تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة في مستعمرات الشعاب المرجانية للحصول على الإكثار الدقيق الفردي للاستخدام التجريبي المختبري

الشعاب المرجانية Scleractinian أو بناء الشعاب المرجانية هي cnidarians قادرة على تشكيل الهياكل العظمية الكربونية ، وخلق الشعاب المرجانية ، والنظم الإيكولوجية المعقدة هيكليا التي يمكن العثور عليها من بيئات المياه العميقة إلى الضحلة¹. وتستضيف الشعاب المرجانية المدارية تنوعا بيولوجيا عاليا وتوفر خدمات أساسية للنظم الإيكولوجية، مثل حماية السواحل وصيانة مصائد الأسماك². تعتمد معظم الشعاب المرجانية التي تبني الشعاب المرجانية في المياه الضحلة على علاقة متبادلة مع الطحالب من عائلة Symbiodiniaceae ، والتي توفر الطاقة التي تحتاجها الشعاب المرجانية لبناء هياكلها العظمية. يمكن كسر التكافل بين المرجان والطحالب بسبب الإجهاد البيئي ، مما يتسبب في ابيضاض المرجان³،^4،5،6. تسببت حالات الشذوذ الأخيرة في درجات الحرارة في أحداث ابيضاض المرجان الرئيسية في جميع أنحاء العالم ، مما أدى إلى وفيات الشعاب المرجانية الجماعية وتدهور الشعاب المرجانية الدائم⁷،⁸،⁹،^10،11. نظرا لأن هذه الظاهرة تعتمد على طرد المتكافلات بواسطة الآليات الخلوية المرتبطة بالإجهاد الحراري بعد الإجهاد الحراري ، مثل موت الخلايا المبرمج ، والالتهام الذاتي ، والإفرازات الخارجية ، يمكن وصف ابيضاض المرجان بأنه عملية خلوية لها عواقب على نطاق النظام البيئي ^5,6,12 ، مما يعني أن وجود مزارع في المختبر للخلايا أو الأنسجة المرجانية سيكون قابلا للتطبيق لدراسة هذه الظاهرة عن كثب.

نظرا لأهمية الشعاب المرجانية والتهديدات الرئيسية التي تواجهها ، لا سيما في العقدين الماضيين² ، أصبحت الشعاب المرجانية محور البحث لأغراض الحماية والترميم في جميع أنحاء العالم¹³. ومع ذلك ، فإن تطوير مناهج وأنظمة تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار وتوفر الحد الأدنى من التأثير البيئي لدراسة الشعاب المرجانية هو صراع كبير في هذا المجال.

يعرف التكاثر الدقيق بأنه الانتشار المختبري للنمط الوراثي للكائن الحي عن طريق زراعة مواده البيولوجية في الأوعية الخاضعة للرقابة^14,15. كانت زراعة الخلايا والأنسجة والأعضاء أمرا بالغ الأهمية لبيولوجيا النبات والحيوان على مدى العقود الأخيرة. يسمح بالتكاثر الجماعي للكائنات الحية في المختبرات ، والتقييم السريع للعلاجات المختلفة (مثل الأدوية والمستحضرات الصيدلانية) ، والدراسة المباشرة لوظيفة الخلية¹⁴،¹⁵،^16،17. بشكل عام ، كانت النماذج في المختبر مفيدة لاستكمال وتعميق دراسات الكائنات الحية المختلفة في ظل ظروف فيزيائية وكيميائية أفضل سيطرة. نظرا لمزايا تقنيات الاستزراع في المختبر ، تم تطوير تقنيات زراعة الخلايا والأنسجة الحيوانية المختلفة وتحسينها واستخدامها كأدوات مهمة في العديد من المجالات البحثية ، حيث تمت دراسة خطوط خلايا متعددة وتسويقها للعديد من التطبيقات¹⁶،^17،18.

تم إحراز العديد من التطورات في معرفة زراعة الخلايا والأنسجة منذ أول زراعة للأنسجة الحيوانية في عام 1882 17 ، مثل استخدام الوسائط الطبيعية والاصطناعية ، واختراع خطوط الخلايا الثابتة ، وتطوير وسائط ثلاثية الأبعاد لزراعة العديد من أنواع الخلايا بطريقة أفضل^{16,17 ، 18,19}. ومع ذلك ، فقد ركز مجال بيولوجيا الخلية في الغالب على مجموعة مختارة من الكائنات الحية النموذجية ، في حين أن العديد من الأصناف لا تزال تفتقر إلى ثقافات راسخة في المختبر من الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء²⁰. على سبيل المثال ، في أبحاث الشعاب المرجانية ، لم يتم استخدام خطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع للبحث ، مما يقيد أبحاث الخلايا المرجانية باستخدام مزارع الخلايا الأولية. تقتصر صلاحية هذه الثقافات على بضعة أسابيع 21 ، مع عدم وجود دراسات تسجل بقاء الخلايا الفردية من جميع الأنسجة المرجانية لأكثر من 13 يوما حتى بداية عام^{2021 22}. كان أول تقرير عن خطوط الخلايا المرجانية المستدامة التي سيتم نشرها مع خلايا Acropora tenuis التي عاشت ما يصل إلى 6 أشهر ، ولا يزال يتعين استكشاف فائدة هذه الخلايا للبحوث المستقبلية²³.

للتغلب على القيود المفروضة على زراعة مزارع الخلايا المرجانية والحفاظ على ثقافة مختبرية تحافظ على التنظيم العام للأنسجة من الشعاب المرجانية ، تم اقتراح استخدام الاورام الحميدة المعزولة مؤخرا كنموذج لأبحاث البيولوجيا المرجانية^24,25. الاورام الحميدة هي الوحدات التشريحية للشعاب المرجانية ، ولكل منها فم يقع في وسط قرصها الفموي ويرتبط بالاورام الحميدة الأخرى بواسطة coenosarc في منطقته الفموية²⁶. يحدث فصل الاورام الحميدة الحية بشكل طبيعي عن طريق عملية إنقاذ الاورام الحميدة ، حيث يتسبب الإجهاد الحاد في هضم الكوينوسارك بين الاورام الحميدة ، والتي يمكن أن تنفصل بعد ذلك عن الهيكل العظمي للمستعمرة²⁵،^27،28. تم الإبلاغ عن حدوث هذه الظاهرة في مجموعة متنوعة من الأصناف ، بما في ذلك الشعاب المرجانية الثماني 29،^30،31 ، والشعاب المرجانية السوداء 32 ، والشعاب المرجانية الصلبة 25،27،28،32،³³ ، وتم ربطها بضغوط بيئية متعددة ، مثل نقص الكالسيوم في الماء ²⁴،³⁴ ، وزيادة الحموضة ^{35 ،} ظروف فرط التناضح 25،27،32،36 ، ودرجات الحرارة المرتفعة 36،37 ، والمجاعة 33 ، والتعرض للهواء 25،³⁰ ، والتلوث بالمبيدات الحشرية ^28،38. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن إنقاذ الاورام الحميدة في الشعاب المرجانية pocilloporid¹⁹ ، والتي يتم توزيعها على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم وتستخدم عادة كنماذج في أبحاث الشعاب المرجانية. الأنواع التي تنتمي إلى هذه المجموعة ، مثل Pocillopora damicornis و Styllophora pistillata ، ولدت ما يقرب من 30-40 ميكروبروبيجا من جزء^{5 مم 25}. يؤكد هذا الرقم على ميزة استخدام إنقاذ الاورام الحميدة كوسيلة للتكاثر الدقيق للشعاب المرجانية ، لأنه يخلق إمكانية توليد العديد من الأفراد المتطابقين وراثيا من قطعة صغيرة من الشعاب المرجانية. كما أن استخدام الاورام الحميدة المعزولة للبحث له نفس مزايا مزارع الخلايا فيما يتعلق بإمكانية استزراعها في بيئات مختبرية خاضعة للرقابة ، مثل القوارير والأطباق البيتروتينية. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت منصات الموائع الدقيقة للحفاظ على الاورام الحميدة الحية أنه يمكن الاحتفاظ بهذه التكاثرات الدقيقة في بيئات رخيصة نسبيا وسهلة التكاثر ، مع التحكم في تدفق المياه والسطح ودرجة الحرارة^24,25. يمكن أيضا استخدام منصات الموائع الدقيقة هذه لتصور الهياكل المرجانية الحية تحت المجهر مباشرة^24,25.

