يقدم البروتوكول طريقة لعزل محللات بروتين الخلية الكاملة عن عمليات الوجه الجنينية للفئران التشريحية أو خلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة وإجراء النشاف الغربي اللاحق لتقييم مستويات البروتين المفسفر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل تحلل بروتين الخلية الكاملة عن عمليات وجه الماوس وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة لتحليل البروتين الفوسفوبروتين
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. تبدأ هذه التغيرات المورفولوجية وتستمر من خلال تفاعلات الإشارات المتنوعة ، والتي غالبا ما تشمل فسفرة البروتين بواسطة الكينازات. هنا ، يتم تقديم مثالين على السياقات ذات الصلة الفسيولوجية التي يمكن من خلالها دراسة فسفرة البروتينات أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات: عمليات وجه الفأر ، وخاصة عمليات الفك العلوي E11.5 ، وخلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة المشتقة من أرفف الحنك الثانوية E13.5. للتغلب على الحاجز المشترك لإزالة الفسفرة أثناء عزل البروتين ، تتم مناقشة التعديلات والتعديلات على الطرق المختبرية القياسية التي تسمح بعزل البروتينات الفوسفورية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أفضل الممارسات للتحليل السليم وتحديد كمية البروتينات الفوسفاتية بعد النشاف الغربي لتحلل بروتين الخلية الكاملة. يمكن استخدام هذه التقنيات ، خاصة بالاقتران مع المثبطات الدوائية و / أو النماذج الجينية الفئرانية ، لاكتساب نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار مختلف البروتينات الفوسفاتية النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي.
المقدمة
التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. في الفأر ، تبدأ هذه العملية في اليوم الجنيني (E) 9.5 مع تكوين البروز الجبهي الأنفي وأزواج من العمليات الفكية والفك السفلي ، كل منها يحتوي على خلايا القمة العصبية القحفية بعد الهجرة. تنشأ العمليات الأنفية الجانبية والإنسية من البروز الجبهي الأنفي مع ظهور حفر الأنف وتندمج في النهاية لتشكيل الخياشيم. علاوة على ذلك ، تندمج العمليات الأنفية الإنسية والعمليات الفكية لتوليد الشفة العليا. في الوقت نفسه ، يبدأ تكوين الحنك بتكوين نتوءات متميزة - الأرفف الحنكية الثانوية - من الجانب الفموي لعمليات الفك العلوي عند E11.5. بمرور الوقت ، تنمو الأرفف الحنكي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لحرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية. تم استخدام إناث الفئران 129S4 في عمر 1.5-6 أشهر والموجودة في درجة حرارة شبه محايدة حراريا من 21-23 درجة مئوية لحصاد الأجنة. يتم تمثيل سير عمل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج والكواشف والحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. حصاد أجنة الفئران E11.5
- القتل الرحيم للفأر الأنثوي الحامل بعد 11.5 يوما من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند محاولة توصيف فسفرة البروتينات المعزولة من عمليات وجه الفأر و / أو خلايا اللحمة الحنكية المستزرعة ، ستكشف النتائج التمثيلية بشكل مثالي عن شريط مميز قابل للتكرار بعد النشاف الغربي بجسم مضاد مضاد للفوسفوبروتين يعمل عند أو بالقرب من ارتفاع نطاق البروتين الكلي المقابل (الشكل 3 ). ومع ذلك ، إذا حدث فسفرة واسعة النطاق للبروتين ، فقد يكون هناك تحول تصاعدي طفيف في نطاق البروتين الفوسفوبروتيني مقارنة بنطاق البروتين الكلي. علاوة على ذلك ، إذا كانت هناك أشكال متساوية متعددة من البروتين في الأنسجة ، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يسمح البروتوكول الموصوف هنا للباحثين بالتحقيق في أحداث الإشارات الحرجة المعتمدة على الفسفرة أثناء التطور القحفي الوجهي بطريقة قوية وقابلة للتكرار. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تضمن الجمع السليم للبيانات وتحليل النتائج. سواء كان عزل البروتينات الفوسفاتية عن عمليات وجه الفأر و / أو خلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة ، فمن الضروري التحرك بسرعة وكفاءة مع الحفاظ على جميع الكواشف والمواد على الجليد عند الإشارة إليها. تؤدي درجة الحرارة المنخفضة للجليد إلى إبطاء النشاط الأيضي في الخلايا ، وبالتالي ح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
