Method Article

تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يتم وصف البروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات المناسبة لتحليل السائل EM و cryo-EM على المستوى النانوي باستخدام المجهر الإلكتروني المرسل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ارتفع الاهتمام بالمجهر الإلكتروني السائل (Liquid-EM) في السنوات الأخيرة حيث يمكن للعلماء الآن مراقبة العمليات في الوقت الفعلي على المستوى النانوي. من المرغوب فيه للغاية إقران معلومات cryo-EM عالية الدقة بالملاحظات الديناميكية حيث تحدث العديد من الأحداث في نطاقات زمنية سريعة - في نطاق ميلي ثانية أو أسرع. يمكن أن تساعد المعرفة المحسنة بالهياكل المرنة أيضا في تصميم كواشف جديدة لمكافحة مسببات الأمراض الناشئة ، مثل SARS-CoV-2. والأهم من ذلك ، أن مشاهدة المواد البيولوجية في بيئة سائلة توفر لمحة فريدة عن أدائها في جسم الإنسان. تظهر هنا طرق مطورة حديثا للتحقيق في الخصائص النانوية لتجمعات الفيروسات في الجليد السائل والزجاجي. لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام عينات محددة جيدا كأنظمة نموذجية. يتم تقديم مقارنات جنبا إلى جنب لطرق تحضير العينات والمعلومات الهيكلية التمثيلية. يتم عرض ميزات النانومتر الفرعي للهياكل التي تم حلها في نطاق ~ 3.5-Å-10 Å. تشمل النتائج الحديثة الأخرى التي تدعم هذا الإطار التكميلي رؤى ديناميكية للقاحات المرشحة والعلاجات القائمة على الأجسام المضادة المصورة في سائل. بشكل عام ، تعمل هذه التطبيقات المترابطة على تعزيز قدرتنا على تصور الديناميات الجزيئية ، مما يوفر سياقا فريدا لاستخدامها في صحة الإنسان والمرض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل البحوث الطبية الحيوية على تحسين فهمنا لصحة الإنسان والمرض من خلال تطوير تقنيات جديدة. يعمل التصوير عالي الدقة على تغيير نظرتنا إلى عالم النانو - مما يسمح لنا بدراسة الخلايا والجزيئات بتفاصيل رائعة1،2،3،4،5. تكشف المعلومات الثابتة للمكونات الديناميكية مثل البوليمرات اللينة أو مجموعات البروتين أو الفيروسات البشرية عن لقطة محدودة فقط من سردها المعقد. لفهم كيفية عمل الكيانات الجزيئية بشكل أفضل ، يجب التحقيق في هيكلها ووظيفتها بشكل مشترك.

توفر التطورات الحديثة في إنتاج مواد مثل الجرافين الرقيق ذريا أو الرقائق الدقيقة القائمة على السيليكون فرصا جديدة لتحليل وظيفة البنية في الوقت الفعلي باستخدام المجاهر الإلكترونية المرسلة (TEMs). يمكن لهذه المواد إنشاء غرف محكمة الغلق للتصوير EM المباشر6،7،8،9،10،11. يوفر المجال الجديد ل Liquid-EM ، درجة حرارة الغرفة المرتبطة ب cryo-EM ، مناظر غير مسبوقة للمواد الصلبة أو اللينة في المحلول ، مما يسمح للعلماء بدراسة بنية وديناميكيات عينتهم في وقت واحد. تشمل تطبيقات Liquid-EM تسجيلات في الوقت الفعلي للجسيمات النانوية العلاجية التي تتفاعل مع الخلايا الجذعية السرطانية بالإضافة إلى التغيرات في التعقيدات الجزيئية لمسببات الأمراض الفيروسية12،13،14.

مثلما حفز التقدم المنهجي ثورة الحل في مجال cryo-EM ، هناك حاجة إلى تقنيات وأساليب جديدة لتوسيع استخدام السائل الكهرومغناطيسي كأداة عالية الإنتاجية للمجتمع العلمي. الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو تبسيط بروتوكولات تحضير عينة السائل EM. الأساس المنطقي وراء التقنيات المطورة هو استخدام تصميمات رقاقة جديدة وأجهزة تحميل تلقائي ، مناسبة لكل من جمع البيانات السائلة و cryo-EM (الشكل 1) 7،14،15،16،17. يتم إغلاق التجميعات ميكانيكيا باستخدام مشابك الشبكة القياسية للأدوات الآلية ، مثل Krios ، والتي يمكن أن تستوعب عينات متعددة لكل جلسة أو F200C TEM (الشكل 2). توسع هذه المنهجية استخدام التصوير عالي الدقة بما يتجاوز تطبيقات cryo-EM القياسية التي توضح أغراضا أوسع لتحليل المواد في الوقت الفعلي.

