مقالة منهجية

من أسفل إلى أعلى في طرق المختبر لفحص التنظيم فوق الهيكلي ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وسلوك حساسية الانحناء للسبتين

DOI:

10.3791/63889

⸱

أغسطس 17, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Septins هي بروتينات هيكلية خلوية. تتفاعل مع الأغشية الدهنية ويمكن أن تستشعر ولكنها تولد أيضا انحناء الغشاء على مقياس الميكرون. نحن نصف في هذا البروتوكول منهجيات من أسفل إلى أعلى في المختبر لتحليل تشوهات الغشاء ، وربط السيتين الحساس للانحناء ، والبنية الفائقة لخيوط السيفتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث إعادة تشكيل الغشاء باستمرار في غشاء البلازما وداخل العضيات الخلوية. لتشريح دور البيئة بالكامل (الظروف الأيونية ، تركيبات البروتين والدهون ، انحناء الغشاء) والشركاء المختلفين المرتبطين بعمليات إعادة تشكيل غشاء محددة ، نتعهد في المختبر بنهج من أسفل إلى أعلى. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بالكشف عن دور بروتينات السيبتين المرتبطة بالأمراض الرئيسية. Septins هي بروتينات هيكلية خلوية أساسية ومنتشرة في كل مكان تتفاعل مع غشاء البلازما. وهي متورطة في انقسام الخلايا ، وحركية الخلية ، والتشكل العصبي ، وتكوين الحيوانات المنوية ، من بين وظائف أخرى. لذلك ، من المهم فهم كيفية تفاعل السيبتين وتنظيمها في الأغشية للحث لاحقا على تشوهات الغشاء وكيف يمكن أن تكون حساسة لانحناءات غشائية محددة. تهدف هذه المقالة إلى فك رموز التفاعل بين البنية الفائقة للسبتين على المستوى الجزيئي وإعادة تشكيل الغشاء التي تحدث على نطاق ميكرون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم التعبير عن الخميرة الناشئة ، ومجمعات سبتين الثدييات بشكل مؤتلف وتنقيتها. ثم تم استخدام مزيج من الفحوصات في المختبر لتحليل التجميع الذاتي للسبتين في الغشاء. تم استخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) ، وحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) ، وحويصلات unilamellar الكبيرة (LUVs) ، والركائز المتموجة لدراسة التفاعل بين التجميع الذاتي للسبتين ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وانحناء الغشاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Septins هي بروتينات مكونة للخيوط الخلوية الهيكلية تتفاعل مع الأغشية الدهنية. Septins موجودة في كل مكان في حقيقيات النوى وضرورية للعديد من الوظائف الخلوية. وقد تم تحديدها على أنها المنظمين الرئيسيين لانقسام الخلايا في الخميرة الناشئة والثدييات 1,2. وهي تشارك في أحداث إعادة تشكيل الغشاء ، وتكوين الأهداب3 ، وتكوين الحيوانات المنوية4. داخل خلايا الثدييات ، يمكن أن تتفاعل السيبتين أيضا مع الأكتين والأنابيب الدقيقة5،6،7 في رابط من Rho GTPases (BORG) بطريقة تعتمدعلى 8. في الأنسجة المختلفة (الخلايا العصبية9 ، الأهداب3 ، الحيوانات المنوية10) ، تم تحديد septins كمنظمات لحواجز الانتشار للمكونات المرتبطة بالغشاء11. كما ثبت أن Septins تنظم تبييض الغشاء وتشكيل البروز12. Septins ، كونها بروتينات متعددة المهام ، متورطة في ظهور العديد من الأمراض السائدة13. ويرتبط سوء تنظيمها بظهور السرطانات14 والأمراض العصبية التنكسية15.

اعتمادا على الكائن الحي ، تتجمع العديد من الوحدات الفرعية septin (اثنان في Caenorhabditis elegans إلى 13 في البشر) لتشكيل مجمعات يختلف تنظيمها بطريقة تعتمد على الأنسجة16. تجمع لبنة بناء السيتين الأساسية من وحدتين إلى أربع وحدات فرعية ، موجودة في نسختين ويتم تجميعها ذاتيا بطريقة باليندرومية تشبه القضيب. في الخميرة الناشئة ، تكون السيبتين أوكتاميك17,18. في الموقع ، غالبا ما يتم توطين السيبتين في مواقع ذات انحناء ميكرومتر. تم العثور عليها في مواقع انقباض الانقسام ، في قاعدة الأهداب والتشعبات ، وفي حلقة الحيوانات المنوية19,20. في الغشاء ، يبدو دور السيبتين مزدوجا: فهي متورطة في إعادة تشكيل الطبقة الثنائية للدهون وفي الحفاظ على سلامة الغشاء21. وبالتالي ، فإن التحقيق في الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتينات المكونة لخيوط السيبتين و / أو الوحدات الفرعية في الغشاء أمر بالغ الأهمية لفهم دورها. لتشريح خصائص محددة من السيبتين في بيئة جيدة التحكم ، من أسفل إلى أعلى في المختبر النهج المناسبة. حتى الآن ، وصفت مجموعات قليلة فقط الخصائص الفيزيائية الحيوية للسبتين في المختبر20،22،23. وبالتالي ، بالمقارنة مع خيوط الهيكل الخلوي الأخرى ، فإن المعرفة الحالية حول سلوك السيبتين في المختبر لا تزال محدودة.

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تحليل تنظيم خيوط السيبتين وإعادة تشكيل الغشاء وحساسية الانحناء19. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدم مزيج من أساليب الفحص البصري والمجهري الإلكتروني (المجهر الفلوري، والمجهر الإلكتروني المبرد [cryo-EM]، والمجهر الإلكتروني الماسح [SEM]). يتم تصور إعادة تشكيل غشاء الحويصلات أحادية الصفيحات العملاقة بحجم ميكرومتر (GUVs) باستخدام المجهر البصري الفلوري. يتم إجراء تحليل الترتيب والبنية الفائقة لخيوط السيتين المرتبطة بحويصلات الدهون باستخدام cryo-EM. يتم إجراء تحليل حساسية انحناء السيبتين باستخدام SEM ، من خلال دراسة سلوك خيوط السيتين المرتبطة بالطبقات الثنائية للدهون المدعومة بالمواد الصلبة المودعة على ركائز متموجة من الانحناءات المتغيرة ، مما يتيح تحليل حساسية الانحناء لكل من الانحناءات الإيجابية والسلبية. بالمقارنة مع التحليل السابق20,24 ، هنا ، نقترح استخدام مجموعة من الطرق لتحليل شامل لكيفية تجميع السيبتين ذاتيا ، وتشوه الغشاء بشكل تآزري ، ويكون حساسا للانحناء. ويعتقد أن هذا البروتوكول مفيد وقابل للتكيف مع أي بروتين خيطي يظهر تقاربا للأغشية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحديد إعادة تشكيل الغشاء باستخدام حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs)

ملاحظة: في هذا القسم ، يتم إنشاء GUVs لتقليد تشوهات الغشاء التي قد تسببها السيبتين في سياق خلوي. في الواقع ، في الخلايا ، غالبا ما توجد السيبتين في مواقع ذات انحناءات ميكرومترية. GUVs لها أحجام تتراوح من عدد قليل إلى عشرات الميكرومترات ويمكن أن تكون مشوهة. وبالتالي فهي مناسبة لفحص أي تشوهات ناجمة عن السبتين على نطاق ميكرومتر. تستخدم الدهون الفلورية ، وكذلك السيبتين المسمى بالفلورسنت (باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) ، لمتابعة سلوك كل من الدهون والبروتينات عبر المجهر الفلوري.

  1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للنمو GUV (50 mM NaCl و 50 mM sucrose و 10 mM Tris [الرقم الهيدروجيني = 7.8]) والمخزن المؤقت للمراقبة (75 mM NaCl و 10 mM Tris [الرقم الهيدروجيني = 7.8]).
    2. قياس (باستخدام مقياس تناضح تجاري) وضبط الأسمولية للمخازن المؤقتة للمراقبة والنمو (170 mOsmol· L-1 ، من الناحية النظرية) عن طريق إضافة كميات صغيرة من كلوريد الصوديوم حتى تصبح الأسمولية الخاصة بها متساوية. قم بتصفية المخازن المؤقتة باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. Aliquot المخزن المؤقت للنمو وتخزينه في -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. قم بتخزين المخزن المؤقت للمراقبة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الفرق في الأسمولية بين كلا المخازن المؤقتة 5٪.
    3. تحضير محلول 5 ملغ·mL-1 β-casein في المخزن المؤقت للمراقبة. تأكد من الذوبان الكامل (بعد عدة ساعات عند 4 درجات مئوية مع التحريك المغناطيسي). قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر ، و aliquot ، وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير مخاليط الدهون في تركيز الدهون الكلي من 3 ملغ · مل - 1 في الكلوروفورم. استخدم تركيبة (مول) من 56.8٪ بيض L-α-فوسفاتيديل كولين (EggPC) ، 15٪ كولسترول ، 10٪ 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ، 10٪ 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) ، 8٪ دماغ L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) ، و 0.2٪ Bodipy-TR-Ceramide لتعزيز تفاعلات البروتين والدهون وتفضيل دمج PI (4,5) P225.
    ملاحظة: تعامل مع الكلوروفورم تحت غطاء الدخان باستخدام قفازات النتريل ونظارات السلامة. محاليل الكلوروفورم الماصة مع المحاقن الزجاجية وتجنب البلاستيك لأن الكلوروفورم يذوب البلاستيك. قبل وبعد الاستخدام ، شطف المحاقن عن طريق سحب الكلوروفورم 5x-10x. استخدم محاقن منفصلة لماصة دهون فلورسنت محددة لمنع التلوث المتبادل. يمكن تخزين الدهون في الكلوروفورم عند -20 درجة مئوية في قارورة زجاجية كهرمانية مغطاة بالتفلون. يجب ملء القوارير بالأرجون قبل إغلاقها وختمها بالبارافيلم لمنع أي أكسدة للدهون.
  3. التكوين الكهربائي للمركبات متعددة الاستخدامات باستخدام إعداد الأسلاك البلاتينية
    ملاحظة: يعرض الشكل 1 مخطط الخطوات التجريبية وصورة للغرفة.
    1. نظف الغرفة وأسلاك البلاتين جيدا على النحو التالي لإزالة أي بقايا دهنية.
    2. اغمس الأسلاك والغرفة في الأسيتون والسونيكات لمدة 10 دقائق. امسحها بعناية باستخدام منديل ورقي باستخدام الأسيتون.
    3. قم بتجميع الغرفة عن طريق إدخال الأسلاك ، واغطس مرة أخرى في الأسيتون ، وسونيكات لمدة 10 دقائق. امسح مرة أخرى باستخدام الأسيتون ، مع التأكد من تنظيف الأسلاك بالكامل. اغمس الغرفة في الإيثانول ، سونيكات لمدة 10 دقائق ، وامسحها بالإيثانول.
    4. أخيرا ، اغمس الغرفة في ماء منزوع الأيونات ، وسونيكات لمدة 10 دقائق ، وجففها بتيار من النيتروجين أو الهواء.
      ملاحظة: تم تصميم غرفة تفلون (الشكل 1B) حسب الطلب في ورشة العمل الداخلية. تستوعب ثلاث مقصورات يمكن إغلاقها على كلا الجانبين باستخدام أغطية زجاجية. يمكن إدخال أسلاك البلاتين في الغرفة من خلال ثقوب قطرها 1.3 مم.
    5. بعد تنظيف الغرفة ، قم بإيداع 3-4 قطرات لكل حجرة (كل قطرة حوالي 0.1 ميكرولتر)) من خليط الدهون 3 mg ·mL-1 على كل سلك بلاتيني. أدر الأسلاك بمقدار 180 درجة وقم بإيداع 3-4 قطرات دهنية لكل حجرة على الجانب الآخر من كل سلك بلاتيني. تأكد من أن القطرات لا تتصل ببعضها البعض. مطلوب حوالي 5 ميكرولتر من خليط الدهون لكل غرفة كاملة.
    6. ضع غرفة النمو في غرفة فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة أي أثر للكلوروفورم.
      ملاحظة: الفراغ العميق (0.1 مللي بار) هو الأفضل. عند تجفيفها ، تكون الدهون عرضة للأكسدة ، وبالتالي ، لا ينبغي تركها في الهواء لأكثر من بضع دقائق.
    7. قم بإيداع الشحوم عالية التفريغ في الجزء السفلي من الغرفة (الجانب الأقرب إلى الأسلاك) على طول محيط المقصورات الثلاث باستخدام حقنة واضغط على غطاء نظيف (22 مم × 40 مم) ضد الشحوم لضمان الختم المثالي. قم بإغلاق طرفي الغرفة (أي في مواقع الدخول / الخروج من الأسلاك) باستخدام عجينة مانعة للتسرب (ألواح الشمع). وبالمثل ، ضع شحوم الفراغ على الجانب الآخر من الغرفة.
    8. املأ المقصورات بمخزن مؤقت للنمو (~ 1 مل لكل غرفة) باستخدام ماصة. لا تحرك المحلول بسرعة كبيرة أو بقوة لمنع أي انفصال للفيلم الدهني عن الأسلاك. أغلق الجزء العلوي من الغرفة بإحكام باستخدام غطاء 22 مم × 40 مم عن طريق الضغط عليه على الشحوم. لتجنب تكوين فقاعات الهواء ، اضغط برفق على الغطاء الزجاجي من الوسط إلى الحواف.
      1. ضع الغرفة في ثلاجة 4 درجات مئوية وقم بتوصيل الأسلاك بمولد وظيفة الموجة (وظيفة جيب الزاوية عند 500 هرتز). قم بتعيين جهد فعال قدره 350 مللي فولت لفترة نمو أقصر (أي 6 ساعات) أو 250 مللي فولت لفترة نمو أطول (أي 12-16 ساعة) ، كما سبق عرضه وتحسينه في دراسة أجراها Beber et al.25.
    9. قم بإزالة الأغطية ، وامسح مانع التسرب والشحوم ، وقم بإزالة الأسلاك. اغسل الغرفة وافركها بمنديل ورقي باستخدام الماء والإيثانول (≥70٪) بالتناوب.
      ملاحظة: يعتمد الجهد الأمثل ومقياس الوقت لنمو GUV على العديد من المعلمات ، من تركيز الملح العازل إلى هندسة الغرفة (أي المسافة بين الأسلاك وحجم الغرفة). استخدم نفس الغرفة في كل مرة يتم فيها تكرار التجربة لضمان قابلية التكرار. الأسلاك قريبة من الجزء السفلي من الغرفة بحيث يمكن تصوير الدهون باستخدام المجهر الفلوري. قم بتصوير الدهون في كل خطوة (انظر الشكل 1C ، D) للتأكد من نجاح عملية التكوين الكهربائي.
  4. حضانة سيبين مع الحويصلات
    1. اجمع GUVs من الأسلاك باستخدام أطراف ماصة مقطوعة مسبقا (فتحة ~ 1 مم) يتم إحضارها بالقرب من الأسلاك. ثم ، ماصة الحل على طول السلك. يمنع هذا الإجراء توليد تدفقات صفائحية قوية يمكن أن تعطل GUVs. باتباع هذه الخطوة ، لم تعد هناك حاجة إلى قطع أطراف الماصة. في الواقع ، لا تضر التدفقات الصفائحية ب GUVs في الحل.
      ملاحظة: نظرا لوجود PI (4,5) P 2 في خليط الدهون ، يجب تخزين GUVs التي تم جمعها لمدة لا تزيد عن2-3 ساعات قبل التجربة. في الواقع ، يتم إذابة PI (4,5) P2 بسرعة ولم يعد السيبتين مرتبطا بالأغشية بعد ساعات قليلة من تكوينها. ومع ذلك ، بمجرد ربط السيبتين بالغشاء ، فإنها تظل مرتبطة لبضعة أيام.
    2. تمييع محلول مخزون السيبتين في Tris 10 mM (الرقم الهيدروجيني 8) حصريا للوصول إلى أسمولية مساوية لتلك الموجودة في مخزن النمو المؤقت ؛ إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف محلول septin أكثر في المخزن المؤقت للمراقبة. أضف الحجم المقصود من الكائنات الحرجية العالمية المجمعة (50-100 ميكرولتر لحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر). قم بإجراء الحضانة مباشرة في غرفة المراقبة بعد التخميل باستخدام β-الكازين (انظر أدناه). مطلوب 20-30 دقيقة من وقت الانتظار للوصول إلى التوازن.
      ملاحظة: يرد وصف مستفيض للتعبير عن مجمعات ثماني الأخطبوط (الخمائر البشرية أو الناشئة) وتنقيتها، في مواد أخرى17. باختصار ، تم التعبير عن السيبتين في الإشريكية القولونية ، وتم تنقيتها في المختبر باستخدام خطوات التقارب ، واستبعاد الحجم ، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية في محلول مائي من 50 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8) ، و 300 mM KCl ، و 5 mM MgCl2 عند تركيز ~ 1 mg ·mL-1 (3 μM). يستخدم تركيز الملح العالي لتجنب تراكم السيبتين. لا ينبغي تركيز مجمعات Septin من خلال جهاز الطرد المركزي بالمرشح ، مما يحفز التجميع وبالتالي يقلل من إنتاج البروتين.
  5. التصوير باستخدام مجهر القرص البؤري و / أو الدوار
    1. لمنع GUVs من الالتصاق بالسطح و / أو الانفجار ، قم بتخميل غرفة المراقبة عن طريق احتضانها بمحلول 5 mg ·mL-1 β-casein لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بإزالة محلول β-الكازين ونقل محلول septin-GUV (الخطوة 1.4.2) إلى غرفة المراقبة باستخدام ماصة. دع رواسب GUVs في قاع الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: يؤدي تباين التركيب بين الجزء الداخلي من GUV والمخزن المؤقت الخارجي إلى عدم تطابق الكثافة ومعامل الانكسار. ونظرا لعدم تطابق معامل الانكسار، تكون المركبات متعددة الاستخدامات مرئية باستخدام المجهر الضوئي الضوئي للإرسال.
    3. باستخدام المجهر البؤري ، تصور إشارة الفلورسنت للدهون للتحقق من جودة GUVs وحالة الصفيحة الغشائية. تقييم كثافة السيبتين المرتبطة بالمركبات متعددة الاستخدامات عن طريق تسجيل إشارة الفلورسنت الخاصة بالسبتين بعد إجراء معايرة مناسبة25. إجراء عمليات الاستحواذ على Z-stack عند الفاصل المكاني 0.4 ميكرومتر لتحليل وتصور تشوهات 3D للحويصلات الناجمة عن التفاعل بين السيبتين والغشاء.
      ملاحظة: تم استخدام أهداف غمر الزيت مع تكبيرات 60 أو 100 ضعف. تم استخدام مجاهر القرص البؤري أو الدوار القياسية (جدول المواد) بأحجام بكسل تبلغ 250 نانومتر و 110 نانومتر ، على التوالي. يجب على المرء تكييف ظروف التصوير مع قطعة معينة من المعدات. لم تتم إضافة أي عوامل تبييض محددة مضادة للصور إلى الحل.

figure-protocol-1
الشكل 1: التكوين الكهربائي ل GUVs. (أ) التمثيل التخطيطي لعملية التكوين الكهربائي باستخدام أسلاك البلاتين. (ب) صورة لجهاز تفلون محلي الصنع تم تجميعه بأسلاك بلاتينية تستخدم لتوليد مركبات الدفع الرباعي عن طريق التكوين الكهربائي. يبلغ قطر الأسلاك 0.5 مم و 3 مم متباعدة. (ج) الكائنات الجوفية (الأجسام الكروية) التي لوحظت بواسطة المجهر الضوئي الناقل أثناء عملية النمو. المنطقة غير الشفافة في أسفل الصورة هي السلك البلاتيني. (د) GUVs (الأجسام الفلورية المستديرة) التي لوحظت باستخدام المجهر الفلوري أثناء النمو على سلك البلاتين. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحليل التنظيم فوق الهيكلي لخيوط السيتين بواسطة المجهر الإلكتروني المبرد

ملاحظة: الحويصلات ليست مناسبة للتصوير باستخدام طرق الفحص المجهري الإلكتروني القياسية. في الواقع ، يتم تجفيف العينات باستخدام طرق البقع السلبية القياسية. عند الجفاف ، من المرجح أن تخضع الحويصلات لتشوهات غير محددة ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى نتوءات الدهون. وبالتالي فإن المجهر الإلكتروني المبرد هو استراتيجية أفضل بكثير لمراقبة تشوهات محددة في الحويصلات. باستخدام cryo-EM ، يتم تضمين العينات داخل طبقة رقيقة (~ 100-200 نانومتر) من الجليد المزجج ، والتي تحافظ على العينات بالقرب من الحالة الأصلية. ومع ذلك ، فإن GUVs كبيرة جدا (عدة عشرات من الميكرومترات) بحيث لا يمكن تضمينها داخل الجليد الرقيق وبالتالي تصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل. وبالتالي ، يتم إنشاء حويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة (LUVs) ، التي تتراوح أقطارها من ~ 50-500 نانومتر ، لتحديد كيف يمكن للسبتين أن تشوه الحويصلات وكيف ترتب على الحويصلات.

  1. توليد حويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة (LUVs)
    1. تحضير 50 ميكروغرام من مزيج الدهون المذاب في الكلوروفورم مع تكوين مولي من 57 ٪ EggPC ، 15 ٪ الكوليسترول ، 10 ٪ DOPE ، 10 ٪ DOPS ، و 8 ٪ الدماغ PI (4,5) P2) ، والذي تم تحسينه لتعزيز تفاعل septin مع الغشاء في قارورة زجاجية.
    2. جفف المحلول تحت تدفق الأرجون لتوليد فيلم دهني مجفف في القارورة. ضع القارورة تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة لتجفيف الدهون تماما.
    3. إعادة إذابة فيلم الدهون في 50 ميكرولتر من المحلول المائي (50 mM Tris-HCl [الرقم الهيدروجيني 8] ؛ 50 mM KCl ؛ 2 mM MgCl2) للحصول على تركيز نهائي من 1 mg ·mL-1 ، دوامة لمدة 10 ثانية ، ونقل المحلول إلى أنبوب.
      ملاحظة: يجب استخدام LUVs في وقت واحد للحضانة مع septins. خلاف ذلك ، سيكون التفاعل بين البروتين والدهون ضعيفا بسبب ذوبان PI (4,5) P2. تولد عملية إعادة الذوبان الخام هذه مجموعة غير متجانسة من الحويصلات بأقطار تتراوح من 50 نانومتر إلى 500 نانومتر. وبالتالي ، يتم فحص مجموعة كاملة من الأقطار وبالتالي الانحناءات في وقت واحد.
  2. احتضان السيبتين مع الدهون المذابة في تركيزات الدهون النهائية والسيبتين من 0.1 ملغ · مللي لتر - 1 (حوالي 300 نانومتر) و 20 نانومتر ، على التوالي ، في مخزن مؤقت عالي الملح (50 مللي متر تريس هيدروكلورايد [الرقم الهيدروجيني 8] ، 300 مللي متر KCl ، 2 مللي متر MgCl2). احتضان العينة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تجميد الغطس لتزجيج العينة
    1. شبكات الكربون هولي التفريغ المتوهج (300 شبكة) على جانب الكربون لمدة 30 ثانية عند 5 مللي أمبير باستخدام معدات مولد البلازما وإدخال الشبكة داخل آلة تجميد الغطس في بيئة رطبة.
    2. Adsorb 4 ميكرولتر من العينة (الخطوة 2.2) على جانب الكربون المفرغ من التوهج من الشبكة. مباشرة قبل امتزاز العينة، أضف حبات ذهبية 5-10 نانومتر إلى المحلول، في حالة استخدام العينات لإنشاء سلسلة مائلة عن طريق التصوير المقطعي بالتبريد.
      ملاحظة: يجب فحص كثافة حبات الذهب وتعديلها تجريبيا وتعتمد على المزود. الكثافة المحسنة هي 10-15 حبة ذهبية في مجال الرؤية.
    3. قم بتجفيف العينات من الجانب العاري لشفط قطرة العينة على الجانب الآخر.
      ملاحظة: عادة ما يكون وقت النشاف 4 ثوان ، ويتم ضبط موضع ورق الترشيح وقوة النشاف تجريبيا عن طريق اختبار وفحص المواضع البديلة لورق الترشيح لتحسين جودة الجليد (السماكة) وكثافة المواد.
    4. انقل الشبكات إلى المجهر أو قم بتخزينها في حاوية نيتروجين سائلة.
      ملاحظة: يعد استخدام شبكات الكربون الهولي أمرا ضروريا لاستيعاب التشتت المتعدد في حجم الحويصلات. يؤدي مسح العينة من الجانب الآخر إلى تحسين امتصاص المواد البيولوجية على الشبكة.
  4. التصوير المجهري الإلكتروني المبرد
    1. أدخل الشبكات في مجهر إلكتروني (EM) مجهز لمراقبة EM بالتبريد. قم بفحص الشبكة بأكملها عن طريق إنشاء خريطة للعينة بأكملها عند تكبير منخفض (عادة عند تكبير 120x) لتحديد المناطق التي تعرض جليدا أفضل (أي رقيقة ومزججة جيدا).
    2. لجمع بيانات cryo-EM 2D ، اجمع الصور بحجم بكسل يبلغ حوالي 2 Å لكل بكسل للتحقق من جودة العينة. تأكد من أن كل من خيوط السيتين والطبقة الثنائية الدهنية مرئية.
    3. لجمع بيانات التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون، حدد مجالات الاهتمام التي تعرض الحويصلات المشوهة. تأكد من وجود ما يكفي من الخرز الذهبي (10 حبات على الأقل) في مجال الرؤية.
    4. وفقا للبرنامج المستخدم لجمع بيانات السلسلة المائلة ، حدد مواقع التركيز البؤري والتتبع لتكون بعيدة بما فيه الكفاية عن مجال الاهتمام. اجمع السلاسل المائلة عن طريق تغيير زاوية الإمالة من -60 درجة إلى +60 درجة، وجمع صورة كل 2 درجة -3 درجات.
      ملاحظة: يجب أن تكون الجرعة الإجمالية حوالي أو أقل من 100 إلكترون / Å2. يتراوح حجم البكسل من 1.3 Å إلى 2.1 Å ، اعتمادا على المجهر المستخدم لجمع البيانات. من الناحية المثالية ، يفضل وجود مخطط متماثل زاوي لجمع البيانات على النحو التالي: 0 ° ، -3 ° ، +3 ° ، -6 ° ، +6 ° ، -9 ° ، +9 ° [...] -60 ° ، +60 °. ومع ذلك ، فإن مقاييس goniometers لمجاهر الدخول الجانبي لا توفر استقرارا ميكانيكيا كافيا لتحقيق تلك المخططات المتماثلة. بدلا من ذلك ، يمكن بدء الاستحواذ عند 0 درجة إلى 34 درجة ، يليه تسلسل زاوي ثان من -2 درجة إلى -60 درجة ، وينتهي بتسلسل نهائي من 36 درجة إلى 60 درجة. والغرض من ذلك هو جمع الصور الأولى (مع أدنى الأضرار الإشعاعية) في أدنى الزوايا. علاوة على ذلك ، لتصور البنية الفائقة للحويصلات وخيوط السيتين المرتبطة ، يمكن استخدام مجهر cryo-EM قياسي (200 كيلو فولت ، خيوط سداسي اللانثانوم (LaB6) ، ودخول جانبي للعينة). ومع ذلك ، إذا كان المرء يهدف إلى متابعة المزيد من معالجة الصور (متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، على سبيل المثال) ، فمن الأفضل استخدام الجيل الأخير من مجاهر مسدس الانبعاثات الميدانية (FEG) المجهزة بأجهزة كشف مباشرة. في هذا البروتوكول ، نقصر وصفنا على الحصول على عمليات إعادة بناء 3D ونترك متوسط التصوير المقطعي الفرعي.
  5. إعادة بناء 3D من التصوير المقطعي بالتبريد والتقسيم
    1. استخدم مجموعة برامج IMOD (جدول المواد) لمحاذاة صور السلسلة المائلة وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد26,27. داخل IMOD ، قم بإجراء محاذاة سلسلة الإمالة استنادا إلى تحديد المواقع الائتمانية (الخرز الذهبي). بالإضافة إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، قم بإجراء تحديد وظيفة نقل التباين (CTF) وتصحيحها داخل IMOD26. أخيرا ، حقق إعادة الإعمار 3D مع IMOD ، بعد كل خطوة بدقة.
    2. قم بتقسيم الطبقات الثنائية للدهون وخيوط septin يدويا باستخدام 3Dmod27 من مجموعة برامج IMOD ، للعرض.

3. تحليل حساسية انحناء السيبتين باستخدام SEM

ملاحظة: لفهم كيف يمكن أن يكون السيبتين حساسا لانحناءات الميكرومتر، تم استخدام نهج في المختبر لاحتضان مجمعات خيوط السيتين مع طبقات ثنائية الدهون المدعومة بالمواد الصلبة المودعة على أنماط متموجة متموجة على نطاق ميكرومتر.

  1. تصميم نسخة طبق الأصل متموجة من NOA (لاصق بصري نورلاند) من أنماط البولي ديميثيل سيلوكسان المتموجة (PDMS)
    1. استخدم أنماط PDMS المتموجة بسعة 250 نانومتر ودورية جانبية 2 ميكرومتر أو أبعاد أخرى لفحص الانحناءات المناسبة للبروتين محل الاهتمام.
      ملاحظة: يتم تصميم وإنشاء أنماط PDMS المتموجة كما هو موضح في Nania et al.28,29.
    2. في بيئة غرف الأبحاث ، قم بإيداع 5 ميكرولتر من NOA السائل على غطاء زجاجي دائري قطره 1 سم ووضع قالب PDMS على القطرة. تعامل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (320 نانومتر) لمدة 5 دقائق لبلمرة السائل NOA في فيلم بوليمر رقيق. ثم ، قشر بلطف قالب PDMS من الغطاء باستخدام NOA المبلمر الطازج.
      ملاحظة: NOA هو غراء شفاف بصريا شائع مناسب للتصوير المجهري البصري. بالإضافة إلى ذلك ، فإن NOA مقاومة لعمليات التثبيت والتلطيخ الكيميائية التي تتم قبل تصوير SEM. يمكن استخدام كل من راتنجات NOA 71 و NOA 81 مع نتائج مماثلة. يمكن استخدام نمط PDMS الأولي عدة مرات لإنتاج نسخ طبق الأصل من NOA. يمكن الاحتفاظ بالنسخ المتماثلة NOA التي تم الحصول عليها في صندوق في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  2. توليد طبقة ثنائية الطبقة من الدهون وحضانة البروتين المدعومة
    1. عالج أفلام NOA باستخدام منظف بلازما الهواء لمدة 5 دقائق لجعل السطح محب للماء.
    2. قم بإعداد محلول من حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة (SUVs) بتركيبة مولية من 57٪ EggPC و 15٪ كولسترول و 10٪ DOPE و 10٪ DOPS و 8٪ PI (4,5) P2 في الدماغ بتركيز إجمالي للدهون يبلغ 1 مجم·mL-1. قم بإعداد سيارات الدفع الرباعي عن طريق تعليق فيلم دهني مجفف في مخزن المراقبة المؤقت ، كما هو موضح في الخطوة 2.1.3. قم بسونيك المحلول بلطف باستخدام سونيكتور الحمام لمدة 5-10 دقائق حتى يصبح المحلول شفافا.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول سيارات الدفع الرباعي مجمدة لعدة أسابيع عند -20 درجة مئوية.
    3. أدخل الأغطية التي تدعم أنماط NOA داخل آبار صناديق زراعة الخلايا. قم بإيداع 100 ميكرولتر من محلول SUV 1 mg·mL-1 على أنماط NOA المفرغة حديثا (الخطوة 3.2.1) واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحفز هذه الخطوة اندماج سيارات الدفع الرباعي مع سطح نمط NOA لتوليد طبقة ثنائية الدهون مدعومة.
    4. اشطف الشرائح جيدا 6x باستخدام المخزن المؤقت septin (50 mM Tris-HCl [pH 8] ، 50 mM KCl ، 2 mM MgCl2) لإزالة سيارات الدفع الرباعي غير المنصهرة. بعد كل شطف ، لا تدع العينة تجف تماما.
    5. قم بتخفيف محلول مخزون السيبتين الثماني في مخزن مؤقت عالي الملح للسبتين (50 ملليمتر Tris-HCl [الرقم الهيدروجيني 8] ، 300 mM KCl ، 2 mM MgCl 2) باستخدام مخزن مؤقت للسبتين (50 mM Tris-HCl [pH 8] ، 50 mM KCl ، 2 mM MgCl2) إلى تركيزات نهائية تتراوح من 10 نانومتر إلى 100 نانومتر ، وأحجام 1 مل. احتضان محلول البروتين على الشرائح لمدة ~ 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: حجم كبير بما فيه الكفاية بحيث لا يكون التبخر مشكلة.
  3. إعداد عينة لتحليل SEM
    ملاحظة: تم تطوير بروتوكولات مختلفة في المجهر الإلكتروني لتحليل هياكل البروتين وتجميعها. يحافظ البروتوكول الحالي على تنظيم خيوط السيتين ، باستخدام بروتوكول تثبيت مشتق من Svitkina et al.30 التي هي سهلة التنفيذ. إلى جانب ذلك ، يعمل هذا البروتوكول على تحسين ملاحظات SEM عالية الدقة.
    1. إعداد الكواشف وحلول المخزون
      ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول العديد من الكواشف والحلول التي يمكن إعدادها مسبقا أو قبل الحضانة مباشرة. اتبع التعليمات المقدمة لتجنب أي قطع أثرية أو نقص التفاعل الكيميائي.
      1. كاكوديلات الصوديوم 0.2 M محلول المخزون: لإعداد هذا المحلول مزدوج القوة ، قم بإذابة 2.14 جم من مسحوق كاكوديلات الصوديوم في ~ 40 مل من الماء المقطر تحت التحريك المغناطيسي. بعد الذوبان الكامل ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 عن طريق إضافة 0.1 M HCl بلطف (~ 1 مل ل 50 مل من المحلول) وقم بتكوين الحجم النهائي بالماء المقطر. يمكن تخزين هذا الحل لمدة 24-48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      2. 2٪ غلوتارالدهيد (GA) في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم (محلول مثبت): قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام عن طريق تخفيف GA عالي النقاء من الدرجة EM باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.2 M (انظر أعلاه). استخدم حل مخزون GA التجاري بنسبة 25٪ -50٪ بسبب سعته التخزينية المحسنة عند 4 درجات مئوية. لإعداد 10 مل من المحلول المثبت ، قم بتخفيف 0.8 مل من محلول GA التجاري بنسبة 25٪ مع 4.2 مل من الماء المقطر و 5 مل من كاكوديلات الصوديوم 0.2 م.
      3. 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO 4) في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم: قم بإعداد هذا المحلول المثبت الثاني قبل الاستخدام مباشرة عن طريق تخفيف محلول مخزون OsO4 التجاري بنسبة4 ٪ مع 0.2 M كاكوديليات الصوديوم (انظر أعلاه). بالنسبة ل 4 مل من محلول تثبيت OsO4 ، قم بتخفيف 1 مل من محلول OsO 4 التجاري بنسبة4 ٪ مع 1 مل من الماء المقطر و 2 مل من كاكوديلات الصوديوم 0.2 م.
        ملاحظة: استخدم حل مخزون OsO 4 التجاري بنسبة4 ٪ في المصابيح الزجاجية القابلة للانقسام بسبب خصائص التخزين والمناولة. لاحظ أن OsO4 شديد التفاعل. تأكد من أن لونه أصفر قليلا وليس داكنا.
      4. 1٪ حمض التانيك (TA) في الماء: تحضير هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام. تحضير محلول TA للحصول على تركيز نهائي من 1٪ TA في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. يذوب 10 ملغ في 1 مل من الماء المقطر والدوامة لبضع دقائق. لا يمكن تخزين حل TA ويجب تصفيته باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام.
      5. 1٪ محلول أسيتات اليورانيل (UA) في الماء تحضير محلول UA للحصول على تركيز نهائي بنسبة 1٪ UA في الماء المقطر. قم بإذابة 10 ملغ في 1 مل من الماء المقطر والدوامة لمدة 30 دقيقة على الأقل إلى 1 ساعة عن طريق الدوامة أو الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين هذا الحل لمدة شهر واحد عند 4 درجات مئوية ولكن يمكن أن يترسب بسهولة ، وبالتالي يجب تصفيته بمرشح 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام.
      6. سلسلة متدرجة من حلول الإيثانول إعداد 50٪ ، 70٪ ، 95٪ ، و 100٪ حلول الإيثانول في الماء. قم بإعداد الحمام النهائي من زجاجات مفتوحة حديثا من الإيثانول بنسبة 100٪ أو من الإيثانول بنسبة 100٪ الذي تم تجفيفه لمدة 24 ساعة على الأقل باستخدام المناخل الجزيئية (قطر المسام الاسمي = 4 Å) لإزالة جميع آثار الماء التي قد تتداخل مع التجفيف والطلاء من العينات. احرص على عدم هز هذا المحلول لأنه قد يتسبب في إعادة تعليق جزيئات السيليكات.
        ملاحظة: كن حذرا عند التعامل مع الكواشف الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول. الجلوتارالدهيد ، رابع أكسيد الأوزميوم ، كاكوديلات الصوديوم ، وخلات اليورانيل كلها شديدة السمية ، وخلات اليورانيل مشعة أيضا. يجب أن يتم جميع عمليات التلاعب بالكواشف ونفاياتها باستخدام الأفراد (القفازات ، معاطف المختبر ، نظارات السلامة) والحماية الجماعية (أغطية الدخان والدروع الزجاجية الشبكية) ، وفقا للإجراءات الخاصة بالمختبر.
    2. تثبيت العينة
      1. اغسل العينات (أي شرائح NOA ذات الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة المنصهرة والبروتين المحتضن) باستخدام PBS. استبدل PBS بمحلول تثبيت GA الذي تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة. يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند 4 درجات مئوية.
      2. قم بإزالة المحلول المثبت واغسل العينات الثابتة 3x باستخدام 0.1 M كاكوديلات الصوديوم (5 دقائق لكل غسل) مع اهتزاز لطيف.
      3. احتضان العينات في محلول تثبيت OsO4 لمدة 10 دقائق مع أقصى قدر من الحماية من الضوء للسماح بتثبيت الهياكل الغشائية وزيادة الموصلية الكهربائية للعينات. قم بإزالة المحلول المثبت واغسل العينات 3 أضعاف في الماء المقطر (5 دقائق لكل غسل) مع اهتزاز لطيف.
      4. احتضان العينات المغسولة في محلول تثبيت TA المصفى لمدة أقصاها 10 دقائق. قم بإزالة محلول TA واغسل العينات 3x في الماء المقطر (5 دقائق لكل غسل) مع اهتزاز لطيف.
      5. احتضن العينات المغسولة في محلول مثبت UA تمت تصفيته حديثا لمدة 10 دقائق مع أقصى قدر من الحماية من الضوء. قم بإزالة محلول UA واغسل العينات 3x في الماء المقطر (5 دقائق لكل غسل) مع اهتزاز لطيف.
    3. جفاف العينة وتجفيف النقاط الحرجة
      ملاحظة: لا يسمح بالتجفيف بالهواء لتجنب إتلاف العينات من خلال التوترات السطحية غير المرغوب فيها عند التغيير من الحالة السائلة إلى الحالة الغازية. تم إنشاء طريقتين في EM: الطريقة الفيزيائية للوصول إلى الحالة فوق الحرجة ل CO2 وتجاوز نقطته الحرجة (31 درجة مئوية ، 74 بار) ، أو الطريقة الكيميائية لتبخير سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS) ، وهو عامل تجفيف مع انخفاض التوتر السطحي. CO2 و HMDS غير قابلين للامتزاج بالماء بشكل سيئ. وبالتالي ، يجب استبدال جميع آثار الماء بمذيب انتقالي (الإيثانول) لتجنب أي ضرر في وقت لاحق أثناء عمليات التجفيف.
      1. احتضان العينات لمدة 2-3 دقائق في كل محلول إيثانول ، بدءا من 50٪ إلى 100٪ (اللامائي) حمام الإيثانول.
        ملاحظة: نظرا لأن تبخر الإيثانول بين الحمامات سريع ، يجب أن يكون التعامل مع العينات سريعا أيضا لتجنب أي تجفيف للهواء.
      2. انقل الشرائح الزجاجية داخل مجفف النقطة الحرجة المليء مسبقا بالإيثانول واتبع تعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام جهاز تلقائي، ولكن يمكن استخدام أي نظام. قد تختلف البروتوكولات لكل جهاز ولكن يجب تحسينها لإزالة الإيثانول تماما (25 حماما في هذا البروتوكول) وتقليل سرعات عمليات تبادل المذيبات المختلفة (مداخل CO 2 ومنافذ الإيثانول / CO2) وإزالة الضغط النهائي (حوالي 1 ساعة في هذا البروتوكول).
      3. في نهاية تجفيف النقطة الحرجة ، قم بتخزين العينات على الفور في مجفف حتى يتم تركيبها وطلائها. نظرا لأن العينات المجففة استرطابية للغاية ، فقم بتغطيتها (انظر أدناه) في أقرب وقت ممكن.
        ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أن تقدم HMDS طريقة أرخص وأسرع. على الرغم من أن HDMS لم يتم اختباره أبدا على عيناتنا ، إلا أن هذا النهج أنتج نتائج جيدة لمراقبة البروتينات في الوجه الداخلي للأغشية الخلوية31,32.
    4. تركيب عينة والطلاء.
      ملاحظة: نظرا لأن العينات البيولوجية تقدم خصائص توصيل كهربائي ضعيفة ، فيجب طلاؤها بفيلم معدني موصل قبل مراقبة SEM. وهكذا يتم استخدام البلازما المغنطرون المتلعثمة.
      1. قم بإرفاق الغطاء بالكعب الذي سيتم استخدامه لملاحظات SEM المستقبلية. استخدم الطلاء الفضي بسبب الموصلية الكهربائية المحسنة ، مقارنة بأقراص الكربون. أضف شريطا من الطلاء الفضي إلى الوجه العلوي للغطاء وتأكد من أن الاتصال بالكعب مرض. تجنب أي تكتلات الطلاء.
        ملاحظة: يجب أن يكون شريط الطلاء الفضي رفيعا لتجنب أي ملامسة بين العينة والعدسة الموضوعية ل SEM عند العمل بدقة عالية (أي مسافة عمل منخفضة).
      2. انتظر حتى يتبخر المذيب تماما.
        ملاحظة: قد تختلف مدة هذه الخطوة اعتمادا على كمية وسمك رواسب الطلاء الفضي. يمكن تقصير هذه الخطوة باستخدام جرة جرس أو معطف وفراغ أساسي لمدة 10-30 دقيقة.
      3. استخدم جهازا مجهزا برأس بلازما مغناطيسي متقطع ومرحلة كوكبية دوارة ، واتبع البروتوكولات القياسية التي تقدمها الشركة المصنعة. هنا ، تم إخلاء الجهاز إلى 2.5 × 10-5 مللي بار ، وتطهير 1x بأرجون عالي الجودة ، ثم تعديله إلى 8.0 × 10-3 مللي بار.
      4. قم بإجراء الرش المسبق (120 مللي أمبير لمدة 60 ثانية) لإزالة طبقة الأكسيد على السطح. ثم ، قم بإيداع 1.5 نانومتر من التنغستن (90 مللي أمبير ، مسافة العمل = 50 مم) بمساعدة شاشة سمك الفيلم.
        ملاحظة: يجب تنظيف المعطف تماما لضمان تكرار تبخر الفيلم. يجب إيقاف الطلاء بمجرد الوصول إلى السماكة المستهدفة. يتم حساب سمك الفيلم النهائي وتصحيحه بعد ذلك. الأفلام التي تبلغ حوالي 1.5 نانومتر لديها ، في المتوسط ، تصحيح لاحق قدره 0.7 نانومتر باستخدام جهازنا. نظرا لأن قيم التصحيح هذه قريبة من الهدف ، يتم تنفيذ سلسلة من الطلاءات لتقييم ثم طرح هذا التصحيح من القيمة المستهدفة.
      5. قم بتخزين العينات تحت الفراغ لحمايتها من الهواء المحيط حتى وطوال جميع تحليلات SEM.
        ملاحظة: طبيعة المعدن المستخدم في مسائل التناثر. Pt ، على الرغم من كونه مادة شائعة ، ينتج عنه طلاء رديء الجودة بسماكة فيلم Pt تتكيف مع خيوط septin (1.5 نانومتر). في الدقة العالية ، يفتقر فيلم Pt 1.5 نانومتر إلى التماسك ؛ وهكذا يصبح حجم مجموعات Pt وخيوط السيتين متشابهين، مما يؤدي إلى سوء تفسير أثناء عملية تجزئة الخيوط33 (انظر الشكل 2A، الجزء الداخلي). التنغستن هو بديل جيد ل Pt لأنه يعرض حجم حبوب أصغر ، بالكاد مرئي في SEM عالي الدقة (انظر الشكل 2B ، مضمن). ومع ذلك ، فإن التنغستن النقي يتأكسد بسهولة ، مما يؤدي إلى قطع أثرية قوية لتأثير الشحن أثناء مراقبة SEM إذا كان الإجراء المفصل في الخطوة 3.3.4. لا يتم اتباعها بدقة.
  4. احصل على الصور باستخدام مجهر SEM (FESEM) للانبعاثات الميدانية.
    ملاحظة: تمت ترقية تقنيات SEM مؤخرا لتحسين الدقة ، وتعتمد التقنيات على الشركة المصنعة (على سبيل المثال ، البصريات الإلكترونية ، تباطؤ الحزم ، العدسة المغناطيسية). هذا الكسب في الدقة (يمكن الوصول إليه من قبل العديد من الشركات المصنعة) ، خاصة عند الجهد المتسارع المنخفض (بالقرب من النانومتر عند 1 كيلو فولت) ، ضروري لحل الهياكل النانومترية المشابهة لشبكات septin.
    1. احصل على تصوير عالي الدقة من خلال الكشف عن الإلكترونات الثانوية الأولية (SE1) باستخدام كاشف "داخل العدسة" باستخدام الإعدادات التالية.
    2. اضبط الجهد المتسارع على 3 كيلو فولت. قم بإصلاح تيار الشعاع باستخدام فتحة 20 ميكرومتر (لأعمدة Zeiss Gemini I ، أو ما يعادل 34 pA) أو بفتحة 15 ميكرومتر (لأعمدة Zeiss Gemini I ، أو ما يعادل 18.5 pA) ، إذا كانت هناك حاجة إلى قمع تأثيرات الشحن.
    3. بالنسبة للملاحظات، استخدم دقة تتراوح من 21.25 نانومتر/بكسل إلى 1.224 نانومتر/بكسل، ولتحليل البيانات، استخدم دقة ~ 5.58 نانومتر/بكسل (تكبير 20000x وفقا لمرجع بولارويد 545).
    4. اضبط مسافة العمل بين 1 مم و 2 مم للمراقبة عالية الدقة ، وحوالي 3 مم إذا كانت هناك حاجة إلى زيادة عمق المجال. اضبط سرعة المسح الضوئي وتكامل الخط باستمرار لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء ثابتة مع وقت اكتساب يتراوح بين 30 و45 ثانية لكل صورة.

figure-protocol-2
الشكل 2: تأثير المواد المودعة على خيوط السيتين على أنماط PDMS المتموجة. SEM من خيوط السيتين المغلفة عن طريق التبخير إما مع (A) 1.5 نانومتر من البلاتين ، مما يدل على نمط "التربة المتشققة القاحلة" النموذجي لعدم التماسك بين مجموعات نوى البلاتين ، أو (B) 1.5 نانومتر من التنغستن مغطاة بطبقة ناعمة ومتماسكة. شريط المقياس = 200 نانومتر. تمثل مربعات المربعات البيضاء طرق العرض المكبرة في أسفل اليمين. الكريات الكروية هي حويصلات دهنية صغيرة تتفاعل مع السيبتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشوهات GUVs
يتم عرض صور التألق البؤري النموذجية للمركبات متعددة الاستخدامات التي أعيد تشكيلها بعد احتضانها بالسيبتين في الشكل 3 ، في الظروف التي تتبلمر فيها السيبتين. كانت GUVs العارية (الشكل 3A) كروية تماما. عند الحضانة بأكثر من 50 نانومتر من خيوط الخميرة المهدرة ، بدت الحويصلات مشوهة. حتى تركيز 100 نانومتر من أوكتامات الخميرة الناشئة، بدت الحويصلات ذات أوجه، وظلت التشوهات ثابتة وبالتالي لم تتقلب (الشكل 3 ب). فو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما ذكر أعلاه ، تم استخدام خليط الدهون الذي يعزز دمج PI (4,5) P2 داخل الطبقة الثنائية للدهون وبالتالي يسهل التفاعلات بين غشاء السبعين. في الواقع ، لقد أظهرنا في مكان آخر25 أن سبتين الخميرة الناشئة تتفاعل مع الحويصلات بطريقة PI (4,5) P2 الخاصة. تم تعديل تركيبة الدهون هذه تجريبيا من فحص تركيبات متعددة وتستخدم الآن على نطاق واسع من قبل المؤلفين. يجب التعامل مع دهون PI (4,5) P2 بعناية. يجب أن تكون حلول المخزون مقتبسة بكميات صغيرة بحيث لا يتم فتح قارورة محددة أكثر من مر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر باتريشيا باسيريو ودانيال ليفي على مشورتهما ومناقشاتهما المفيدة. استفاد هذا العمل من دعم الوكالة الوطنية للبحوث لتمويل مشروع "SEPTIME" ، ANR-13-JSV8-0002-01 ، ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 ، ومشروع "SEPTSCORT" ، ANR-20-CE11-0014-01. يتم تمويل B. Chauvin من قبل مدرسة الدكتوراه "ED564: Physique en Ile de France" ومؤسسة البحث العلمي. تم دعم K. Nakazawa من قبل جامعة السوربون (AAP Emergence). تم دعم G.H. Koenderink من قبل Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO / OCW) من خلال "BaSyC-Building a Synthetic Cell". منحة الجاذبية (024.003.019). نشكر مقياس Labex Cell(n) (ANR-11-LABX0038) وباريس للعلوم والآداب (ANR-10-IDEX-0001-02). نشكر تصوير الخلايا والأنسجة (PICT-IBiSA) ، معهد كوري ، عضو البنية التحتية الوطنية الفرنسية للبحوث في فرنسا - التصوير الحيوي (ANR10-INBS-04).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath SonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen ، Thermo Fischer Scientific11504726
المواد الكيميائية: كلوريد الصوديوم ، تريس حمض الهيدروكلوريك ، السكروز ، KCl ، MgCl2 ، ب الكازين ، الكلوروفورم ، كاكوديلات الصوديوم ، حمض التانيك ، الإيثانولسيجما ألدريتش
المجهر متحد البؤرقرص الغزل نيكونأو مجفف النقطة الحرجة
البؤرالدقيقة CPD300
مولد المياه منزوع الأيوناتMilliQF1CA38083BMilliQ تكامل 3
بيضات L- & alpha ؛ - فوسفاتيديل كولينأفانتي القطبية840051
مسدس الانبعاث الميداني SEM (FESEM) كارلزايسالجوزاء SEM500
الجلوتارالديهايد 25٪ ، محلول مائيThermo Fischer العلمي50-262-19
شحوم عالية الفراغ ، برنامج Dow corningVWR
IMODhttps://bio3d.colorado.edu/imod/مجموعة البرمجيات لمحاذاة الصور سلسلة مائلة وإعادة بناء
3D لاسي فورفار / شبكات المجهر الإلكتروني الكربونيEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L- & alpha ؛ -phosphatidylinositol-4،5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
المبخر المعدنيLeica microsystemsEM ACE600
NOA (المواد اللاصقة البصرية Norland) ، NOA 71 و NOA 81منتجات نورلاندNOA71 ، NOA81
أوزميوم رباعي أوكسيد 4٪دلتا المجهري19170
التناضحL & ouml ؛ ser15 M
منظف البلازماAlcatelpascal 2005 SD
مولد البلازماعلم المجهر
معدات التجميدمعدات تجميد لايكا ميكروسيستمزEMGP
نقل المجهر الإلكترونيThermofischerTecnai G2 200 كيلو فولت ، LaB6
أسيتات اليورانيلعلم المجهر الإلكتروني22451هذا المنتج غير متوفر للشراء أي لوحات شمع
أطول ، VitrexVWR
متحد أنظمة Leica الدهون مقياس الإلكتروني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916(2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122(2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850(2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420(2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119(2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349(2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة