مقالة منهجية

تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلوري

3.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63846

⸱

أبريل 20, 2022

 ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Metabolism & Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University

في هذه المقالة

ملخص

نصف هنا استخدام مجموعة من علامات العضيات القائمة على البروتين الفلوري في تصوير الخلايا الحية للخميرة الناشئة ، خميرة الخميرة.

الملخص

الخميرة الناشئة ، خميرة الخميرة ، هي نظام نموذجي كلاسيكي في دراسة وظيفة العضية وديناميكياتها. في أعمالنا السابقة ، قمنا ببناء علامات قائمة على البروتين الفلوري للعضيات الرئيسية وهياكل الأغشية الداخلية ، بما في ذلك النواة ، والشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وجهاز جولجي ، والجسيمات الداخلية ، والفجوات ، والميتوكوندريا ، والبيروكسيسومات ، وقطرات الدهون ، والبلعمة الذاتية. يصف البروتوكول المقدم هنا إجراءات استخدام هذه العلامات في الخميرة ، بما في ذلك تحضير الحمض النووي لتحويل الخميرة ، واختيار وتقييم المحولات ، والمراقبة المجهرية الفلورية ، والنتائج المتوقعة. النص موجه نحو الباحثين الذين يدخلون مجال دراسة عضيات الخميرة من خلفيات أخرى. يتم تغطية الخطوات الأساسية ، بالإضافة إلى الملاحظات الفنية حول اعتبارات أجهزة المجهر والعديد من المزالق الشائعة. يوفر نقطة انطلاق للأشخاص لمراقبة الكيانات الخلوية الفرعية للخميرة عن طريق الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. يمكن استخدام هذه الأدوات والأساليب لتحديد توطين البروتين تحت الخلايا وتتبع العضيات ذات الأهمية في التصوير بفاصل زمني.

المقدمة

يعد التقسيم تحت الخلوي إلى عضيات مرتبطة بالغشاء مبدأ شائعا في تنظيم الخلايا حقيقية النواة. كل عضية تؤدي وظائف محددة. كما هو الحال في العديد من الجوانب الأخرى لعلم الأحياء حقيقيات النواة ، كانت الخميرة الناشئة ، خميرة الخميرة ، نظاما نموذجيا كلاسيكيا في توضيح المبادئ الأساسية لتنظيم العضيات وديناميكياتها. تشمل الأمثلة الاكتشافات المنوية في مسار إفراز البروتين ، ومسار استيراد البروتين البيروكسيزومي ، ومسار الالتهام الذاتي1،2،3.

في الظروف النموذجية الغنية بالمغذيات ، تحتوي خلايا الخميرة سريعة النمو على الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وجولجي المبكرة ، والجسيمات الداخلية المتأخرة / المبكرة جولجي ، والجسيمات الداخلية المتأخرة ، والفجوات ، والميتوكوندريا. توجد أيضا بعض البيروكسيسومات ، وقطرات الدهون ، والبلعمة الذاتية (حتى أقل من الأولين ، بشكل أساسي من نوع الحويصلة Cvt ، والتي توجد في ظروف غنية بالمغذيات4) ، ولكنها ليست بارزة كما ستكون في ظل ظروف استزراع محددة (الوسائط الغنية بالدهون ، وسائط الجوع ، إلخ). بالمقارنة مع النماذج حقيقية النواة الشائعة الأخرى ، فإن خلايا الخميرة صغيرة جدا. يبلغ قطر خلية الخميرة النموذجية حوالي 5 ميكرومتر ، مقارنة بعشرات الميكرومترات لمعظم الخلايا الحيوانية والنباتية. نتيجة لذلك ، في نفس مجال التصوير الذي يحتوي عادة على خلية حيوانية واحدة ملتصقة ، يرى المرء عادة عشرات خلايا الخميرة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. إلى جانب اختلاف الحجم ، يحتوي مورفولوجيا عضية الخميرة أيضا على بعض الميزات الغريبة. على مستوى البنية التحتية ، تتكون ER الخميرة من صفائح وأنابيب ، كما هو الحال في الأنظمة الأخرى. تحت الفحص المجهري الفلوري ، تظهر ER الخميرة على شكل حلقتين مع بعض الهياكل المترابطة بينهما. الحلقة الداخلية هي ER النووي ، وهو مستمر مع الغلاف النووي ، والحلقة الخارجية هي ER المحيطي ، وهي شبكة أنبوبية تقع تحت غشاء البلازما5. على غرار الخلايا النباتية ولكنها تختلف عن الخلايا الحيوانية ، توجد عضية هجينة ، متأخرة جولجي / الجسيم الداخلي المبكر ، عند التقاطع بين المسار الإفرازي والمسار الداخلي6،7. من الناحية الشكلية ، تنتشر أجهزة خميرة جولجي في السيتوبلازم. تشبه الفجوات وظيفيا الجسيمات الحالة في الخلايا الحيوانية. غالبا ما تشغل أجزاء كبيرة من السيتوبلازم وتخضع للانشطار والاندماج المتكرر. إلى جانب استخدام علامات التموضع الفلوري ، يمكن تمييز الغشاء الفراغي عن ER النووي من خلال معيارين على الأقل: يكون الغشاء الفراغي بشكل عام أكثر تقريبا من ER النووي ، كما أن المظهر المتزاوج للفجوة في DIC يكون أيضا أكثر وضوحا من النواة.