في مقالة الفيديو الحالية ، يتم تقديم بروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات في السائل مع وبدون حاملي العينات المتاحة تجاريا. باستخدام حامل العينات المتخصص ل Liquid-EM ، يمكن أن توفر العينات السائلة الرقيقة معلومات هيكلية مماثلة لعينات cryo-EM ، بالإضافة إلى رؤى ديناميكية للعينات. كما تم عرض طرق تحضير العينات السائلة باستخدام أدوات التحميل الآلي لإجراءات الإنتاجية العالية. الميزة الرئيسية على التقنيات الأخرى هي أن الإنتاج الآلي للعينات يسمح للمستخدم بتقييم عيناته بسرعة للحصول على السماكة المثلى وجرعة الإلكترون قبل جمع البيانات. تحدد تقنية الفحص هذه بسرعة المناطق المثالية للتسجيلات في الوقت الفعلي في السائل أو الجليد12،14،18،19. لأغراض تحديد هيكل 3D ، قد يكمل Liquid-EM طرق cryo-EM الراسخة المطبقة في cryo-EM. قد يفكر القراء الذين يستخدمون تقنيات TEM أو cryo-EM التقليدية في استخدام سير عمل السائل الكهرومغناطيسي لتقديم ملاحظات جديدة وديناميكية لعيناتهم بطريقة تكمل استراتيجياتهم الحالية.

تشمل عينات الفيروسات المستخدمة في هذا البروتوكول النوع الفرعي 3 من الفيروس المنقى المرتبط بالغدي (AAV) الذي تم الحصول عليه كهدية واستزراعه في ظل الظروف القياسية12. كما تم استخدام مجموعات غير معدية من فيروس SARS CoV-2 المستمدة من مصل مرضى COVID-1912 وتم الحصول عليها من مصدر تجاري. أخيرا ، تم الحصول على جزيئات مزدوجة الطبقات (DLPs) من فيروس سيميان الروتا المنقى (سلالة SA11) من مختبر الدكتورة سارة إم ماكدونالد إستمان في جامعة ويك فورست واستزراعها باستخدام الظروف القياسية 6،17. حزم البرامج الموضحة هنا متاحة مجانا وتم توفير الروابط في قسم جدول المواد .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحميل حامل العينة للسائل EM

  1. نظف رقائق نيتريد السيليكون (SiN) الدقيقة عن طريق احتضان كل شريحة في 150 مل من الأسيتون لمدة دقيقتين تليها حضانة في 150 مل من الميثانول لمدة دقيقتين. اترك الرقائق تجف في تدفق الهواء الرقائقي.
  2. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق المجففة باستخدام أداة تفريغ متوهجة تعمل في ظل ظروف قياسية تبلغ 30 واط و 15 مللي أمبير لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.
  3. قم بتحميل رقاقة قاعدة جافة في طرف حامل العينة. أضف ~ 0.2 ميكرولتر من العينة (0.2-1 مجم / مل من مجموعات الفيروسات في 50 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 150 mM كلوريد الصوديوم ؛ 10 mM MgCl 2 ؛ 10 mM CaCl2) إلى الشريحة الأساسية. بعد خطوة حضانة مدتها 1-2 دقيقة ، ضع الشريحة العلوية على شريحة القاعدة الرطبة التي تحتوي على العينة.
  4. قم بتثبيت المجموعة معا لتشكيل حاوية محكمة الغلق ، مثبتة في مكانها ميكانيكيا بواسطة ثلاثة براغي نحاسية. عند إغلاق التجميع ، قم بضخ الطرف إلى 10-6 Torr باستخدام محطة ضخ جافة بضخ توربيني. الحامل جاهز الآن لإدخاله في TEM.
    ملاحظة: لا يحتوي حامل التحديد على إمكانات تبريد ولا يستخدم في cryo-EM.

2. إنتاج مجموعات شطيرة رقاقة

ملاحظة: يمكن استخدام رقائق SiN أو ثاني أكسيد السيليكون (SiO) المختلفة مباشرة من عبوات الجل المشحونة. يمكن أيضا استخدام شبكات الذهب المطلية بالكربون مباشرة كما تم توفيرها.