كانت فئران 129S4 هدية من الدكتور فيليب سوريانو ، كلية إيكان للطب في جبل سيناء. تم دعم هذا العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة (NIDCR) R01 DE027689 و K02 DE028572 إلى K.A.F. ، F31 DE029976 إلى M.A.R. و F31 DE029364 إلى B.J.C.D.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>المعدات< القوية> | |||
| كتلة للحمام الجاف الصغير | الأبحاث International | Corp 400783 | |
| نظام التصوير ChemiDoc XRS + مع برنامج Image Lab | Bio-Rad | 1708265 | جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي |
| CO<>sub2< / sub> حاضنة ، سترة هوائية | VWR | 10810-902 | |
| تشريح لوح ، 11 × 13 بوصة | فيشر ساينتفيك | 09 002 12 | |
| خلية الرحلان الكهربائي ، 4 هلام ، للمواد الهلامية الصغيرة مسبقة الصب مع وحدة صغيرة من اللطخة المثلية | Bio-Rad | 1658030 | |
| فرن التهجين | فيشر Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D مع دوار F45-24-11 (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini Dry | Bath Research Products International Corp | 400780 | |
| شاكر مداري | VWR | 89032-092 | |
| مقياس الأس الهيدروجيني | VWR | 89231-662 | |
| مزود الطاقة ل SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| مقلاة ثلج مستطيلة ، ماكسي 9 لتر | فيشر سيانتيفيك | 07-210-093 | |
| Stemi 508 مجهر ستيريو مع حامل K Lab ، مصباح دائري | LED Zeiss | 4350649020000000 | تشريح المجهر |
| الموقت | VWR | 62344-641 | |
| مسدس أنبوبي | فيشر ساینتفيك | 11 676 341 | |
| خلاط دوامة | فيشر ساينتفيك | 02 215 414 | |
| حمام مائي | VWR | 89501-472 | |
| صندوق وصمة عار | غربي فيشر Scientific | NC9358182 | |
| المواد< / قوي > | |||
| أطباق ثقافة الخلايا ، 6 سم | فيشر ساينتفيك | 12-565-95 | |
| ألواح زراعة الخلايا ، 12 بئر | فيشر ساينتفيك | 07-200-82 | |
| رافعات الخلايا | فيشر ساينتفيك | 08-100-240 | |
| CO2< / sub> | Airgas | CD USP50 | |
| أنابيب مخروطية ، بولي بروبيلين ، 50 مل | فيشر ساينتفيك | 05-539-13 | |
| دومون # 5 ملقط ناعم | أدوات العلوم | الدقيقة 11254-20 | |
| ملعقة جنين | أدوات العلوم | الدقيقة 10370-17 | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 0.5 مل | VWR | 89000-010 | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.5 مل | VWR | 20170-038 | |
| ماصة باستور ، 5.75 " | فيشر Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet ، 9 " | VWR | 14672-380 | |
| أطباق بتري ، 10 سم | أطباق فيشر Scientific | 08-757-100D | |
| بتري ، 35 مم | FB0875711YZ | فيشر Scientific | |
| ، شفافة ، بطانة بولي إيثيلين | فيشر Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF غشاء | فيشر ملقط | IPVH00010 | |
| العلمي Semken | أدوات العلوم الدقيقة | 11008-13 | |
| لمبة لاتكس صغيرة ، 2 مل | VWR | 82024-554 | |
| مقص جراحي | أدوات العلوم الدقيقة | 14002-12 | |
| فلتر حقنة ، 25 مم ، 0.2 مو ؛ م حجم المسام | فيشر Scientific | 09-740-108 | |
| حقنة مع طرف لور ، 10 مل | VWR | BD309604 | |
| نقل ماصة | فيشر Scientific | 13-711-22 | |
| رافعة فتح كاسيت اللطخة الغربية | Bio-Rad | 4560000 | |
| ورق كروماتوغرافيا Whatmann 3MM | chr فيشر ساينتفيك | 05-714-5 | |
| <قوي> الكواشف < / قوي > | |||
| 4-15٪ جل بروتين مسبقة الصب ، 10 بئر ، 30 وميكرو ؛ L | Bio-Rad | 4561083 | |
| & beta ؛ -glycerophosphate ملح ثنائي الصوديوم هيدرات | Sigma Aldrich | G5422-25G | تركيز المخزون 1 |
| M & beta ؛ -mercaptoethanol | Sigma | Aldrich M3148-100ML | |
| ألبومين مصل البقر ، الجزء V ، صدمة حرارية تم | اختبارها فيشر Scientific | BP1600-100 | |
| بروموفينول الأزرق | فيشر Scientific | AC403140050 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز المصغر | الكامل سيجما ألدريتش | 11836153001 | تركيز المخزون 25x |
| DC مجموعة فحص البروتين II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز | Gibco | 11965092 | |
| E7 ، الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة بيتا توبولين ، مركز 0.1 مل | دراسات تنموية بنك الورم الهجين | E7 | 1: 1,000 |
| ركيزة النشاف الغربية ECL | فيشر ساينتفيك | PI32106 | نطاق بيكوغرام منخفض |
| ركيزة النشاف الغربي ECL | Genesee Scientific | 20-302B | نطاق الفيمتوغرام |
| المنخفض عازلة الرحلان الكهربائي ، 5 لتر | Bio-Rad | 1610772 | تركيز المخزون 10x |
| الإيثانول ، 200 دليل ، 1 جالون | مختبرات Decon، Inc. | 2705HC | EtOH |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ، ثنائي الملح ثنائي الملح. (Powd البلوري / الكهربائي.) | فيشر Scientific | BP120-500 | EDTA |
| مصل بقري للجنين ، مميز ، أمريكي الأصل ، 500 مل | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (معتمد من ACS) فيشر | Scientific | G33-4 | |
| الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP ، مختبرات الماعز المضادة للفأر IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1: 20،000 |
| الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP ، الماعز مختبرات IgG Jackson ImmunoResearch المضادة للأرانب | 111-035-003 | 1: 20،000 | |
| محلول حمض الهيدروكلوريك ، 6N (معتمد) | فيشر Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 منظف غير أيوني | فيشر Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) فيشر | Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 تركيز المخزون 200 ملي مولار | |
| ميثانول | فيشر Scientific | A454-4 | |
| p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) تقنية إشارات الخلية للجسم المضاد الأولي | 9102S | 1: 1،000 ؛ الترابط المؤتلف المضاد ل Erk1 / 2 | |
| PDGF-BB ، مستقبلات الفئران | فيشر Scientific | 520BB050 | |
| PDGF & بيتا تقنية إشارات خلية الأجسام المضادة | 3169S | 1: 1,000 | |
| بنسلين ستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | تركيز المخزون 100 وحدة / مل ، 100 وميكرو ؛ جم / مل |
| فلوريد فينيل ميثان سولفونيل ، 99٪ | فيشر ساينتفيك | AC215740100 | PMSF ؛ تركيز المخزون 100 ملي |
| مولار فوسفو-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) تقنية إشارات الخلية للجسم المضاد | الأساسي 9101S | 1: 1،000 ، مستقبلات فوسفو | |
| & ألفا ؛ / مستقبلات PDGF & بيتا ؛ تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة الأولية | 3170S | 1: 1،000 | |
| كلوريد البوتاسيوم (بلورات بيضاء) | فيشر ساينتفيك | BP366-500 | KCl |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (بلورات بيضاء) | فيشر ساينتفيك | BP362-500 | KH2< / sub>PO4< / sub> |
| SDS ، 10٪ | Bio-Rad | 161-0416 | |
| كلوريد الصوديوم (بلوري / بيولوجي ، معتمد) | فيشر Scientific | S671-3 | كلوريد الصوديوم |
| فلوريد الصوديوم (مسحوق / معتمد ACS) فيشر | Scientific | S299-100 | NaF ؛ aliquot للاستخدام لمرة واحدة ؛ تركيز المخزون 1 م من |
| أورثوفانادات الصوديوم ، 99٪ | فيشر ساينتفيك | AC205330500 | Na 3< / sub>VO4< / sub> ؛ تركيز المخزون 100 ملي |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي (حبيبي أو مسحوق / معتمد ACS) فيشر | Scientific | S374-500 | Na2< / sub>HPO4< / sub> |
| زراعة الأنسجة PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| نقل المخزن المؤقت ، 5 لتر | Bio-Rad | 1610771 | تركيز المخزون 10x |
| Tris base (بلورات بيضاء أو مسحوق بلوري / بيولوجيا جزيئية) | فيشر Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| توين 20 | فيشر العلمي | BP337-500 | |
| لطخة غربية علامة الوزن الجزيئي | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software< / strong> | |||
| ImageJ software | المعاهد الوطنية للصحة | ||
| Animals< / strong> | |||
| أنثى الفئران | 129S4 | هدية الدكتور فيليب سوريانو ، كلية إيكان للطب في جبل سيناء |
المراجع
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