بشكل روتيني ، نستخدم مجموعة من العلامات القائمة على البروتين الفلوري لتصور العضيات المذكورة أعلاه في خلايا الخميرة الحية (الجدول 1). تم التحقق من دقة ووظائف علامات العضيات هذه تجريبيا7،8. تهدف تركيبات العلامات هذه إلى إدخال أشرطة كيميرا البروتين الفلوري في جينوم الخميرة. كما هو موضح أدناه ، استعدادا لتحويل الخميرة ، يتم إنشاء شظايا الحمض النووي الخطية إما عن طريق الهضم الأنزيمي أو تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل7،8. يتم دمج شظايا الحمض النووي الخطية في الجينوم عن طريق إعادة التركيب المتماثل. بالنسبة للبلازميدات الموضحة في هذا البروتوكول ، يتم استخدام ثلاثة أنواع من التصميم. في النوع الأول ، الذي يغطي غالبية البلازميدات ، غالبا ما يكون من الممكن الحصول على محولات تحمل نسخا متعددة من البناء. عادة ما يكون هذا غير مرغوب فيه لأنه يقدم اختلافات تعبيرية وربما وظيفية عبر المحولات. يجب تحديد المحولات أحادية النسخة من خلال التصوير كما هو موضح في هذا البروتوكول ، عن طريق النشاف المناعي أو عن طريق اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل المصممة بعناية. في النوع الثاني ، الذي يغطي GFP-Sed5 و GFP-Pep12 و GFP-Atg8 ، يتم إنتاج تكامل نسخة واحدة فقط في خلايا الخميرة أحادية الصيغة الصبغية. يحافظ كل من النوع الأول والنوع الثاني على النسخة الداخلية من جين العلامة سليمة في الجينوم. يهدف النوع الثالث من تصميم البلازميد ، الذي يغطي Sec7-2GFP و Vph1-2GFP ، إلى إدخال ضربات C-terminal ، مما يؤدي إلى أن تكون الوهم هي النسخة الوحيدة من جين العلامة المقابل.

نصف هنا إجراء استخدام علامات العضيات هذه ، ونقدم صورا مجهرية نموذجية ، ونناقش الاحتياطات الموجهة نحو الباحثين الجدد في تصوير عضيات الخميرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بناء سلالة الخميرة

  1. الحصول على بلازميدات علامة وسلالة خميرة مناسبة.
    ملاحظة: البلازميدات متوفرة من Addgene. يستخدم هذا البروتوكول TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ :: LEU2) ، BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) ، و DJ03 (BY4741 trp1Δ :: MET15) كأمثلة. أحد الاعتبارات المهمة لاختيار السلالة ، بخلاف طبيعة السؤال العلمي ، هو توافق علامات الاختيار. تستخدم بلازميدات علامة العضية الموصوفة هنا URA3 و TRP1 كعلامات اختيار. لذلك ، يجب أن يكون النمط الجيني للسلالة المتلقية ura3 و trp1. خلاف ذلك ، يحتاج المرء إلى تعديل السلالة أو البلازميدات.
  2. تحضير وسائط الخميرة حسب الوصفات التالية.
    ملاحظة: SMD (سكر العنب الاصطناعي الحد الأدنى ؛ 2٪ جلوكوز ، 0.67٪ قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) بدون أحماض أمينية ، 30 مجم / لتر أدينين ، 30 مجم / لتر ليسين ، 30 مجم / لتر ميثيونين ، 20 مجم / لتر هيستيدين ، 20 مجم / لتر يوراسيل ، 50 مجم / لتر من التربتوفان ، 50 مجم / لتر ليوسين). SMD + CA (SMD مع إضافة 0.5٪ أحماض الكازامين). YPD (مستخلص الخميرة ببتون سكر العنب ؛ 1٪ مستخلص الخميرة ، 2٪ بيبتون ، 2٪ جلوكوز). SD-N (سكر العنب الاصطناعي بدون نيتروجين ؛ 0.17٪ YNB بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم ، 2٪ جلوكوز). يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة للاطلاع على النظر في اختيار الوسيط.
  3. قبل خطوة التحويل ، قم بإنشاء شظايا الحمض النووي الخطية عن طريق الهضم الأنزيمي أو تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لبلازميد علامة العضية.
    ملاحظة: يسرد الجدول 1 مواقع إنزيم التقييد وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد شظايا خطية من بلازميدات علامة العضية.
  4. زراعة خلايا الخميرة في وسط YPD السائل وتحويل الخميرة بجزء من الحمض النووي الخطي.
    ملاحظة: يمكن إجراء تحويل الخميرة باستخدام الطريقة التقليدية القائمة علىLiAc 9 أو طرق أخرى من اختيارها. ينصح بتضمين عناصر تحكم مناسبة للتحويل ، على وجه الخصوص ، تحكم سلبي بدون بلازميد أو حمض نووي مشتق من البلازميد.
  5. احتضن على لوحة اختيار مناسبة (على سبيل المثال ، لاختيار URA3 ، استخدم وسيط SMD-Ura) عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    ملاحظة: يستغرق ظهور مستعمرات فردية حوالي يومين.
  6. للتحقق من تعبير الوهم الفلوري ورقم نسخة التكامل ، اختر ثماني مستعمرات من لوحة الاختيار ، وأعد خطها على لوحات الاختيار الجديدة ، واحتضن عند 30 درجة مئوية.

2. الفحص المجهري الفلوري: الإجراءات العامة والتصوير أحادي النقطة الزمنية

  1. زراعة خلايا الخميرة بين عشية وضحاها في وسط سائل SMD عند 30 درجة مئوية مع الرج.
  2. في صباح اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة البصرية لثقافة الخميرة عند 600 نانومتر (يشار إليها فيما يلي باسم OD600) في مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الألواح.
    ملاحظة: مع بعض الممارسة على تلقيح الخميرة ، يمكن للمرء عادة التأكد من أن OD600 من جميع العينات أقل من 2 في هذه المرحلة. إذا انتهى الأمر أعلى ، فمن المستحسن تخفيف المزيد في الخطوة التالية وإتاحة المزيد من الوقت لخلايا الخميرة للتعافي.
  3. خفف استزراع الخميرة إلى حوالي 0.2 OD600 باستخدام وسط جديد.
  4. استمر في الاستزراع حتى يصل OD600 إلى حوالي 0.8-1.0.
    ملاحظة: وقت مضاعفة الخميرة حوالي 1.5-2 ساعة.
  5. ضع غطاء زجاجي فوق المناديل الورقية على سطح مستو ، وانشر 5 ميكرولتر من 1 مجم / مل كونكانافالين أ على الجانب العلوي من زجاج الغطاء ، وانتظر لمدة 5 دقائق (الشكل 1 أ) 10.
    ملاحظة: يمكن القيام بخطوة التحضير هذه في وقت مبكر.
  6. انقل 100 ميكرولتر من ثقافة الخميرة إلى الجانب العلوي من زجاج الغطاء ، وانتظر لمدة 5 دقائق.
  7. اجمع بين زجاج الغطاء وشريحة زجاجية داعمة ، مع وجود خلايا الخميرة بينهما ؛ اضغط بالقوة المناسبة لتأمين المرفق.
    ملاحظة: يتطلب الأمر بعض الممارسة للعثور على الضغط المناسب ، بحيث تشكل خلايا الخميرة طبقة واحدة غير متحركة ولكن لا يتم سحقها (الشكل 1 ب). سيتم دفع الوسط السائل للخارج وامتصاصه بواسطة المناديل الورقية الأساسية خلال هذه الخطوة.
  8. قم بتركيب شريحة العينة على مرحلة المجهر. حدد موقع رقعة من خلايا الخميرة وركز عليها باستخدام إضاءة تباين التداخل التفاضلي (DIC) أو تباين الطور (PC).
    ملاحظة: لا تستخدم التألق لتحديد موقع الخلايا. خلاف ذلك ، قد يتم تبييض الإشارة قبل جمع البيانات.
  9. قم بتكوين ثلاث مجموعات من المعلمات يدويا لتجميع مكدسات z-للصور: التقسيم z وقنوات التصوير ومعلمات التعريض الضوئي.
    ملاحظة: راجع الشكل التكميلي 1 للحصول على أمثلة واجهة المستخدم الرسومية لإعدادات المعلمات في برنامج تجاري واحد. يختلف المظهر الدقيق عبر منصات البرامج ، لكن الخيارات متشابهة إلى حد ما.
    1. التقسيم Z: اجمع الشرائح عند 0.5 ميكرومتر متخطو ل 15 شريحة (تغطي عمق 7 ميكرومتر ، وهو ما يكفي بشكل عام لخلايا الخميرة أحادية الصيغة الصبغية العادية).
    2. قنوات التصوير: حدد DIC أو الكمبيوتر الشخصي لمنحنيات الخلايا وقنوات التألق المناسبة حسب الحاجة.
    3. شدة ضوء الإثارة ووقت التعرض: اضبط شدة ضوء الإثارة ووقت التعرض حسب ما يتناسب مع العينة.
      ملاحظة: كنقطة انطلاق ، استخدم 100٪ لشدة ضوء الإثارة و 100 مللي ثانية لوقت التعرض. تقليل شدة الضوء إذا أصبح التبييض الضوئي واضحا مع تقدم مجموعة Z-Stack أو إذا تجاوزت الإشارة سعة تسجيل الكاميرا (أي تشبع الإشارة) ؛ قم بزيادة شدة الضوء إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة.
  10. اكتب إعدادات التصوير واستخدم نفس الإعدادات لمقارنة جميع العينات.
    ملاحظة: لا تستخدم الإعداد "تلقائي" لجمع البيانات وتصور الصور. من المهم تسجيل الإعدادات في ملاحظة معملية بحيث يمكن إعادة تطبيق نفس المعلمات بالضبط في التكرارات التجريبية المستقبلية. بعض تطبيقات برامج التحكم في المجهر لديها القدرة على حفظ الإعدادات وإعادة تطبيقها. ومع ذلك ، فمن المستحسن تسجيل الإعدادات بشكل مستقل لأن ملفات تعريف البرامج قد يتم حذفها أو تعديلها عن غير قصد من قبل زملاء العمل.
  11. احفظ البيانات بتنسيق مكدس متعدد القنوات 16 بت.
    ملاحظة: لا تحفظ كصور RGB 8 بت (أو 24 بت، في حالة حساب الألوان الثلاثة). راجع قسم تصور الصورة (القسم 4) لمعرفة قيود تنسيق 8 بت.
  12. انتقل إلى منطقة مختلفة تماما لمجموعة مكدس الصور التالية.
    ملاحظة: قد تكون المناطق المجاورة قد تعرضت للتبييض الضوئي والسمية الضوئية. نتيجة لذلك ، قد تكون مجموعة الصور التي تم جمعها من هذه المناطق مضللة.

3. تصوير بفاصل زمني

ملاحظة: يختلف إجراء التصوير بفاصل زمني عن إجراء التصوير بنقطة زمنية واحدة في مجالين: إعداد العينة ومعلمات التصوير.

  1. تحضير العينة
    1. قم بتغطية طبق ذو قاع زجاجي مقاس 35 مم ب 1 مجم / مل من كونكانافالين أ وانتظر 5 دقائق أو أكثر.
    2. أضف 1.5 مل من مزرعة الخميرة السائلة إلى الطبق ، وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح لخلايا الخميرة بالاستقرار على سطح الزجاج.
    3. باستخدام ماصة ، قم بشفط الوسط السائل من حافة الطبق ، ثم اشطف رقعة رواسب الخميرة برفق بحوالي 1 مل من الوسط الطازج لإزالة الخلايا المتصلة بشكل غير آمن.
    4. كرر الشطف 2-3 مرات. استنشق باستخدام ماصة ، ثم أضف برفق 2 مل من وسط الاستزراع الطازج.
  2. معلمات التصوير
    1. التقسيم Z: اجمع الشرائح عند 0.5 ميكرومتر تخطو ل 15 شريحة.
    2. قنوات التصوير: حدد حسب الحاجة.
    3. شدة ضوء الإثارة ووقت التعرض: استخدم الحد الأدنى اللازم لتمييز البنية الخلوية تحت البحث.
      ملاحظة: بالنسبة للتصوير بفاصل زمني ، يحد التبييض الضوئي والسمية الضوئية من الإضاءة المتكررة من إجمالي عدد النقاط الزمنية التي يمكن جمعها. لذلك ، يتم تعيين شدة الإثارة ووقت التعرض بشكل عام على قيم منخفضة بحيث يمكن تصوير المزيد من النقاط الزمنية.
    4. الفاصل الزمني للتصوير: اضبط فترات التوقيت المناسبة للعملية البيولوجية التي يتم فحصها.
      ملاحظة: على سبيل المثال ، يستغرق تكوين البلعمة الذاتية في ظل ظروف الجوع حوالي 5-10 دقائق ؛ يفضل فاصل زمني مدته 1 دقيقة أو أقل لتتبع ديناميكياته. في ظل الظروف الغنية بالمغذيات ، تحدث دورة خلايا الخميرة على مقياس الساعة. يمكن استخدام فاصل زمني أطول ، مثل 10-20 دقيقة.
  3. إذا كانت الأجهزة المناسبة متوفرة ، فحافظ على درجة حرارة الطبق عند 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أيضا تصوير معظم العمليات البيولوجية في خلايا الخميرة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، إلا بوتيرة أبطأ بشكل عام.

4. تصور مكدسات الصور وتقييم رقم نسخة التكامل

  1. قم بتثبيت برنامج Fiji أو ImageJ لتصور الصوروتحليلها 11،12.
    ملاحظة: فيجي عبارة عن مجموعة أدوات تعتمد على ImageJ ، وهي مناسبة لتصور بيانات الصور البيولوجية للأغراض العامة ومعالجتها. لمعالجة الصور المدرجة في هذا البروتوكول ، يكفي ImageJ بدون مكونات إضافية إضافية.
  2. اختر المعلمات المناسبة لعرض الصور ومقارنتها.
    1. في فيجي ، افتح صورتين من z-stack.
    2. اسحب موضع z في كل مكدس إلى القسم الأوسط (أو مواضع أخرى إذا تم تصور الهيكل قيد التحقيق بشكل أفضل هناك).
    3. انتقل إلى الصورة > ضبط > السطوع / التباين وانقر فوق إعادة تعيين.
    4. في نافذة السطوع/التباين (B&C)، استخدم أشرطة التمرير لتغيير معلمتين، قيم الحد الأدنى والحد الأقصى، لتمييز البنية قيد التحقيق بوضوح.
      ملاحظة: بشكل عام، يتم تعيين الحد الأدنى للقيمة ليكون قريبا من متوسط القيمة في المناطق الفارغة، ويتم تعيين الحد الأقصى ليكون قريبا من الحد الأقصى في الصورة. يمكن استنتاج هذه القيم من الرسم البياني المعروض (الشكل 2 أ). إذا تمت معايرة محطة عمل التصوير بالألوان، فيمكن تعيين الحد الأدنى للقيمة أعلى قليلا لإخفاء المزيد من إشارات الخلفية.
    5. في نافذة السطوع / التباين (B & C) ، انقر فوق تعيين وحدد نشر إلى جميع الصور المفتوحة الأخرى في النافذة المنبثقة تعيين نطاق العرض.
      ملاحظة: تطبق هذه العملية نفس إعدادات السطوع/التباين (بما في ذلك الحد الأدنى والقيم القصوى) على جميع الصور المفتوحة بحيث يمكن مقارنة الصور بشكل متقاطع.
    6. انظر عبر صور مختلفة وقم بالتمرير عبر z-stack في كل منها. إذا كانت الصور تبدو جيدة مع خلفية داكنة مناسبة وقليل من التشبع المبالغ فيه ، فاكتب إعدادات الحد الأدنى والحد الأقصى.
  3. بالنسبة للصور متعددة القنوات، اختر إعدادات عرض الصورة لكل قناة:
    1. انتقل إلى صورة > لون > القنوات أداة ، حدد وضع تدرج الرمادي في نافذة منبثقة القنوات.
    2. انتقل إلى كل قناة ، واختر السطوع / التباين المناسب لتلك القناة ، واكتب الإعدادات.
    3. مع ضبط السطوع/التباين ، ارجع إلى نافذة القنوات وقم بالتغيير إلى الوضع المركب للتصور المتزامن لقنوات متعددة.
      ملاحظة: يمكن تغيير اللون الزائف لكل قناة يدويا في القنوات ليناسب التفضيلات الشخصية. مربعات الاختيار مخصصة لإظهار / إخفاء قنوات معينة.
  4. إذا لزم الأمر، استخدم خانات الاختيار في نافذة القنوات لإظهار قنوات معينة أو إخفائها.
  5. إذا رغبت في ذلك ، قم بإنشاء إسقاطات المكدس بالانتقال إلى Image > Stacks > Z Project.
    ملاحظة: تتوفر العديد من أوضاع العرض. الكثافة القصوى هي خيار جيد للتقييم السريع. يجب النظر في طبيعة البحث لتحديد ما إذا كان ينبغي استخدام وضع إسقاط معين أو شرائح فردية للقياس الكمي. يمكن أيضا أن يقتصر العرض على شرائح z محددة لتقليل تداخل الضوء خارج نطاق التركيز البؤري.
  6. شاشة لمحولات تكامل النسخة الواحدة.
    1. بمجرد تطبيق نفس إعدادات السطوع/التباين عبر جميع الصور المفتوحة، قارن شدة الصورة عبر العينات لاستنتاج رقم تكامل البلازميد.
      ملاحظة: يجب الحصول على الصور باتباع الإجراء العام للتصوير أحادي النقطة الزمنية ، بدءا من الزراعة الليلية في وسط سائل. تبدو عمليات التكامل متعددة النسخ (انظر المستعمرة 2 و 3 في الشكل 2 ب للحصول على أمثلة) أكثر إشراقا بكثير من تلك ذات النسخة الواحدة (المستعمرة 1 في الشكل 2 ب). في المقابل ، تبدو النسخ الواحدة متشابهة مع بعضها البعض (الشكل 2 ب).
    2. افحص الصور من ثمانية محولات لكل سلالة، مع التأكد من استخدام نفس إعدادات السطوع/التباين .
    3. أعد خط وحفظ ثلاثة محولات أو أكثر من المحولات أحادية النسخة للدراسة اللاحقة.
  7. تصدير الصور للعرض التقديمي.
    1. انتقل إلى صورة > مكررة لعمل نسخة من الصورة التي تهمك، ومنحها اسما من اختياره.
    2. انتقل إلى صورة > اكتب > 8 بت لتحويل النسخة المكررة من 16 بت إلى 8 بت وحفظها حسب الحاجة.
      ملاحظة: اعلم أنه بمجرد تطبيق ذلك، إذا لم يتم تدوين إعدادات السطوع/التباين مسبقا، فلا توجد طريقة سهلة لاسترداد هذه المعلومات، وبالتالي لا توجد طريقة سهلة لإعادة تطبيق نفس الإعداد في تصورات الصورة اللاحقة. هذا هو أيضا سبب التوصية بعملية التكرار السابقة.
    3. لتقسيم مكدس z إلى مجموعة من الصور الفردية، انتقل إلى Image > Stacks > Stack to Images واحفظها حسب الحاجة.
      ملاحظة: يمكن أيضا اقتصاص الصور إلى منطقة أصغر في فيجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تخضع مورفولوجيا العضيات وديناميكياتها للتغيير حيث تستجيب خلايا الخميرة للإشارات الخارجية والداخلية. هنا ، نقدم صورا تمثيلية لعضيات الخميرة في مرحلة منتصف السجل (الشكل 3 أ ، ب). كما ذكرنا سابقا ، تتمتع العديد من العضيات بخصائصها المورفولوجية المميزة ، وبالتالي يسهل التعرف عليها دون مقارنة واسعة النطاق مع علامات العضيات الأخرى. وتشمل هذه ER والميتوكوندريا والفجوات. لاحظ أنه في بعض السلالات المختبرية ، بما في ذلك السلالات التي نعرضها هنا ، يكون توازن الانصهار الانشطاري للفجوات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموصوف هنا بداية بسيطة للأشخاص الذين يدخلون من مجالات بحثية أخرى لاستكشاف عضيات الخميرة التصويرية. قبل الانتقال إلى مواضيع محددة ، نود أن نؤكد مرة أخرى على أنه يحتاج المرء إلى الامتناع عن الاستخدام المفرط للميزات التلقائية في برامج التصوير. صور الفحص المجهري ليست مجرد صور جميلة ، إنها بيانات علمية ، وبالتالي يجب التعامل مع اكتسابها وتفسيرها وفقا لذلك. من المهم بشكل خاص أن يتم اختيار معلمات مجموعة الصور بضمير حي ، والتعرف على مفاهيم الصور 16 بت مقابل 8 بت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر Xie على مساعدتهم السخية في إعداد المخطوطات. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة 91957104) ، ولجنة التعليم في بلدية شنغهاي (منحة 2017-01-07-00-02-E00035) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (المنحة 22ZR1433800).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدينينسانجون للتكنولوجيا الحيويةA600013
كازامينوسومسانجون للتكنولوجيا الحيويةA603060
كونكانافالين أ من canavalia ensiformis (جاك بين)سيجما ألدريتشL7647
D-GlucoseSangon BiotechA501991
فيجيhttps://fiji.sc/
طبقبتري زجاجي القاعNEST706001& Phi; 35 ملم
ImajeJhttps://imagej.net/
مجهر الإزهار المقلوبأوليمبوسIX83 مزود بهدف الغمر بالزيت UPLXAPO 100X ، ومصدر ضوء Lumencor Spectra X ، وكاميرا Hamamatsu Orca Flash4.0 LT.
L-HistidineSangon BiotechA604351
L-LeucineSangon BiotechA100811
L-LysineSangon BiotechA602759
L-MethionineSangon BiotechA100801
L-TryptophanSangon BiotechA601911
غطاء مجهر زجاجيCITOTEST10222222C22 مم × 22 مم ، 0.16 & ndash ؛ 0.19 مم
شرائح مجهرCITOTEST1A510125 مم × 75 مم ، 1 & ndash ؛ 1.2 مم
PeptoneSangon BiotechA505247
UracilSangon BiotechA610564
VisiviewVisitron System GmbHhttps://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html مستخلص
الخميرةSangon BiotechA100850
نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينيةSangon BiotechA610507
YNB بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيومسانجون للتكنولوجيا الحيويةA600505
قاعدة

المراجع

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
  2. Spang, A. Anniversary of the discovery of sec mutants by Novick and Schekman. Molecular Biology of the Cell. 26 (10), 1783-1785 (2015).
  3. Walter, T., Erdmann, R. Current advances in protein import into peroxisomes. The Protein Journal. 38 (3), 351-362 (2019).
  4. Farre, J. C., Subramani, S. Mechanistic insights into selective autophagy pathways: lessons from yeast. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (9), 537-552 (2016).
  5. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Zhu, J., et al. A validated set of fluorescent-protein-based markers for major organelles in yeast (Saccharomyces cerevisiae). mBio. 10 (5), 19(2019).
  8. Li, D., et al. A fluorescent tool set for yeast Atg proteins. Autophagy. 11 (6), 954-960 (2015).
  9. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods in Molecular Biology. 313, Clifton, N.J. 107-120 (2006).
  10. Caloca, B., et al. Comparison of concanavalin A and poly-l-lysine as cell adhesives for routine yeast microscopy applications. Yeast. , (2021).
  11. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Banfield, D. K., Lewis, M. J., Pelham, H. R. B. A SNARE-like protein required for traffic through the Golgi complex. Nature (London). 375 (6534), 806-809 (1995).
  14. Curran, B. P., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1163, Clifton, N.J. 1-14 (2014).
  15. Zhao, W., et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. , (2021).
  16. He, C. W., et al. Membrane recruitment of Atg8 by Hfl1 facilitates turnover of vacuolar membrane proteins in yeast cells approaching stationary phase. BMC Biology. 19 (1), 117(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Saccharomyces Cerevisiae
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة