Septins هي بروتينات هيكلية خلوية. تتفاعل مع الأغشية الدهنية ويمكن أن تستشعر ولكنها تولد أيضا انحناء الغشاء على مقياس الميكرون. نحن نصف في هذا البروتوكول منهجيات من أسفل إلى أعلى في المختبر لتحليل تشوهات الغشاء ، وربط السيتين الحساس للانحناء ، والبنية الفائقة لخيوط السيفتين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
من أسفل إلى أعلى في طرق المختبر لفحص التنظيم فوق الهيكلي ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وسلوك حساسية الانحناء للسبتين
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحدث إعادة تشكيل الغشاء باستمرار في غشاء البلازما وداخل العضيات الخلوية. لتشريح دور البيئة بالكامل (الظروف الأيونية ، تركيبات البروتين والدهون ، انحناء الغشاء) والشركاء المختلفين المرتبطين بعمليات إعادة تشكيل غشاء محددة ، نتعهد في المختبر بنهج من أسفل إلى أعلى. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بالكشف عن دور بروتينات السيبتين المرتبطة بالأمراض الرئيسية. Septins هي بروتينات هيكلية خلوية أساسية ومنتشرة في كل مكان تتفاعل مع غشاء البلازما. وهي متورطة في انقسام الخلايا ، وحركية الخلية ، والتشكل العصبي ، وتكوين الحيوانات المنوية ، من بين وظائف أخرى. لذلك ، من المهم فهم كيفية تفاعل السيبتين وتنظيمها في الأغشية للحث لاحقا على تشوهات الغشاء وكيف يمكن أن تكون حساسة لانحناءات غشائية محددة. تهدف هذه المقالة إلى فك رموز التفاعل بين البنية الفائقة للسبتين على المستوى الجزيئي وإعادة تشكيل الغشاء التي تحدث على نطاق ميكرون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم التعبير عن الخميرة الناشئة ، ومجمعات سبتين الثدييات بشكل مؤتلف وتنقيتها. ثم تم استخدام مزيج من الفحوصات في المختبر لتحليل التجميع الذاتي للسبتين في الغشاء. تم استخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) ، وحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) ، وحويصلات unilamellar الكبيرة (LUVs) ، والركائز المتموجة لدراسة التفاعل بين التجميع الذاتي للسبتين ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وانحناء الغشاء.
المقدمة
Septins هي بروتينات مكونة للخيوط الخلوية الهيكلية تتفاعل مع الأغشية الدهنية. Septins موجودة في كل مكان في حقيقيات النوى وضرورية للعديد من الوظائف الخلوية. وقد تم تحديدها على أنها المنظمين الرئيسيين لانقسام الخلايا في الخميرة الناشئة والثدييات 1,2. وهي تشارك في أحداث إعادة تشكيل الغشاء ، وتكوين الأهداب3 ، وتكوين الحيوانات المنوية4. داخل خلايا الثدييات ، يمكن أن تتفاعل السيبتين أيضا مع الأكتين والأنابيب الدقيقة5،6،7 في رابط من Rho GTPases (BORG) بطريقة تعتمد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحديد إعادة تشكيل الغشاء باستخدام حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs)
ملاحظة: في هذا القسم ، يتم إنشاء GUVs لتقليد تشوهات الغشاء التي قد تسببها السيبتين في سياق خلوي. في الواقع ، في الخلايا ، غالبا ما توجد السيبتين في مواقع ذات انحناءات ميكرومترية. GUVs لها أحجام تتراوح من عدد قليل إلى عشرات الميكرومترات ويمكن أن تكون مشوهة. وبالتالي فهي مناسبة لفحص أي تشوهات ناجمة عن السبتين على نطاق ميكرومتر. تستخدم الدهون الفلورية ، وكذلك السيبتين المسمى بالفلورسنت (باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) ، لمتابعة سلوك كل من الدهون والبروتينات عبر المجهر الفلوري.