  1. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق الدقيقة وشبكات الكربون باستخدام أداة تفريغ توهج تعمل في ظل ظروف قياسية تبلغ 30 واط و 15 مللي أمبير لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.
  2. إضافة ~ 2 ميكرولتر من العينة الموجودة في 50 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ؛ 10 mM MgCl2 ؛ 10 mM CaCl2 إلى رقاقة متوهجة مفرغة من التوهج موضوعة على عبوة هلام. قم بإزالة المحلول الزائد (~ 50٪) باستخدام ورق ترشيح أو ماصة. بعد خطوة حضانة مدتها 1-2 دقيقة ، أضف شبكة الكربون المتوهجة إلى الرقاقة الدقيقة الرطبة التي تحتوي على العينة.
  3. قم بتثبيت المجموعة معا باستخدام حامل عينة أحادي الإمالة أو مقاطع شبكة محمل تلقائي في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حاوية محكمة الغلق. بالنسبة لمشابك التحميل التلقائي ، ضع مجموعة الساندويتش على مشبك C السفلي ، ضع المشبك العلوي أعلى المجموعة واستخدم أداة التثبيت القياسية لإغلاق المجموعة معا.
    ملاحظة: يستخدم إجراء التثبيت الذي يتم إجراؤه هنا نفس الخطوات المستخدمة في تثبيت شبكة cryo-EM ، ولكن في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين العينات المثبتة لمدة 2 أشهر أو أكثر قبل التصوير مع الحفاظ على السائل في العلبة. لا يتم استخدام فحص التسرب مع حامل عينة درجة حرارة الغرفة أو أداة التحميل التلقائي.
  4. العينة جاهزة الآن لإدخالها في TEM. افحص العينات الموضوعة في أجهزة التحميل التلقائي تحت ظروف التبريد أو في درجة حرارة الغرفة.

3. تصوير العينات باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ

  1. التصوير الكهرومغناطيسي السائل
    1. قم بتحميل حامل العينة في TEM المجهز بمسدس انبعاث ميداني (FEG) ويعمل عند 200 كيلو فولت.
    2. قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب ، وإمالة العينة من -15 درجة إلى +15 درجة في العمود. يضبط هذا الإجراء المرحلة في الاتجاه Z لاستيعاب سمك العينة. ويساعد على ضمان تكبير دقيق أثناء تسجيل الصور.
    3. سجل الصور كأفلام ذات إطارات طويلة باستخدام الحزمة في الموقع المدمجة مع كاشف مباشر بمسافة بكسل تبلغ 6 ميكرومتر (الفيديو 1 والفيديو 2). يمكن أيضا تسجيل الصور الفردية باستخدام حزمة برامج جمع البيانات التسلسلية20 ، وتنفيذ إجراءات التصوير الآلي. التقط الصور في ظل ظروف الجرعة المنخفضة بتكبير يتراوح من 28000 × إلى 92000 × و 40 إطارا في الثانية.
    4. اضبط أوقات التعرض (0.25-1 ثانية) لتقليل تلف الحزمة للعينة. استخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من -1-4 ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة حل سميك، استخدم قيم إلغاء تركيز بؤري أعلى أو حدد منطقة اهتمام مختلفة.
    5. تأكد من وجود المحلول في العينات طوال جلسة التصوير عن طريق تركيز شعاع الإلكترون على منطقة قربانية غير مستخدمة لجمع البيانات ، حتى تتشكل الفقاعات (الشكل التكميلي 1).
  2. التصوير بالتبريد الكهرومغناطيسي
    1. قم بتحميل شبكات EM المقطوعة أو شطائر الرقائق الدقيقة في TEM المجهز ب FEG ويعمل عند 300 كيلو فولت. قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر ، باستخدام إجراء مماثل موصوف للسائل TEM أعلاه (الخطوة 3.1.2).
    2. سجل الصور الفردية باستخدام نظام تحليل الجسيمات المفردة المدمج في نظام المجهر أثناء تنفيذ إجراءات التصوير الآلي. سجل الصور في ظل ظروف الجرعة المنخفضة باستخدام كاشف الإلكترون المباشر لتحليل الجسيمات المفردة الذي يحتوي على تباعد بكسل يبلغ 14 ميكرومتر عند تكبير 59000x و 40 إطارا في الثانية.
    3. استخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من 1-4 ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة طبقات سميكة من الجليد الزجاجي، استخدم قيم إلغاء تركيز أعلى أو حدد منطقة مختلفة لجمع البيانات.