في هذه المقالة ، نلخص ونوضح التقنيات التي تم تطويرها لعزل الاورام الحميدة المرجانية الفردية من مستعمراتها ، موضحا كيفية الحفاظ عليها في ظروف المختبر للزراعة طويلة الأجل. وتشمل الطرق التي نوقشت إنقاذ الاورام الحميدة من خلال ظروف فرط التناضح عن طريق التبخر وضخ مياه البحر عالية الملوحة والحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم.

بالنسبة لهذه الدراسة ، تم جمع مستعمرة تنتمي إلى أنواع الشعاب المرجانية Pocillopora verrucosa من شعاب الفحل المرجانية (22.305118 N ؛ 38.964568 E) بواسطة الغوص باستخدام مطرقة وإزميل. تم تحديد جنس المستعمرة من الناحية المورفولوجية ، وتم تصنيف أنواعها على أنها P. verrucosa بناء على أعمال منشورة سابقا ، بما في ذلك Pocillopora من البحر الأحمر ، مما يشير إلى أنه ، من وجهة نظر وراثية ، فإن الأنواع الموجودة في هذه المنطقة هي P. verrucosa^39,40. الشعاب المرجانية الفحل ليست جزءا من منطقة بيئية محمية، ولم تكن هناك حاجة إلى تصاريح خاصة لجمع الشعاب المرجانية. تم الاحتفاظ بالمستعمرة في حوض سمك سعة 300 لتر لمدة شهر قبل أن يتم تفتيتها و "إنقاذ" الاورام الحميدة الخاصة بها. تم الاحتفاظ بالحوض عند 26 درجة مئوية مع اثنين من سخانات الحوض ، وثلاث مضخات ، ومصدرين للضوء (انظر جدول المواد) ، مع الحفاظ على دورة ضوء 12 ساعة. تم الحفاظ على درجة حرارة الحوض عن طريق توصيل كل واحد من السخانين بوحدة تحكم في درجة الحرارة. تمت برمجة انبعاث الضوء ليبدأ في الساعة 6 صباحا وينتهي في الساعة 6 مساء ، مما ينتج منحنى إشعاع بلغ ذروته في الساعة 12 مساء مع فوتونات 230 ميكرومول m−²s⁻¹.

1. إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق الملوحة العالية بعد تبخر الماء

ملاحظة: تم اقتباس هذه الطريقة من Shapiro et ^al.25. إذا كنت تستخدم أنواعا مختلفة عن Pocillopora verrucosa ، فيجب مراعاة حجم الاورام الحميدة قبل تحديد حجم الجزء المراد قطعه.