- إعداد المخازن المؤقتة والحلول
- قم بإعداد ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشوهات GUVs
يتم عرض صور التألق البؤري النموذجية للمركبات متعددة الاستخدامات التي أعيد تشكيلها بعد احتضانها بالسيبتين في الشكل 3 ، في الظروف التي تتبلمر فيها السيبتين. كانت GUVs العارية (الشكل 3A) كروية تماما. عند الحضانة بأكثر من 50 نانومتر من خيوط الخميرة المهدرة ، بدت الحويصلات مشوهة. حتى تركيز 100 نانومتر من أوكتامات الخميرة الناشئة، بدت الحويصلات ذات أوجه، وظلت التشوهات ثابتة وبالتالي لم تتقلب (الشكل 3 ب). فو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما ذكر أعلاه ، تم استخدام خليط الدهون الذي يعزز دمج PI (4,5) P2 داخل الطبقة الثنائية للدهون وبالتالي يسهل التفاعلات بين غشاء السبعين. في الواقع ، لقد أظهرنا في مكان آخر25 أن سبتين الخميرة الناشئة تتفاعل مع الحويصلات بطريقة PI (4,5) P2 الخاصة. تم تعديل تركيبة الدهون هذه تجريبيا من فحص تركيبات متعددة وتستخدم الآن على نطاق واسع من قبل المؤلفين. يجب التعامل مع دهون PI (4,5) P2 بعناية. يجب أن تكون حلول المخزون مقتبسة بكميات صغيرة بحيث لا يتم فتح قارورة محددة أكثر من مر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونشكر باتريشيا باسيريو ودانيال ليفي على مشورتهما ومناقشاتهما المفيدة. استفاد هذا العمل من دعم الوكالة الوطنية للبحوث لتمويل مشروع "SEPTIME" ، ANR-13-JSV8-0002-01 ، ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 ، ومشروع "SEPTSCORT" ، ANR-20-CE11-0014-01. يتم تمويل B. Chauvin من قبل مدرسة الدكتوراه "ED564: Physique en Ile de France" ومؤسسة البحث العلمي. تم دعم K. Nakazawa من قبل جامعة السوربون (AAP Emergence). تم دعم G.H. Koenderink من قبل Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO / OCW) من خلال "BaSyC-Building a Synthetic Cell". منحة الجاذبية (024.003.019). نشكر مقياس Labex Cell(n) (ANR-11-LABX0038) وباريس للعلوم والآداب (ANR-10-IDEX-0001-02). نشكر تصوير الخلايا وا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath Sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | 11504726 | |
| المواد الكيميائية: كلوريد الصوديوم ، تريس حمض الهيدروكلوريك ، السكروز ، KCl ، MgCl2 ، ب الكازين ، الكلوروفورم ، كاكوديلات الصوديوم ، حمض التانيك ، الإيثانول | سيجما ألدريتش | ||
| المجهر متحد البؤر | قرص الغزل نيكون | أو مجفف النقطة الحرجة | |
| البؤر | الدقيقة CPD300 | ||
| مولد المياه منزوع الأيونات | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ تكامل 3 |
| بيضات L- & alpha ؛ - فوسفاتيديل كولين | أفانتي القطبية | 840051 | |
| مسدس الانبعاث الميداني SEM (FESEM) كارل | زايس | الجوزاء SEM500 | |
| الجلوتارالديهايد 25٪ ، محلول مائي | Thermo Fischer العلمي | 50-262-19 | |
| شحوم عالية الفراغ ، برنامج Dow corning | VWR | ||
| IMOD | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | مجموعة البرمجيات لمحاذاة الصور سلسلة مائلة وإعادة بناء | |
| 3D لاسي فورفار / شبكات المجهر الإلكتروني الكربوني | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L- & alpha ؛ -phosphatidylinositol-4،5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| المبخر المعدني | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (المواد اللاصقة البصرية Norland) ، NOA 71 و NOA 81 | منتجات نورلاند | NOA71 ، NOA81 | |
| أوزميوم رباعي أوكسيد 4٪ | دلتا المجهري | 19170 | |
| التناضح | L & ouml ؛ ser | 15 M | |
| منظف البلازما | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| مولد البلازما | علم المجهر | ||
| معدات التجميد | معدات تجميد لايكا ميكروسيستمز | EMGP | |
| نقل المجهر الإلكتروني | Thermofischer | Tecnai G2 200 كيلو فولت ، LaB6 | |
| أسيتات اليورانيل | علم المجهر الإلكتروني | 22451 | هذا المنتج غير متوفر للشراء أي لوحات شمع |
| أطول ، Vitrex | VWR |
المراجع
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
