D

1. اغسل الأنسجة في النقاط الزمنية ذات الصلة عن طريق استبدال الوسائط ب PBS معقمة.
2. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل SCADs الفردية بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde لإصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS واستمر في تلطيخ التألق المناعي 2D / 3D.
4. 3D تلطيخ التألق المناعي
   1. تخلل الأنسجة عن طريق الحضانة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS مع استكمال 0.2 ٪ من الجيلاتين ، 0.5 ٪ Triton-X100 ، و 0.01 ٪ Thimerosal (PBSGT) في RT لمدة 24 ساعة.
   2. تحضير كمية كافية من الأجسام المضادة الأولية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واحتضان أنسجة SCAD في 150 ميكرولتر من محلول PBSGT لمدة 24 ساعة في RT.
      ملاحظة: إذا لم يتم الإبلاغ عن تركيز الأجسام المضادة الأمثل للتألق المناعي من قبل الشركة المصنعة، فيجب إجراء معايرة الأجسام المضادة مسبقا على أنسجة التحكم باستخدام تركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 1:50، 1:200، 1:500، 1:1000).
   3. اغسل SCADs بلطف ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المقيد.
   4. احتضان الأنسجة مع 1: 1000 الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor ذات الصلة في PBS بين عشية وضحاها في RT.
   5. اغسل الأنسجة بلطف لمدة 30 دقيقة في PBS ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة غير المقيدة.
   6. انقل الأنسجة إلى طبق زجاجي سفلي 35 مم للتصوير متحد البؤرة أو متعدد الفوتونات.
      ملاحظة: عند استخدام أهداف الغمر بالماء، قم بتضمين SCADs في أغاروز منخفض درجة الانصهار بنسبة 2٪ لشل حركة الأنسجة لمنع الانجراف أثناء التقاط الصورة
5. 2D تلطيخ التألق المناعي
   1. انقل الأنسجة إلى قالب مبرد واملأها بلطف بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لغمر الأنسجة تماما.
   2. اضبط اتجاه الأنسجة بلطف ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هواء للحصول على مقطع عرضي أو مقطع رأسي.
   3. ضع القالب على الثلج الجاف لمدة 20-30 دقيقة واحتضن الكتلة عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   4. اضبط درجة حرارة الشفرة على -25 درجة مئوية ودرجة حرارة كتلة العينة على -17 درجة مئوية. قم بإعداد مقطع مبرد 6 ميكرومتر باستخدام جهاز تبريد ، وانقل الأقسام إلى شريحة التصاق ، وخزن الشرائح في ثلاجة -20 درجة مئوية.
   5. شطف الشرائح ثلاث مرات في PBS واحتضان الشرائح في 5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) ث / v في PBST (PBS مع استكمال 0.05٪ Tween) لمدة 1 ساعة.
   6. أضف كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية إلى 150μl PGST ، واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: إذا لم يتم الإبلاغ عن تركيز الأجسام المضادة الأمثل للتألق المناعي من قبل الشركة المصنعة، فيجب إجراء معايرة سابقة للأجسام المضادة على أقسام التحكم باستخدام تركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 1:50، 1:200، 1:500، 1:1000).
   7. اغسل الأقسام بلطف ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المقيد.
   8. احتضان الأنسجة مع 1: 1000 الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor ذات الصلة في PBS بين عشية وضحاها في RT لمدة 2 ساعة.
   9. اغسل الأنسجة بلطف لمدة 5 دقائق في PBS ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة غير المقيدة.
   10. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط تركيب يحتوي على DAPI وجفف الشرائح في الظلام في RT.
   11. قم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر التألق.

يمكن فصل توليد SCADs إلى ثلاث خطوات أساسية: حصاد الجلد مرة أخرى من الفئران P0-P1 ، وتوليد لكمات خزعة كاملة السماكة ، وزراعة لاحقة من السكادس الفردية تصل إلى 5 أيام في 96 لوحة بئر. كقراءة ، يمكن تطبيق هذا الفحص بشكل أكبر لتحليل الجوانب المكانية والزمنية للتندب. يستخدم التحليل المكاني 2D و 3D وضع العلامات المناعية للأنسجة لدراسة التوطين المكاني للمكونات الخلوية والمصفوفة داخل الأنسجة الندبية النامية. تسمح الدراسات المكانية الزمانية بتصور هذه الندوب خارج الموقع باستخدام بروتينات الفلورسنت الجوهرية أو الخارجية للأنسجة التي يمكن تصورها باستخدام طرق التصوير ذات الصلة بالفاصل الزمني 3D.

تتمثل الخطوات المحورية في هذا الفحص في إعداد التجربة من خلال توليد لكمات خزعة كاملة السماكة بعناية ، وضمان وجود طبقة "هلامية" لفافة ، وزراعة الأنسجة المغمورة بالكامل رأسا على عقب (البشرة تواجه الجزء السفلي من لوحات 96 بئرا). وهذا يسمح بتطوير ندوب موحدة، وديناميكيات هجرة مماثلة لمجموعات الخلايا الليفية ذات الصلة، وتقلص الجلد عبر SCADs (الشكل 1A). تسمح براعة فحص SCAD بحصاد الأنسجة عبر مجموعة كاملة من تطور الندوب. على سبيل المثال، إذا كان الهدف من التجربة هو دراسة الديناميات المبكرة للتندب، يمكن أن يقتصر التحليل المكاني والزماني المكاني على D1 أو D2 من ثقافة SCAD (الشكل 1B).

وتظهر في الشكل 2A والشكل 2A على التوالي صور تمثيلية كاملة التركيب للحقول الساطعة SCADs في اليوم 0 واليوم 5. لتحليل 2D ، من الضروري تضمين SCADs في OCT في اتجاه عمودي خال من فقاعات الهواء لضمان سلامة الأنسجة بعد التقسيم. يمكن أن تخضع أقسام الأنسجة هذه أيضا للتحليل النسيجي (على سبيل المثال ، تلطيخ ماسون ثلاثي الكروم - الشكل 2B ، 2B') أو تلطيخ التألق المناعي (الشكل 2C ، 2C') على المقاطع المبردة من En1Cre ، R26mTmG الأدمة الظهرية للفأر ؛ EPF باللون الأخضر و ENF باللون الأحمر من وقت مبكر (الشكل 2D) وندبة المرحلة المتأخرة (الشكل 2D').

يتطلب التصوير بالفاصل الزمني 3D و 3D للندوب اكتشاف إشارات التألق في عمق الأنسجة (400-800 ميكرومتر). الإثارة في الأطوال الموجية القريبة من الأشعة تحت الحمراء باستخدام الإثارة ثنائية الفوتون تمكن مثل هذه القياسات دون الحاجة إلى مسح الأنسجة ، وهي منهجية شائعة الاستخدام في التصوير ثلاثي الأبعاد لجعل الأنسجة شفافة عن طريق تقليل تشتت الضوء وامتصاصه15،16،17. استخدمنا مجهرا متعدد الفوتونات مستقيما مجهزا بهدف غمس الماء 25x مع ليزر قابل للضبط. تعرضت الأنسجة لتلطيخ المناعة 3D باستخدام المجسات ذات الصلة. بالنسبة للتصوير ثلاثي الأبعاد ، تم تضمين الأنسجة في محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 2٪ لشل الحركة أو منع الانجراف في الأنسجة (الشكل 3A) يعلوه PBSGT لمطابقة معامل الانكسار المطلوب لهدف غمر الماء. تظهر الصورة التمثيلية في الشكل 3B والشكل 3B 'التوطين الحصري لبروتين N-Cadherin (فلور وردي / أرجواني - Alexa 647) في موقع الندبة في اليوم 5 SCAD من جلد الظهر En1 Cre,R26mTmG ؛ EPF باللون الأخضر ، و ENF باللون الأحمر. بالنسبة للتصوير ثلاثي الأبعاد بالفاصل الزمني ، تم إجراء تعديل طفيف على الإعداد أعلاه عن طريق تضمين الأنسجة في محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 2٪ يعلوه وسائط DMEM / F12 بدون مؤشر أحمر الفينول بدلا من PBS. لضمان الظروف المناسبة لأنسجة SCAD "الحية" أثناء التصوير ، تمت إضافة غرفة حضانة مناسبة بحيث يتم تسجيل جميع الأنماط الظاهرية بشكل صحيح أثناء التصوير (الشكل 3C). تظهر لقطات تمثيلية لأسراب الخلايا الليفية المبكرة في الشكل 3D والشكل 3D والشكل 3D خلال المراحل الأولى من تطور الندبة البالغة 12 ساعة / المبكرة.

الشكل 1: سير العمل التخطيطي لفحص SCAD. (أ) يتم استئصال جلد الظهر من يوم ما بعد الولادة 0 / يوم 1 الجراء ، مما يضمن سلامة الأنسجة التي تحتوي على طبقات الجلد التالية: البشرة (E) ، الأدمة الحليمية والشبكية (PD و RD) ، وطبقة اللفافة (F) تليها لكمات خزعة 2 مم للحصول على SCADs يوم 0. (ب) يمكن بعد ذلك استزراع SCADs لاحقا لمدة تصل إلى 5 أيام مع خطوة اختيارية متقطعة للحصاد / تثبيت الأنسجة بناء على طبيعة التجارب الفردية (الأسهم المنقطة) مع خطوة تغيير وسائط الثقافة في اليوم 2 واليوم 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تلطيخ التألق المناعي ثنائي الأبعاد. قراءات تمثيلية 2D لدراسة ندوب المراحل المبكرة والمتأخرة باستخدام (A و A') صورة كاملة الحقل الساطع في اليوم 0 (A) واليوم 5 (A'). (B و B') تلطيخ ماسون الثلاثي لأقسام الأنسجة الرأسية للكشف عن بصمات تندب الأنسجة وتقلص النسيج وتراكم ECM في قلب الندبة (مثلث أصفر مملوء) في اليوم 0 (B) واليوم 5 (B'). (C و C') تحليل التألق المناعي لليوم 0 (C) واليوم 5 (C') SCADs الناتجة عن جلد الظهر En1 Cre,R26mTmG. تظهر EPFs باللون الأخضر ، و ENF باللون الأحمر ، و DAPI باللون الأزرق من ندبة المرحلة المبكرة (D) والمرحلة المتأخرة (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الإعداد التخطيطي والقراءات التمثيلية ل SCADs للتحليل المكاني والزماني ثلاثي الأبعاد. (أ) التمثيل التخطيطي لتضمين SCADs في هلام الأغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة بنسبة 2٪ تحت مجهر فلورسنت مستقيم و (ب) صورة تمثيلية ليوم ملطخ بالفلورسنت المناعي ثلاثي الأبعاد 5 SCAD تم إنشاؤه من En1 Cre,R26mTmG أدمة الفأر والملطخة بالمناعة مع الجسم المضاد N-Cadherin (أرجواني). يتم عرض EPFs باللون الأخضر وتظهر ENFs باللون الأحمر. (ج) التمثيل التخطيطي 3D التصوير SCAD الإعداد مجهزة غرفة الحضانة: 37 درجة مئوية، 21٪ (v / v) الأكسجين، 5٪ (v / v) C02، و 95٪ الرطوبة. (د) النتائج التمثيلية للتصوير الحي التي تظهر الأحداث المبكرة لتطور أسراب الخلايا الليفية (الدائرة البيضاء المتقطعة) في أول 12 ساعة من اليوم 0 واليوم 1 مرحلة SCAD. (ه) تمثيل بياني للمسارات الخلوية المتعقبة أحادية الخلية للخلايا الليفية الفردية في D و D و D''. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.