1. قطع شظايا صغيرة (أقل من 1 سم في الطول) من مستعمرة المرجان باستخدام كماشة قطع قطرية (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: قم بتكييف أدوات القطع وفقا لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة. الكماشة القطرية مفيدة لقطع الشعاب المرجانية ذات الفروع الرفيعة. في الدراسة الحالية ، تم قطع جزء واحد لكل علاج ، ولكن يمكن أن يختلف عدد وحجم الشظايا اعتمادا على عدد الاورام الحميدة المطلوبة. يجب ألا يتجاوز حجم الشظايا المقطوعة عمق الماء بعد التبخر ، لذلك تبقى الشعاب المرجانية داخل الماء تماما بعد الانتهاء من العملية.
2. ضع الشظايا المقطوعة في أطباق بتري صغيرة مليئة ب 12 مل من مياه البحر التي تأقلمت معها مستعمرة المرجان. يمكن أن يكون هذا مياه البحر الاصطناعية (انظر جدول المواد) أو مياه البحر المصفاة بنفس الملوحة التي تم إدخال مستعمرة المرجان فيها قبل التفتيت.
   ملاحظة: من المهم تغطية الجزء بالكامل بالماء. إذا لم يكن 12 مل في طبق بتري كافيا لتغطية الجزء المقطوع ، فقم بتحسين الحاوية والحجم وفقا لذلك. في هذه الدراسة ، تم جمع المياه المستخدمة من البحر الأحمر ، وكانت ملوحتها 40 PSU ، مقاسة بمقياس متعدد المعلمات (انظر جدول المواد).
3. اترك اللوحة مفتوحة لمدة 24 ساعة تقريبا في درجة الحرارة المحيطة بحيث يمكن أن يتبخر الماء ويمكن أن تزداد ملوحته تدريجيا. عندما يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة ، انتقل إلى الخطوة 1.4.
   ملاحظة: بعد مرور وقت الحضانة ، يجب أن تكون ملوحة الماء أعلى بنسبة 40٪ تقريبا مما كانت عليه في البداية ، ويجب أن تكون الاورام الحميدة جاهزة للفصل عن الهيكل العظمي.
4. باستخدام ماصة نقل 1 مل ، قم بإنشاء تدفق لطيف بالقرب من الأنسجة المرجانية. سيساعد التدفق ببطء على الانفصال الكامل للأورام الحميدة التي هضمت بالفعل الأنسجة المحيطة بها من الهيكل العظمي.
   ملاحظة: عندما يتم إنشاء تدفق المياه باستخدام الماصة ، يجب أن تخرج الاورام الحميدة المنفصلة أو مجموعات من الاورام الحميدة من الهيكل العظمي كرقائق. إذا خرجت مادة غائمة بدلا من ذلك ، فإنها تشير إلى موت الأنسجة أو تفككها ، مما يعني أن الشعاب المرجانية قد تم احتضانها لفترة طويلة جدا أو في حالة مرهقة للغاية (في هذه الحالة ، ملوحة عالية). من المهم جدا إجراء تدفق لطيف للمياه لفصل الاورام الحميدة ، لأن التدفق الأقوى قد يسبب أضرارا مادية لها.
5. استبدل الماء ببطء في طبق بتري بالماء متساوي السموتيك (استخدم نفس الماء كما في الخطوة 1.2) باستخدام ماصة. يكفي تبادل المياه بنسبة 50٪ على مدار 10 دقائق للتأقلم مع الاورام الحميدة مرة أخرى إلى حالة الملوحة غير المجهدة.
   ملاحظة: مع استخدام مستعمرات المرجان من الأنواع pocilloporid Pocillopora verrucosa من البحر الأحمر ، أجريت اختبارات لتحديد الظروف المحددة التي سيتم فيها إنقاذ الشعاب المرجانية من هذه البيئة الفريدة. من المهم تسليط الضوء على الملوحة العالية للبحر الأحمر بالمقارنة مع معظم بيئات الشعاب المرجانية الأخرى.

2. إنقاذ الاورام الحميدة من خلال إمدادات مياه البحر عالية الملوحة

ملاحظة: تم اقتباس هذه الطريقة من Chuang et ^al.27.

1. تحضير 3 لتر من مياه البحر عالية الملوحة عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر حتى تزداد الملوحة بنسبة 85٪ ، تقاس بواسطة مسبار الملوحة.
   ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم تحضير 74 من مياه البحر عالية الملوحة من 40 PSU من مياه البحر الأحمر.
2. قطع شظايا صغيرة من المرجان كما هو موضح في الخطوة 1.1.
3. ضع الشظايا المقطوعة في حاوية سعة 10 لترات مملوءة ب 3 لترات من مياه البحر متساوي السمنة (في هذه الحالة ، مياه البحر ذات الملوحة غير المجهدة للشعاب المرجانية ، وهي نفسها المستخدمة في الخطوة 1.2) متصلة بمضخة تمعجية (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: للحفاظ على صحة الشعاب المرجانية بشكل أفضل ، يمكن إضافة وحدات التحكم في درجة الحرارة ومضخات الهواء والأضواء لمحاكاة نفس ظروف الحوض التي تعرضت لها المستعمرة سابقا. خلال الحضانة في العمل الحالي ، تم الاحتفاظ بشظايا الشعاب المرجانية في حاويات عند 26 درجة مئوية ، تحت دورة ضوء يومية مدتها 12 ساعة. تم الحفاظ على حركة المياه وتجانس درجة الحرارة بواسطة مضخات الهواء.
4. املأ الحاوية التي تحتوي على شظايا المرجان بمياه البحر عالية الملوحة المحضرة في الخطوة 2.1 باستخدام المضخة التمعجية لمدة 24 ساعة بمعدل 126 مل / ساعة. أضف ما مجموعه 3 لتر من الماء عند زيادة الملوحة بنسبة 40٪ تقريبا.
   ملاحظة: يمكن إنتاج المياه عالية الملوحة ببساطة عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر حتى تصل إلى الملوحة المقصودة.
5. قم بإنشاء تدفق مياه لطيف باستخدام ماصة لإطلاق الاورام الحميدة من الهيكل العظمي (الخطوة 1.4).
6. تبادل ببطء الماء الذي تحتوي عليه الاورام الحميدة للمياه متساوي السمية (الخطوة 1.5). بعد ذلك ، انتقل إلى الخطوة 4 أو الخطوة 5.

3. إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم

ملاحظة: تم تكييف هذه الطريقة من Pang et ^al.24.

1. تحضير محلول مياه البحر الاصطناعية الخالية من الكالسيوم (CaFSW) بإضافة 26.29 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.872 جم من KCl ، و 2.16 جم من MgSO 4 ، و 11.94 جم من MgCl 2 ، و 3.42 جم من Na₂ SO₄ ، و 0.286 جم من NaHCO₃ (انظر جدول المواد) إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
   ملاحظة: تم تعديل هذا الحل من البروتوكولات السابقة ليكون أكثر ملاءمة للشعاب المرجانية التي تتكيف مع ملوحة 40 PSU. بالنسبة للشعاب المرجانية التي تتكيف مع ظروف الملوحة الأخرى ، استخدم نفس النسبة من الأملاح ولكن اضبط الكتلة الكلية للمذابات للحصول على الملوحة الأكثر ملاءمة للشعاب المرجانية المستخدمة.
2. قطع شظايا صغيرة من الشعاب المرجانية كما هو موضح في الخطوة 1.1.
3. غمر شظايا الشعاب المرجانية في أطباق بتري المملوءة ب CaFSW المعدة مسبقا (الخطوة 3.1) واحتضنها في حاضنات مدارية بسرعة دوران 80 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات.
   ملاحظة: مرة أخرى ، من المهم تغطية الجزء بالكامل بالماء. إذا لم يكن طبق بتري كافيا لتغطية الجزء ، فقم بتحسين الحاوية والحجم وفقا للحاجة التجريبية.
4. انقل الشظايا إلى أطباق بتري أو أطباق من 6 آبار مملوءة ب 20٪ من وسائط النسر المعدلة من دولبيكو (DMEM) و 100 مجم / مل من محلول الأمبيسلين (انظر جدول المواد) المحضر بمياه البحر الاصطناعية 40 PSU. احتضن الشظايا عند 26 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة ، وتبادل الوسائط كل يوم حتى يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة وتبدأ الاورام الحميدة الفردية في الانفصال عن الهيكل العظمي.
   ملاحظة: في معظم الحالات ، يكتمل هضم الأنسجة في غضون 20 ساعة من الحضانة في هذه الوسائط ، ولا يلزم إجراء تبادلات.
5. انقل الاورام الحميدة إلى مياه البحر المعقمة للاسترداد الأولي باستخدام ماصة. بعد 1 ساعة من الحضانة ، انتقل إلى الخطوة 4 أو الخطوة 5.

4. صيانة الاورام الحميدة في أطباق بتري

1. بمجرد عودة الاورام الحميدة إلى مياه البحر المصفاة ذات الملوحة غير المجهدة ، حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة من خلال مراقبة سلامة الأنسجة وحركتها الناجمة عن التدفق الهدبي تحت المجهر المجسم.
2. ضع الاورام الحميدة المختارة في طبق بتري زجاجي أو بلاستيكي وقم بتغطية طبق بتري بشبكة عوالق (حجم شبكة 200 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) حتى لا تطفو الاورام الحميدة بعيدا عن الطبق.
   ملاحظة: يمكن أن يختلف حجم الشبكة الشبكية وفقا لحجم الاورام الحميدة. من المهم ملاحظة أن الشباك يجب أن تحتوي على مسام أصغر من الاورام الحميدة وتسمح بتبادل المياه واختراق الضوء.
3. ضع طبق بتري داخل حوض السمك مع الظروف المناسبة لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، كانت الظروف 40 مياه بحر مفلترة من جامعة الأمير سلطان عند 26 درجة مئوية ودورة ضوء 12 ساعة.
4. افتح أطباق بتري مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتجديد المياه وتنظيف الأطباق. هذه الخطوة مهمة للقضاء على فرط نمو الطحالب التي يمكن أن تتنافس مع الاورام الحميدة المرجانية أو تتلفها عن طريق إطلاق مركبات سامة محليا.

5. صيانة الاورام الحميدة في الحاضنات

1. حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة كما هو موضح في الخطوة 4.1.
2. ضع الاورام الحميدة في قوارير خلية سطحية 75 سم² مملوءة ب 50 مل من مياه البحر متساوي السمنة باستخدام ماصات النقل.
   ملاحظة: في العمل الحالي ، تم استخدام مياه البحر المصفاة التي تم جمعها من البحر الأحمر لصيانة الاورام الحميدة. يمكن استخدام المياه ذات الخصائص نفسها المستخدمة في الخطوة 1.2.
3. أغلق القوارير وانقلها إلى الحاضنات. اضبط الحاضنات على دورات إضاءة لمدة 12 ساعة عند 26 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. تبادل 50٪ من حجم المياه كل 4 أيام ونقل المحتوى إلى قوارير نظيفة عندما / إذا كانت مليئة بالطحالب أو البيوفيلم على الجدران.
   ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام نظام تكبير/تصغير كامل اللون مجهز بكاميرا عالية الدقة (انظر جدول المواد) للحصول على النتائج التمثيلية.

تم تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة في شظايا المرجان التي تنتمي إلى مستعمرة واحدة من النوع P. verrucosa باتباع ثلاث طرق مختلفة (الشكل 1). اكتملت عملية الإنقاذ الناجمة عن ارتفاع الملوحة بعد تبخر الماء بعد 24 ساعة من حضانة شظايا المرجان في أطباق بتري في درجة حرارة محيطة مملوءة بالماء في البداية عند 40 وحدة نفط صينية ، والتي وصلت بعد ذلك إلى ملوحة نهائية تبلغ 59 وحدة نفط صينية بمجرد انتهاء العملية (الشكل 2A-C ، I). كما تم التوصل إلى الإنقاذ عن طريق إمدادات المياه المالحة بعد 24 ساعة من حضانة المياه في البداية عند 40 PSU التي وصلت إلى ملوحة 52 PSU بعد 12 ساعة و 59 PSU في نهاية العملية ، بعد 24 ساعة (الشكل 2D-F ، I). في كلتا التجربتين ، كانت الزيادة في الملوحة مسؤولة عن تحريض هضم الأنسجة بواسطة الاورام الحميدة. بعد 12 ساعة ، تسببت حالة الملوحة العالية في تقلص الاورام الحميدة بالتزامن مع التخفيف التدريجي لل coenosarc ، مما تسبب في النهاية في الانفصال النهائي للأورام الحميدة بعد 24 ساعة. اكتمل تحريض الإنقاذ من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم بعد حضانة 3h في CaFSW تليها حضانة 20h في وسائط DMEM 20٪ (الشكل 2G-H). تم فصل النسيج عن الهيكل العظمي في جميع الطرق الثلاث بعد دفعه بعيدا باستخدام ماصة حتى تم إنشاء الاورام الحميدة المرجانية الفردية (الشكل 3A-C) و "كرات الأنسجة".

بعد الانفصال ، تم جمع الاورام الحميدة من جميع الطرق الثلاث والسماح لها بالتعافي في مياه البحر قبل تخصيصها لأطباق بتري المغطاة بالشباك أو قوارير الخلايا. تم الحفاظ على الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من التبخر وطرق إمدادات المياه في أطباق بتري داخل أحواض السمك وبقيت على قيد الحياة لمدة 6 أسابيع و 8 أسابيع ، على التوالي (الشكل 3D والشكل 3F). احتفظت هذه الميكروبروبيات بالتشريح المعتاد للأورام الحميدة ، حيث قدمت مخالب وأقراص قاعدية وأفواه1. الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم كان لها عمر افتراضي قصير ، على قيد الحياة تصل إلى 1 يوم ، وبعد ذلك انفصلت أنسجتها. الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طريقة تبخر مياه البحر المحفوظة في قوارير زراعة الخلايا داخل الحاضنات بقيت على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أسابيع دون تفكك الأنسجة (الشكل 3F). في جميع الحالات ، على الرغم من أن الاورام الحميدة لم تستطع الالتصاق بالركيزة ، إلا أنها كانت صحية بصريا وحافظت على لونها ، مع استمرار ظهور خلايا zooxanthellae داخل أنسجتها1.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للمنهجيات الثلاث المختلفة التي تم اختبارها لتحريض إنقاذ الاورام الحميدة (يسار) متبوعا بتوضيح طريقتين للحفاظ على الاورام الحميدة المكتسبة في ظروف المختبر (يمين). (أ) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق تبخر الماء. (ب) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. (ج) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة بواسطة حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور لعملية إنقاذ الاورام الحميدة الناجمة عن ثلاث منهجيات مختلفة باستخدام شظايا من الأنواع المرجانية P. verrucosa. (أ-ج) شظية مرجانية في 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة بعد الحضانة ، على التوالي ، في طبق بتري باستخدام طريقة تبخر الماء. (مد إلى واو) شظية مرجانية في 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة بعد الحضانة ، على التوالي ، باستخدام طريقة إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. (ز، ح) شظايا المرجان المعرضة لطريقة حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم قبل وبعد ، على التوالي. كانت الحضانات في مياه البحر الاصطناعية الخالية من الكالسيوم لمدة 3 ساعات وفي 20٪ DMEM لمدة 21 ساعة. (I) تمثيل بياني لقيم الملوحة في PSU لمياه البحر بمرور الوقت أثناء تبخر المياه وطرق تحريض إنقاذ إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور الاورام الحميدة P. verrucosa التي تم الحصول عليها من إجراءات تحريض الإنقاذ الثلاثة المثبتة. (A-C) تم التقاط صور الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طرق التبخر وإمدادات المياه المالحة ومياه البحر الخالية من الكالسيوم ، على التوالي ، فور فصلها عن الهيكل العظمي. (د) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة التبخر بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 6 أسابيع في طبق بتري. (ه) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة إمدادات المياه المالحة بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 8 أسابيع في طبق بتري. (و) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة التبخر بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 3 أسابيع في قارورة زراعة الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.