4. تحليل البيانات ومقارنات هيكل 3 D

  1. تحليل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في الجليد السائل والزجاجي
    1. قم بمعالجة الأفلام لجزيئات AAV في السائل والجليد باستخدام برنامج RELION-3.0821 أو برنامج معالجة الصور الآخر22. قم بإجراء تصحيح الحركة باستخدام MotionCor2 v1.2.3.
    2. بمجرد التصحيح ، استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في حزمة برامج البرنامج. أحجام الصناديق النموذجية هي 330 بكسل للعينات السائلة و 350 بكسل لعينات الجليد.
    3. احسب عمليات إعادة البناء الأولية باستخدام تناظر C1 باستخدام روتين النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد للبرنامج و / أو خيارات نموذج ab-initio في حزمة برامج معالجة البيانات. في البرنامج ، استخدم معلمة تنظيم T = 4 وحجم بكسل 1.01 Å للعينات السائلة و 1.13 Å لعينات الجليد.
    4. استخدم قيمة قناع 300 Å طوال إجراءات التحسين. إجراء بروتوكولات التحسين في برنامج معالجة البيانات باستخدام تناظر I1 للحصول على خرائط EM متعددة. قد تكون الدقة الهيكلية المتوقعة في حدود 4 Å أو أفضل. استخدم معادلة الجسيمات لتنفيذ تناظر icosahedral عند 16,800 للسائل و 15,240 للثلج12,14.
      ملاحظة: تستند تقديرات الدقة إلى معايير ارتباط غلاف فورييه (FSC) ذات المعيار الذهبي.
    5. قناع خرائط EM في ~ 250 Å وفحص النتائج باستخدام حزمة برامج تحليل البنية الجزيئية23،24. في الشكل 3 ، تظهر الشرائح بزيادات ~ 5 نانومتر.
    6. استخراج وحدات بروتين القفيصة (VP1) الفرعية من خرائط EM للمقارنة. تحديد التغيرات الديناميكية بين هياكل EM بناء على قياسات قطر الجسيمات (الشكل التكميلي 2) ، ثم التصور باستخدام وظيفة خريطة Morph في البرنامج.
  2. تحليل التجميعات شبه الفيروسية ل SARS-CoV-2 في السائل
    1. معالجة الأفلام باستخدام برنامج RELION-3.08. تصحيح انحراف الصورة والحركة التي يسببها الشعاع باستخدام MotionCor2 v1.2.3. تصحيح لوظيفة نقل التباين (CTF) للمجهر.
    2. استخدم أداة الانتقاء التلقائي في البرنامج لتحديد التجميعات الفيروسية بحجم صندوق 800 بكسل. لتحقيق الكفاءة الحسابية ، يمكن إعادة قياس الجسيمات المستخرجة إلى 256 بكسل. احصل على نموذج أولي باستخدام تناظر C1 في البرنامج مع معلمة تنظيم بحجم T = 2 و 1.66 Å بكسل.
    3. قم بإجراء تحسين 3D في البرنامج للحصول على خريطة EM ، يظهر مثال في ~ 8.25 Å وفقا لمعايير FSC القياسية (الشكل 4). تصور خرائط EM باستخدام برنامج تحليل التركيب الجزيئي مع شرائح متزايدة عند 25 نانومتر كما هو موضح في الشكل 4.
  3. تحليل جسيمات فيروس الروتا مزدوجة الطبقات (DLPs) في الجليد الزجاجي
    1. قم بمعالجة الأفلام ل DLPs للفيروسات العجلية باستخدام برامج معالجة الصور الأخرى. استخدم MotionCor2 v1.2.3 لتصحيح الانجراف في الصور. استخدم تقدير CTF للتصحيح لتصحيح تأثيرات العدسة على الصور.
    2. استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في البرنامج بحجم صندوق 950 بكسل. قم بأخذ عينة من حجم الصندوق حسب الحاجة لأغراض الحوسبة.
    3. احسب النماذج الأولية باستخدام خيارات ab-initio وتناظر C1. استخدم معلمات التحسين بما في ذلك حجم البكسل 1.47 Å وقيمة قناع 800 Å.
    4. قم بإجراء إجراءات تحسين إضافية مع فرض تناظر I1. تتضمن النتائج النموذجية خريطة 10.15 Å EM ، وفقا لمعايير FSC القياسية الذهبية. كان إجمالي الجسيمات المستخدمة 2050 ، وهو ما يعادل 123000 وحدة بروتومر بسبب مشغل تناظر icosahedral (الشكل 5).
