تصوير فائق الدقة خال من الملصقات يتم تمكينه عن طريق التصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة والتحليل

ملخص

من خلال الجمع بين كيمياء الهيدروجيل لتوسيع العينة والفحص المجهري المشبع الكيميائي الخالي من الملصقات ، يصف البروتوكول كيفية تحقيق تصوير حجمي فائق الدقة خال من الملصقات في العينات البيولوجية. باستخدام خوارزمية إضافية لتجزئة صور التعلم الآلي ، تم الحصول على صور متعددة المكونات الخاصة بالبروتين في الأنسجة بدون وضع علامات على الأجسام المضادة.

الملخص

إن الاستخدام الشامل للفحص المجهري الفلوري ، وخاصة الفحص المجهري فائق الدقة ، قد أدى إلى تطوير المعرفة حول علم الأحياء الحديث بشكل كبير. على العكس من ذلك ، فإن متطلبات وضع العلامات على الفلوروفور في تقنيات الفلورسنت تشكل تحديات كبيرة ، مثل التبييض الضوئي ووضع العلامات غير المنتظمة لمجسات الفلورسنت ومعالجة العينات لفترات طويلة. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم إجراءات العمل التفصيلية للتصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة وتحليلها (VISTA). يتحايل VISTA على العقبات المرتبطة بالفلوروفورات ويحقق تصويرا حجميا فائق الدقة خال من الملصقات في العينات البيولوجية بدقة مكانية تصل إلى 78 نانومتر. يتم إنشاء الإجراء عن طريق تضمين الخلايا والأنسجة في الهيدروجيل ، وتوسيع عينة الهيدروجيل الهجينة بشكل متناحي الخواص ، وتصور توزيعات البروتين الذاتية عن طريق التصوير الاهتزازي باستخدام الفحص المجهري المتناثر رامان المحفز. يتم توضيح هذه الطريقة على كل من الخلايا وأنسجة دماغ الفئران. لوحظت صور VISTA والتألق المناعي عالية الارتباط ، مما يثبت صحة أصل البروتين لخصائص التصوير. لاستغلال هذا الارتباط ، تم تدريب خوارزمية تجزئة الصور القائمة على التعلم الآلي لتحقيق تنبؤ متعدد المكونات للنوى والأوعية الدموية والخلايا العصبية والتشعبات من صور دماغ الفأر الخالية من الملصقات. تم تكييف الإجراء بشكل أكبر للتحقيق في مجاميع بولي الجلوتامين المرضية (polyQ) في الخلايا ولويحات الأميلويد بيتا (Aβ) في أنسجة المخ ذات الإنتاجية العالية ، مما يبرر إمكاناتها للعينات السريرية واسعة النطاق.

المقدمة

أحدث تطور طرق التصوير البصري ثورة في فهم علم الأحياء الحديث لأنها توفر معلومات مكانية وزمانية غير مسبوقة للأهداف عبر مقاييس مختلفة ، من البروتينات تحت الخلوية إلى الأعضاء الكاملة¹. من بينها ، يعد الفحص المجهري الفلوري هو الأكثر رسوخا ، مع مجموعة كبيرة من الأصباغ العضوية ذات معاملات الانقراض العالية والعوائد الكمومية² ، وبروتينات الفلورسنت المشفرة وراثيا سهلة الاستخدام³ ، وطرق فائقة الدقة مثل STED و PALM و STORM لتصوير الهياكل ذات الحجم النانومي^4،5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التطورات الحديثة في هندسة العينات و....

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي تم إجراؤها في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (IACUC) ، وامتثلت إجراءات البروتوكول لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة.

1. تحضير حلول المخزون للتثبيت وتوسيع العينة

1. قم بإعداد 40 مل من محلول التثبيت عن طريق إذابة 12 جم من مادة الأكريلاميد (30٪ وزن / حجم) صلب في 26 مل من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف 10 مل من محلول مخزون PFA بنسبة 16٪ إلى الخليط. أخيرا ، أضف 4 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS ، درجة الحموضة 7.4). يمكن تخزين المحلول المحضر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

النتائج

بعد تحديد مبدأ العمل لطريقة التصوير والتحليل ، تم تسجيل الصور لتقييم نسبة التمدد وضمان التمدد المتناحي أثناء معالجة العينة (الشكل 1 أ ، ب). تم تصوير كل من العينات غير المعالجة و VISTA أثناء استهداف اهتزاز الرابطة عند 2940 سم ⁻¹ ، والذي ينشأ من CH₃ من البروتينات الذاتية. في العينات غير المعالجة ، كانت الهياكل الغنية بالبروتين مثل النوى مظلمة بسبب محتوى الدهون الهائل من الأنسجة المحيطة²² (الشكل 1 أ). ب.......

المناقشة

باختصار ، نقدم بروتوكول VITA ، وهو طريقة خالية من الملصقات لتصوير الهياكل الخلوية وتحت الخلوية الغنية بالبروتين للخلايا والأنسجة. من خلال استهداف CH₃ الذاتي من البروتينات الموجودة في الخلايا والأنسجة المضمنة في الهيدروجيل ، تحقق الطريقة دقة تصوير فعالة تصل إلى 78 نانومتر في العينات البيولوجية وتحل البثق الطفيف في مجاميع والألياف هنتنغتين في لويحات Aβ. هذه التقنية هي المثيل الأول الذي يبلغ عن دقة أقل من 100 نانومتر لطرائق التصوير الخالية من^{الملصقات 22}. ب.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
علم المجهر الإلكتروني	Paraformaldehyde	15710	مخفف إلى 4٪ في PBS
25x هدف الغمر في الماء	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD الفئران	المتحولة ومراكز البحوث ومختبر جاكسون	B6SJL-Tg (APPSwFlLon ، PSEN1 * M146L * L286 V) 6799Vas / Mmjax	مرض الزهايمر في الدماغ
60x هدف الغمر في	الماء أوليمبوس	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
أكريلاميد	سيجما ألدريتش	A9099
بيرسلفات الأمونيوم	سيجما-ألدريتش	A3678
إشارات الخلايا	المضادة ل MAP2	8707
تقنية إشارات الخلايا	المضادة للنيو	24307
غطاء البورسليكات # 1.5	فيشر ساينتفيك	1254581
C57BL / 6J	مختبر الفئران جاكسون (JAX)	664	الفئران العادية
D2O	Sigma-Aldrich	151882	لمعايرة SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
شريحة زجاجية 3 "× 1" × 1 مم	VWR	16004-430
ماعز مضاد للدجاج IgY ، Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
الماعز المضاد للفئران IgG ، Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
عوازل السيليكون Grace Bio-Labs Press-To-Seal	Sigma-Aldrich	GBL664108	فاصل المجهر
Htt-97Q-GFP	هدية البلازميد من البروفيسور R. Kopitto والبروفيسور F.-U.Hartl.
مجهر المسح الضوئي بالليزر	أوليمبوس	FV3000	مجهر متحد البؤر بالمسح الضوئي
بالليزر ليبوفاكتامين 3000	ثيرمو	فيشر L3000001	عامل تعداء
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight & reg ؛ 594 (ليكتين)	مختبرات ناقلات	DL-1177-1
فاصل مجهر	جريس بيو لابس	621502
N ، N & Prime ؛ -methylenebisacrylamide (BIS)	تم شراء Sigma-Aldrich	M1533	كمحلول 2٪ في الماء
خال من النوكليز	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
حبات بولي سترين	Sigma-Aldrich	43302	لتوصيف الدقة
أكريلات الصوديوم	Sigma-Aldrich	408220
كبريتات دوديسيل الصوديوم	Sigma-Aldrich	71725
فرشاة طلاء الصوف الناعم # 3	TANIS	000333
SRS Laser	APE	picoEmerald	2ps عرض
النبضرباعي ميثيل إيثيلين ديامين	سيجما ألدريتش	T9281
قارورة زراعة الأنسجة 25 سم 2	كورنينج	430639
تريتون X-100	سيجما ألدريتش	T8787
توين -20	سيجما ألدريتش	P9416
ملاقط	أداة العلوم الدقيقة	11295-51
اهتزاز	لايكا	VT1200S	الاهتزاز

16٪ تقنية