    5. قناع الخرائط النهائية في ~ 750 Å وتصور النتائج في حزمة برامج تحليل البنية الجزيئية. يتم عرض أمثلة الشرائح عبر خريطة EM في الشكل 5 بزيادات ~ 10 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام TEM السائل الذي يعمل عند 200 كيلو فولت لجميع تجارب التصوير السائل الكهرومغناطيسي وتم استخدام cryo-TEM الذي يعمل عند 300 كيلو فولت لجميع عمليات جمع بيانات cryo-EM. يتم تقديم صور وهياكل تمثيلية لفيروسات متعددة لإثبات فائدة الطرق عبر مواضيع الاختبار المختلفة. وتشمل هذه الأنواع الفرعية 3 من الفيروس المرتبط بالغدي المؤتلف (AAV) ، والتجمعات الفيروسية الفرعية ل SARS-CoV-2 المشتقة من مصل المريض ، وجزيئات الفيروسة العجلية المزدوجة (DLPs) ، سلالة SA11. أولا، تم إجراء مقارنات لنفس عينة AAV (1 ملغم/مل) المصورة في محلول سا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم فرص جديدة لتبسيط سير عمل السائل الكهرومغناطيسي الحالي باستخدام أدوات وتقنيات آلية جديدة مقتبسة من مجال cryo-EM. تعتبر التطبيقات التي تنطوي على تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة الجديدة مهمة فيما يتعلق بالطرق الأخرى لأنها تتيح تحليل التصوير عالي الدقة في الثلج السائل أو الزجاجي. واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول هي إنتاج عينات بسمك سائل مثالي لتصور تفاصيل رائعة على المستوى النانوي. يتم تحديد المناطق المثالية ذات الأهمية عند التكبير المنخفض عن طريق فحص العينة بأكملها قبل تنفيذ إجراءات عالية الإنتاجية لجمع البيانات تلق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. المؤلفة ، مادلين ج. دريسل ديوكس ، موظفة في شركة Protochips، Inc. ومايكل سبيلمان موظف في DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بالدكتور Luk H. Vandenberghe (كلية الطب بجامعة هارفارد ، قسم طب العيون) لتوفير AAV-3 المنقى. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للسرطان (R01CA193578 ، R01CA227261 ، R01CA219700 إلى DFK).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأسيتونفيشر العلمية  A11-1التلقائي سعة 1 لتر
ThermoFisher Scientific N/ Aأيضا مورد SubAngstrom
شبكة التحميلThermoFisher ScientificN / Aمقاطع علوية وسفلية
شبكات EM الذهبية المطلية بالكربونعلوم النسخ المجهريالإلكتروني CF400-AU-50شبكة 400 ، سمك 5 نانومتر
مصل مريض COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 ميكرولتر من مصل PCR+
ميثانولفيشر العلمي  A412-11 لتر
Microwell-integrad رقائقProtochips، Inc.EPB-42A1-10مصفوفات النوافذ 10x10 مم
الرقائق الدقيقة TEMWindowsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 نوافذ كبيرة ،
رقائق كهربائية بسمك 10 nn من TEMWindowsSimpore، Inc.   ؛SN100-A05Q33A9 نوافذ صغيرة ، رقائق كهربائية بسمك 5 نانومتر
Protochips، Inc.EPT-50W500 مم × 100 مم نافذة
Whatman # 1 ورق ترشيحWhatman1001 090100 قطعة ، 90
مم < قوي > المعدات   ؛ < / قوي>
DirectView كاشف الإلكترون المباشرالإلكترونالمباشر 6 ميكرون بكسل
فالكون 3 EC كاشف الإلكترون المباشرThermoFisher Scientificتباعد 14 ميكرون بكسل
Gatan 655 محطة الضخ الجافةGatan، Inc.  طرف حامل المضخة إلى 10-6 < / sup>range
Mark IV VitrobotThermoFisher وحدة تحضير العينات العلميةالحديثة  
PELCO easiGlow ، وحدة تفريغ التوهجTed Pella، Inc.  وضع القطبية السلبية
Poseidon Select حامل العينةProtochips، Inc.  متوافق مع الاتحاد الدولي للفروسية. حامل العينة
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 كيلو فولت ؛ السائل TEM
تيتان كريوس G3ThermoFisher Scientific300 كيلو فولت ؛ Cryo-TEM
البرمجيات المتاحة مجانا < / قوية >< قوية > رابط الموقع < / strong> التعليقات (اختياري) < / strong >
cryoSPARChttps://cryosparc.com/برامج معالجة الصور الأخرى
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4برنامج البحث عن CTF
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/حزمة برامج تحليل التركيب الجزيئي
أداة قص التحميل مقاطع التلقائي تباعد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes